Mätning av cytosoliska Ca ^{2 +} I enstaka kontraktila lymphatics

Summary

Vi presenterar en metod för att utvärdera cytosoliska Ca

Abstract

Lymfkärl består av ett multifunktionellt transportsystem som håller vätska homeostas, levererar lipider till den centrala cirkulationen, och fungerar som ett övervakningssystem för potentiellt skadliga antigener, optimera slemhinnor immunitet och adaptiva immunsvaret ^1. Lymfan bildas från interstitiell vätska som kommer in döda slutade initiala lymfkärlen, och sedan transporteras mot en tryckgradient i större samla lymfkärlen. Varje samla lymfatiska består av en serie segment som kallas lymphangions, separerade med bicuspid ventiler som hindrar återflöde. Varje lymphangion besitter en kontraktila cykel som driver lymfan mot en tryckgradient mot de centrala cirkulationen ^2. Detta phasic kontraktila mönster är analogt med hjärt-cykel med systoliskt och diastoliskt faser, och med en lägre kontraktion frekvens ^4. Dessutom genererar lymfatisk tonus i glatt och visar myogenic sammandragning och utvidgning in svar på ökningar och minskningar i luminala tryck, respektive ^5. En hybrid av molekylära mekanismer som stödjer både phasic och tonic kontraktilitet av lymfkärlen är därmed föreslås.

Sammandragning av glatt muskulatur i allmänhet regleras av cytosoliskt Ca ^{2 +} koncentration ([Ca ^{2 +]} _i) plus känslighet för Ca ^{2 +,} av kontraktila element som svar på förändringar i miljön som omger cellen ^6. [Ca ^{2 +]} _i är bestäms av kombinationen av rörelse Ca ^{2 +} genom plasmamembranet ligand eller spänningsstyrda Ca ^{2 +-kanaler} och utsläpp och upptag av Ca ^{2 +} från interna butiker. Cytosoliskt Ca ^{2 +} binder till calmodulin och aktiverar enzymer som myosin lätt kedja (MLC) kinas (MLCK), som i sin tur fosforylerar MLC leder till aktin-myosin-medierad kontraktion ^8. Men känsligheten för denna väg till Ca 9. MLCP verksamhet är reglerad av Rho-kinas (ROCK) och myosin fosfatas hämmare protein KPI-17.

Här presenterar vi en metod för att utvärdera förändringar i ^{[Ca2 +]} _i tiden i isolerade, perfusion lymphatics för att studera ^{Ca2 +-beroende} och Ca ^{2 +-allergiframkallande} mekanismer lymfatisk glatt muskulatur kontraktion. Använda isolerade råtta mesenteriska samla lymfkärlen vi studerade sträck-inducerade förändringar i ^{[Ca2 +]} _i och kontraktila aktiviteten. De isolerade lymfatiska modellen har den fördelen att tryck, flöde och den kemiska sammansättningen av badet lösningen hårt kan kontrolleras. [Ca ^{2 +]} _Jag var fast besluten genom att ladda lymfkärlen med ratiometrisk, ^{Ca2 +-bindande} dye Fura-2. Dessa studier kommer att ge en ny syn på det bredare problemet med att studera olika molekylära mekanismer som reglerar phasicsammandragningar kontra tonic sammandragning i lymfatisk glatt muskulatur.

Protocol

1. Djur

1. Alla förfaranden har godkänts av Institutional Animal Care och använda kommittén vid Louisiana State University Health Sciences Center och utfördes i enlighet med riktlinjerna för National Institute of Health (NIH publikation nr 85-12, reviderad 1996). Man Sprague-Dawley råttor (Charles River Laboratories, 270-350 g kroppen wt) var inrymt i en kontrollerad temperatur (22 ° C) och kontrollerad belysning (00:12 h ljus mörker-cykel) miljö. Efter ankomsten var råttorna in till en veckas acklimatisering period och försågs standard råtta chow (2018 Teklad Global 18% Protein Gnagare Diet, Harlan) och vatten ad lib.

2. Experimentera Set-Up

1. Glas mikropipetter för montering lymfkärlen är gjorda av borsilikatglas med glödlampa OD 1,2 mm, ID 0.69mm (Sutter Instrument BF 120-69-15). Dra pipetter med en flammande / Brun Mikropipett Puller modell P-97 (Sutter InstrumENT) och avfasning med en Micro Grinder EG 400 (Narishige) för att erhålla en avfasad spets med en ~ 60 ìm ytterdiameter.
2. Montera mikropipetter i isolerade fartyget kammare (modell CH-1, Living Systems, Burlington, VT). Den pipetter bör motstånd matchas (samma storlek öppning).
3. Fyll kammaren (5 ml) och mikropipetter med albumin-fysiologisk saltlösning (APSS, se tabell 1). Se till att det inte finns några bubblor i mikropipetter eller slangen.
4. Förbered overhand knop med ögonläkemedel suturer och placera en på varje mikropipetten.

3. Samla lymfatiska Isolering

1. Bedöva djur med en intramuskulär injektion av ketamin / xylazin (90 och 9 mg / kg), med hjälp av en BD spruta (1 ml) och nål (BD intradermalt bevel 26G3 / 8).
2. Spraya buken området med 70% alkohol för att sterilisera, utför en mittlinjen laparotomi och exteriorize och punktskatter tunntarmen och tarmkäx. Placera vävnaden i ICe-kallt APSS. Euthanize djuren med en överdos av ketamin / xylazin och bekräfta död genom att öppna bröstkorgen (enligt American Veterinary Medical Association riktlinjer för dödshjälp).
3. Pin en del av tarmkäxet i en dissektion kammare fylld med iskallt APSS. Försiktigt dissekera en insamling lymfatiska fartyg (8-20 ìm inre diameter och 1-2 mm längd) från omgivande fett och bindväv med hjälp av ett stereomikroskop. Använd dissekera Dumont pincett-INOX 55 (Fine Science Tools # 11.255-20) och dissekera våren sax (Fine Science Tools # 15.000-03). Använd isolerade fartyg med bara en ventil för att säkerställa optimal tryckreglering i hela segmentet under experimentet.
4. Överför isolerade lymfatiska till den isolerade fartyget kammare som innehåller 5 ml APSS. Montera det fartyg till de två motståndet matchade glas mikropipetter genom att binda med oftalmologiska suturer.
5. Överför kammaren till ett inverterat fluorescerande mikroskop (vår är en Nikpå TE-2000 ®) utrustad med en xenonlampa (Sutter Instrument Lambda LS2 300 W), 340/380 filterhjul systemet (Sutter Lambda 10-3 med Chroma Teknik 340 och 380 nm filter excitation), 510 nm dikroiskt sändare (Chroma Teknik D510 / 80m), en känslig CCD-kamera (ljustekniska HQ ²⁾ och programvara för förvärv (Nikon Elements AR) (Figur 1).
6. Fäst slangen som kommer från mikropipetter antingen justerbara reservoarer eller till servo-återkoppling pumpsystem (levande system Instrumentering, Burlington VT), som både kan användas för att ändra tryck och flöde.
7. Anslut kammaren till värmeenheten (levande system) och ställ badet till 37 ° C.
8. Visa det lymfatiska direkt via täckglas i botten av kammaren med en 10X objektiv (Nikon Plan Fluor 10x/0.3, DIC L/N1, ∞ / 0,17, WD 16,0). Snabb time-lapse bild set kan förvärvas med programmet Image Acquisition (vårt system har Nikon Elements AR programvara).

[Ca2 +] _i

1. [Ca ^{2 +]} i i isolerade lymfatiska glatta muskulaturen mäts genom ^{Ca2 +-sensorer} dye Fura 2-acetoximetyl ester (AM) (molekylära sonder, Eugene, OR).
2. Ladda det lymfatiska fartyg med Fura-2 AM av utbyte badet till APSS lösning innehållande Fura-2 AM (2 M) och pluronic syra (0,2% vikt / volymprocent) för 30 minuter vid 37 ° C.
3. Efter 30 minuter ändra badet tillbaka till APSS lösning. Skölj två gånger för att tvätta ur Fura-2 från badet lösningen. Lämna fartyget för en jämviktstiden på minst 20 min före [Ca ^{2 +]} _i mätningar för att möjliggöra återupprättandet av spontana sammandragningar.
4. Samla ratiometrisk Fura-2 mätningar i isolerade lymfkärlen med förvärv protokoll som alternativt tänds vid 340 och 380 nm våglängd för löptider på 50 ms vardera. Den fluorescerande ljus passerar genom ett dikroisk spegel (400 nm, Chroma Technology Corp 400DCLP) och ett brett band utsläpp filter (510 nm, 80 nm, bandbredd, Chroma Technology Corp D510/80m) och förvärvades av ljustekniska HQ ² kamera. Vi samlar in 2 minuter av data på en baslinje intraluminal tryck på 2 cm H ₂ O och under steg ökningar av 2, 4, 6, 8 och 10 cm H ₂ O.
5. Att analysera den genomsnittliga [Ca ^{2 +]} _i, rita en region av intresse (ROI) som omfattar hela lymfatiska fartyget och dess omgivningar så att fartyget är helt spåras under avslappning och sammandragning (figur 2). Om någon mikropipett är i synfältet dessa områden inte bör ingå i ROI. Mindre ROI kan också väljas, men ett potentiellt problem med små ROI är att kärlväggarna kan flyttas en aning i längsgående riktning ut från ROI när fartyget constricts och slappnar av. Ett annat potentiellt problem är att vissa fartyg twist under kontraktion, och dessa lymfkärlen bör inte användas för att studera. The vridande rörelser är oftast undvikas genom att begränsa längden på isolerade lymfatiska <1 mm. Dessutom, ibland segment på båda sidor om en ventil inte tygla / slappna av i synkront. I det här fallet, eftersom dessa segment utgör skilda funktionella lymphangions bör det lymfatiska studeras på bara en sida av ventilen, eller varje lymphangion kan läsas separat med en ROI placerade på vardera sidan. När du använder en 10X mål bör kärlväggarna vistelse i fokus under phasic sammandragningar, men om det finns några delar av väggarna som går ur fokus under värkarna dessa områden inte bör ingå i ROI. En bakgrund ROI används också och bör placeras långt från fartyget (t.ex. i hörnet av bilden). En ökning av 340/380 förhållandet visar på en ökning i ^{[Ca2 +]} _i. Luminala diameter vid olika tidpunkter kan också mätas med hjälp av programvarans mäta funktion eller genom att spåra kärlväggarna över tiden (se avsnitt 6). </ Li>

5. Pressure Control Protocol

1. Att studera trycket oberoende av påbjudna flöde måste samma tryck tillämpas för varje mikropipett med servo-null återkoppling pump. Slangen från varje mikropipett är fäst via en T-kontakt till gemensamma slang monterad på pumpen. Ställ först in intraluminal trycket vid 2 cm H ₂ O för 45-60 min., Vilket är tillräckligt med tid att möjliggöra utveckling av lymfatisk spontana sammandragningar.
2. För studie Använd bara kärl som uppfyller följande kriterier inom jämviktsprocessen perioden: (1) fartyget utvecklas spontant tonen vid 2 cm H ₂ O, (2) fartyget utvecklar regelbunden, spontana sammandragningar som är någorlunda enhetliga i hela fartygets längd . Ofta området nedströms från en ventil constricts mer än resten av fartyget, och dessa fartyg kommer att användas så länge det finns belägg för att resten av fartyget visar kontraktila aktiviteten.
3. Spela den snabba time-lapse bilder under trycket steg. För varje, kommer trycket börjar på 2 cm H ₂ O för 30 s, och då uppkommer i ett steg 2, 4, 6, 8 eller 10 cm H ₂ O för en minut, och sänkt rygg till 2 cm H ₂ O i 30 s.
4. Efter slutförandet av trycket steg serien, ändra badet lösning till en ^{Ca2 +-fria} APSS vid 37 ° C för att mäta den maximala passiva diameter (Max D) och Ca ^{2 +-fluorescens} mätningar på alla ovanstående luminala tryck. Max D används för att beräkna tonen och normalisera data mellan lymfkärlen av olika storlek.

6. Lymfatisk kontraktila Parametrar

1. Ändringar i fartygens diameter över tid kan bestämmas med hjälp av verktyg objektspårning i de flesta programvaror bildanalys paket. Detta kan uppnås genom att endast använda en av de kanaler (vi använder 340 nm kanalen men 380-kanalen kan också användas). En kontrast tröskel appljugit för bildstapel så att kärlväggarna lyfts fram, och sedan ROI omfattar varje vägg dras att spåra dem över tid (Figur 3 A). Den inre diameter kan bestämmas genom att mäta tyngdpunkten på varje vägg och beräkna avståndet mellan de två centroids, minus hälften av tjockleken på varje vägg.
   Ett andra alternativ när det är svårt att spåra varje vägg på grund av en stark signal i luminala området är att mäta ytterdiameter, och använda en korrektionsfaktor baserad på en statisk mätning av kärlväggarna för att få innerdiameter. I det här fallet spänner över ROI hela fartyget och den yttre diameter är spårad (Figur 3 B). Denna metod kan också användas för att bestämma hela visningsbara tvärsnittsarea det lymfatiska (Figur 3 C). På grund av den typiska formen av en lymphangion kan detta senare alternativet ger en bättre uppskattning av den verkliga volymen av vätska pumpas med varje värk än att använda diameter i en vald delav fartyget.
2. Från och med time-lapse studie fastställa följande parametrar lymfatisk luminala diameter mätningar ^4,12,13:
   Kontraktion frekvens (CF), bestäms genom att räkna antalet phasic sammandragningar per minut.
   Avsluta diastoliskt diameter (EDD), som är diametern precis före en phasic kontraktion.
   Avsluta systoliskt diameter (ESD), diametern vid slutet av en phasic kontraktion.
   Amplitud av kontraktion (AMP = EDD-ESD), en förenklad index av slagvolymen.
   Den maximala passiva diameter vid varje tryck (Max D, bestäms i ^{Ca2 +-fria} förhållanden), som kan användas för att bestämma tonen genereras av det lymfatiska glatt muskulatur, och används också för att normalisera data mellan lymfkärlen med olika diameter, eller samma lymfatiska studeras på olika luminala tryck.
   EDD _1, som är EDD samband med första värken efter ett tryck steg. Detta används som en utgångspunkt närbestämma myogenic sammandragning av en lymfatiska fartyg som svar på en steg ökning luminala tryck ^5.
   Myogenic sammandragning av en isolerad lymfatiska efter ett tryck steg representeras av den normaliserade förändringen i EDD efter ett tryck steg ökning = 100 * (EDD - EDD ₁₎ / Max D.
   Ytterligare variabler som kan beräknas men diskuteras på andra håll i detalj ⁴ är:
   Tone = 100 * (Max D - EDD) / Max D, normaliserade AMP = AMP / Max D
   Stroke volymindex (SVI) = π (EDD ² - ESD ²⁾
   Ejektionsfraktion (EF) = SVI / (πEDD2)
   Volymflöde Index (VFI) = CF × SVI.

7. Representativa resultat:

I början av varje phasic sammandragning, det var en övergående ökning av ^{[Ca2 +]} _i (Figur 4). Dessutom efter steg ökade luminala tryck, frekvensen av Ca ^{2 +} transienter och phasic sammandragningar ökat synkront. Dessa observationer liknar en tidigare hitta med hjälp av bröst-kanaler monteras på en tråd myograph ¹⁴ och stödja tidigare data som indikerar en central roll för oscillerande Ca ^{2 +} släpp från interna butiker i den mekanism som ligger bakom phasic kontraktila cykeln ^15.

Vi undersökte också om [Ca ^{2 +]} _i under diastole (mellan Ca ^{2 +} transienter och phasic sammandragningar) är associerad med det lymfatiska tonen och myogenic sammandragning orsakad av stretch då steg ökningar i tryck påförs (Figur 5). Omedelbart efter steg ökade trycket 4 cm H ₂ O och högre, [Ca ^{2 +]} _i under diastole stadigt ökat, jämfört med baslinjen innan trycket steg (Figur 5B). Dessutom, efter den initiala ökningen i diameter på grund av den stegvisa höjningar i tryck (EDD _1), fanns myogenic sammandragning (Figure 5C), definierad som en minskning av DME från EDD ₁ i tidigare rapporter ^5,12. När man jämför den genomsnittliga normaliserade förändringen i EDD mellan de olika trycket steg, det var betydligt fler sammandragning efter en ökning med 8 och 10 cm H ₂ O jämfört med 2 cm H ₂ O (Figur 6 A). Den stadiga ökningen av ^{[Ca2 +]} _Jag var också relaterade till tryck, med steg ökningar på 6, 8 och 10 cm H ₂ O orsakar betydligt högre förändringar i Ca ^{2 +} än 2 cm H ₂ O ( Figur 6 B). Men trycket steg-Ca ^{2 +} relation verkar platå vid dessa påfrestningar också. Dessa resultat tyder på att en ^{Ca2 +-beroende} mekanism är associerat med lymfatiska myogenic sammandragning som svar på stretch. Men platån i trycket ^{steg-Ca2 +} relation föreslår en mekanism som ökar ^{Ca2 +} känsligheten kan också bidra till ökad myogenic constriInsatser vid högre tryck steg.

Figur 1. Schematisk av mikroskop som används för mätning av ^{[Ca2 +]} _Jag i en isolerad lymfatiska. De isolerade lymfatiska kammare är placerad på scenen i inverterat mikroskop. Provet är upplyst alternativt vid 340 och 380 nm och den fluorescerande signal som skickas av det lymfatiska samlas in med en CCD-kamera och lagras i en dator. Den intraluminal tryck lymfatiska styrs av en servo-null återkopplingssystem. Användaren sätter tryck för systemet, och tryckgivare i linje med det lymfatiska vidarebefordra intraluminal trycket till återkoppling, som dynamiskt kan höja eller sänka trycket via en pump.

Figur 2. Exempel på regionen av intresse (ROI) val för Fura-2 ratiometrisk imaging studier i isolerade lymfkärl. Regionen utvalda innehåller de flesta av fartyget (med undantag för områden röra mikropipetter) och det omgivande området för att säkerställa att fartyget kommer att spåras under hela tidsförloppet. En bakgrund ROI (överst till höger) används också för att eliminera icke-specifik signal från den omgivande badet.

Figur 3. Metoder för uppföljning lymfatiska pumpning. A. Inre diameter kan fastställas över tiden med hjälp av ROI som spårar fartygets rörelser väggarna. B. När kontrasten satts till att omfatta hela fartyget, kan ytterdiametern spåras med en ROI. Inre diameter kan uppskattas från dessa mätningar genom att korrigera för väggtjocklek.. C Ett annat alternativ är att spåra det område som omfattas av det fartyg, som kan användas för att beräkna volymen genom att korrigera för godstjocklek ochförutsatt att det lymfatiska har cylindrisk geometri.

Figur 4. Förhållandet mellan ^{[Ca2 +]} _i och lymfatiska diameter. A. Bilderna är från en time-lapse video av Fura-2 intensitet (heat map-format) i en isolerad lymfatiska. Pilarna i varje bild beskriva yttre diameter av fartyget. Bild 1 visar det lymfatiska under diastole, med relativt låg [Ca ^{2 +]} _i. I bild 2, intensiteten i 340/380 kvoten ökar i kärlväggen, strax före phasic kontraktion som sker i bilderna 3-5. Genom bild 4 har Ca ^{2 +} övergående slut, och efter bild 5 har systoliska fasen avslutats och fartyget återvänder till sitt vilotillstånd. B. En tomt på [Ca ^{2 +]} _i och lymfatiska luminala diameter visar att en övergående ökning av ^{[Ca2 +]} _Jag inträffar strax före varjephasic kontraktion.

Figur 5. Förändringar i lymfsystemet ^{[Ca2 +]} _i och det lymfatiska kontraktila cykeln som svar till steg ökningar i tryck. Trycket steg protokoll (A), 340/380 relationstal, som företräder [Ca ^{2 +]} _i (B), och förändringar i lymfatiska diameter över tiden (C) visas. A. Baseline luminala trycket var 2 cm H ₂ O och det lymfatiska fartyg utsattes för steg ökar med 2, 4, 6, 8 och 10 cm H ₂ O. Tidsintervallet mellan varje tryck Step inspelning var 1-2 min. Varje tryck steg orsakat en ökning av såväl frekvens av övergående ökning av ^{[Ca2 +]} _i (B) och phasic sammandragningar (C). Lymfatisk diameter ökade också med varje steg ökning luminala trycket, och för 4 till 10 cm H ₂ O trycket steg, det var en initial minskning av EDD som inträffade afTER EDD1 (C), som tidigare beskrivits som lymfatiska myogenic sammandragning. Det fanns också en stadig ökning i basal [Ca ^{2 +]} _i mellan transienter direkt efter varje steg ökat tryck (B). Den myogenic sammandragning var mer uttalad med de större tryck stegen, men ökningen i basal [Ca ^{2 +]} _Jag var ungefär samma för 4 till 10 cm H ₂ O trycket steg (B). En tidigare redovisade kompensatorisk ökning av AMP var också märkbar efter trycket steg 6 till 10 cm H ₂ O (C).

Figur 6. Lymfatiska myogenic sammandragning och en gradvis ökning i fri [Ca ^{2 +]} _i under diastole, strax efter steg ökningar i tryck. A. Den genomsnittliga EDD mellan 30-50 s efter EDD ₁ används för att beräkna förändringen i normaliserade EDD för varje trycket steg. B. Intensiteten i 340/380 förhållandet 30-50 s efter EDD ₁ var dividerat med genomsnittligt 340/380 kvoten under baslinjen (2 cm H ₂ O). * P <0,05 vs 2 cm H ₂ O trycket steg. N = 4 fartyg studeras.

Film 1. Exempel på phasic sammandragningar i en isolerad lymfatiska fartyg som används för studien. Den luminala trycket var satt till 2 cm H ₂ O. Förfluten tid och en skala bar visas längst ner. Den time-lapse bilder har samlats in med en 10X objektiv med hjälp av ljus. Klicka här för att se filmen.

Film 2. Propportionell Fura-2 avbildning i en pumpande isolerade lymfatiska. En värme kartans skala visas längst upp till vänster och förfluten tid och Skalningsfält visas längst ner. Trycket var ursprungligen satt till 2 cm H ₂ O och höjdes till 8 cm H ₂ O börjar vid 0,5 min och returned till 2 cm H ₂ O på 1,5 min. Klicka här för att se filmen.

Discussion

En ny kombination av metoder som var anställd för att studera inneboende pumpning av lymfkärl. Förmågan att samtidigt mäta förändringar i ^{[Ca2 +]} _i och diameter i pumpning lymfkärlen kommer att möjliggöra studier av relativa bidrag ^{Ca2 +-beroende} och Ca ^{2 +-allergiframkallande} signalvägar i den övergripande mekanism som styr det lymfatiska kontraktila cykeln.

Den lymfatiska kontraktila cykeln består av phasic sammandragningar ovanpå ton. Uppgifterna visar att varje phasic sammandragning är associerad med en övergående ökning av ^{[Ca2 +]} _i, antyder en central roll för Ca ^{2 +} i Pacemaking mekanism, och att frekvensen av Ca ^{2 +} transienter är känslig för förändringar i luminala trycket . Våra data visar också att en snabb ökning av trycket kan framkalla en stadig ökning av den basala [Ca ^{2 +]} _i mellan transienter. Denna ökning kan bidra tillden myogenic förträngningar som observeras samla in lymfkärlen följande steg ökar i luminala tryck. Vi konstaterade dock en platå av ökningarna i denna basala [Ca ^{2 +]} _i med trycket steg som sträcker sig från 6 till 10 cm H ₂ O, som hade varierande grader av myogenic sammandragning. Dessa data tyder på att en annan mekanism, kanske en Ca ^{2 +-allergiframkallande} mekanism, också är involverad i myogenic följd av påtryckningar.

Ett antagande i dessa studier är att majoriteten av de uppmätta Ca ^{2 +} finns i glatt muskulatur. Men Ca ^{2 +} i endotelceller och andra typer cell som kan finnas i lymfkärlen bidrar också till den totala observerade ^{[Ca2 +]} _i, därför att de uppmätta värdena är troligen en överskattning av glatt muskulatur ^{[Ca2 +]} _i i lymfkärlen. Varje Ca ^{2 +} mätt från endotelet förväntas inte direkt bidraratt jämna muskelsammandragning baserat på tidigare studier i arterioler ^16. Denna fråga kommer att behandlas i kommande experiment där lymfkärlen är utblottad av endotelet.

När du använder ratiometrisk färgämnen för att bedöma [Ca ^{2 +]} _Jag i celler eller vävnader, förflyttning av provet kan orsaka artefakter. För att minimera rörelse artefakter i upphandlande lymphatics, utnyttjade vi en avkastning som inkluderar så mycket av fartyget som möjligt för att bestämma 340/380 nyckeltal. Vi har också bara studera fartyg som vistas i fokus under sin kontraktila cykeln. På grund av potentiella artefakter som kan uppstå fartygsrörelser, snarare än bestämma den absoluta ^{[Ca2 +]} _jag på en viss plats, får vi genomsnittet för ett stort område av fartyget. Vi fokuserar på de relativa förändringarna i genomsnitt [Ca ^{2 +]} _i tiden och hur dessa ändringar avser phasic och tonic sammandragning av fartyg.

Sammanfattningsvis DETErmination av förändringar i ^{[Ca2 +]} _i genom ratiometrisk avbildning i isolerade samla lymfkärlen är ett kraftfullt verktyg för att dechiffrera ^{Ca2 +-beroende} och Ca ^{2 +-allergiframkallande} mekanismerna bakom det lymfatiska kontraktila cykeln. Med denna metod kommer framtida studier där man använt selektiva agonister eller hämmare av olika signaltransduktionsvägar hjälper också differentiera unika molekylära mekanismerna bakom phasic kontra tonic nedgång i lymfatisk glatt muskulatur.