Summary
שיטה שכיבות למשוך לאיסוף נדיפים צמח מתואר. השיטה מאפשרת השוואה של נדיפים המושרה על ידי האכלה אוכלי עשב, jasmonate מתיל אקסוגניים, ונזק מכני. טכניקה זו משמשת גם כדי לחקור את התגובה נדיפים ענפים ניזוק חשיפה נדיפים מענפי אוכלי עשב שניזוק בתוך צמחים אוכמניות.
Abstract
אוכלי עשב הנגרמת נדיפים צמח (HIPVs) נפלטים בדרך כלל אחרי 1,2 לתקוף אוכלי עשב מצמחים. HIPVs אלו מוסדר בעיקר על ידי חומצה jasmonic הגנתי הורמון צמח (JA) ו jasmonate מתיל נגזרות נדיף שלה (MeJA) 3,4,5. במהלך 3 העשורים האחרונים חוקרים תיעדו כי HIPVs יכול לדחות או למשוך אוכלי עשב, למשוך את האויבים הטבעיים של אוכלי עשב, ובמקרים מסוימים הם יכולים לגרום או הגנות הממשלה צמח לפני המתקפה אוכלי עשב. במאמר האחרונות 6, אני דיווחו כי האכלה של עש צועני זחלים, אקסוגניים יישום MeJA, ונזק מכני לגרום פליטת נדיפים מצמחים אוכמניות, אם כי באופן שונה. בנוסף, סניפים אוכמניות להגיב HIPVs הנפלט סניפים סמוכים של אותו צמח על ידי הגדלת רמות של JA והתנגדות אוכלי עשב (כלומר, הגנות צמח ישיר), ועל ידי פליטת תחול נדיף (כלומר, הגנות צמח עקיף). בדומה לאתרings דווחו לאחרונה 7 לענה, צפצפה 8, שעועית לימה 9 ..
הנה, אני מתאר שיטה שכיבות למשוך לאיסוף נדיפים אוכמניות המושרה על ידי אוכלי עשב (עש צועני) האכלה, אקסוגניים יישום MeJA, ונזק מכני. יחידת איסוף נדיף מורכב תא 4 L נדיפים אוסף, הגיליוטינה 2 חלקים, מערכת אספקת אוויר מטהר האוויר הנכנס, ומערכת ואקום מחובר מלכודת מלא Super-Q הסופח לאסוף נדיפים 5,6,10 . נדיפים שנאספו Super-Q הם מלכודות eluted עם dichloromethane והפריד ואז לכמת באמצעות גז כרומטוגרפיה (GC). שיטה זו שימשה אוסף נדיפים n המחקר שלי 6 לחקור את התגובה נדיפים ענפים ניזוק חשיפה נדיפים מענפי אוכלי עשב שניזוק בתוך צמחים אוכמניות. שיטות אלה מתוארים כאן. בקצרה, סניפים אוכמניות ניזוק נחשפים HIPVs הלוך ושובמ סניפים שכנות בתוך אותו צמח. באמצעות אותן טכניקות שתוארו לעיל, נדיפים הנפלטים סניפים לאחר חשיפה HIPVs נאספו ונותחו.
Protocol
1. גיוס מקומי של נדיפים: נזק אוכלי עשב
- שני ענפים של צמחים הם ארזו אוכמניות עם שרוול פוליאסטר הסתחרר.
- שש עש צועני זחלים (2 nd instars -3 rd) ממוקמים בתוך שקיות ו מותר להאכיל על צמחים עבור 2 ימים לפני איסוף נדיפים. צמחים בקרת אינם מקבלים כל זחלים.
- פליטת נדיפים נאספים כמתואר להלן (פרוטוקול # 7) ביום 3 (איור 1). שרוולים פוליאסטר להישאר על הצמחים כדי למנוע חרקים לברוח.
2. גיוס מקומי של נדיפים: נזק מכני
- נזק מכני לצמחים נגרם על ידי ניקוב חורים לחקות את כמות שטח עלה להסיר עש צועני.
- חמישה עלים בכל מפעל נפצעים עם שני חורים 7 מ"מ הממוקמת בבסיס ואת החלק העליון של העלים בסוף ימים 1 ו 2. הטיפול השליטה אינו מקבל נזק מכני.
3. גיוס מקומי של נדיפים: MeJA
- צמחים אוכמניות מטופלים עם 10 מ"ל של פתרון או 1 מ"מ או 1.5 של MeJA בפתרון Tween-20 0.1%.
- MeJA מיושמת באמצעות בקבוק תרסיס של 2 גרם. צמחים הבקרה ריססו עם 10 מ"ל של פתרון tween-20 0.1%.
- צמחים מטופלים בבית שעות 16:00, ושמרה בחממה במשך 15 שעות בתוך בקוטר 17 ס"מ ו 35 ס"מ תא פרספקס גבוהה לקראת אוספים נדיפים.
- פליטת נדיפים נאספים כמתואר להלן.
4. אינדוקציה מערכתית של נדיפים: איתות פנימי
- סניף התחתון של צמח האוכמניות הוא שקיות עם שרוול פוליאסטר סובב נפגע על ידי הצבת שישה (2 nd instars -3 rd) עש צועני זחלים בתוך השק.
- הסניף פגום נשאר מחוץ לחדר אוסף תנודתי, בעוד brancheשל מעל הסניף פגום ממוקמים בתוך החדר (איור 2).
- זחלים מותר להאכיל על ענף התחתונה עבור 2 ימים.
- החל ביום 3, נדיפים נאספים חלק ניזוק צמחים פגום.
- נדיפים נאספו במשך 7 ימים רצופים. צמחים שליטה מטופלות באופן דומה, אך לא לקבל נזק אוכלי עשב.
5. דם קישוריות
- מחקר זה קבע את מידת הקישוריות בין סניפים שונים של כלי הדם בתוך מפעל אוכמניות.
- חלק סוף ענף נמוך יותר מצמח נחתך לתמוך לאסוף מים פרחונית המכילה 6 פתרון מ"ל של Rhodamine-B (Sigma-Aldrich) צבע (0.25% w / v), כפי שמתואר Orians et al. 11
- התנועה של צבע באמצעות הצמח מנוטר ביום למשך 7 ימים.
- לאחר 7 ימים, סכום של כתמים אדומים מוערך ויזואלית מעמדות שונים של הצמח.
6. חשיפה HIPVs: איתות חיצוני
- סניפים בתוך מפעל נחשפים גם כדי HIPVs מהסניף הסמוך או לא קיבל חשיפה HIPVs.
- כדי לחשוף את HIPVs ענפים, ענף אחד נמוך יותר שקיות עם שרוול פוליאסטר ושישה (2 nd instars -3 rd) עש זחלים צועני ממוקמים בתוך שקיות (איור 3).
- המפעל בכלוב בתוך תא פלסטיק דומות לאלו שתוארו לעיל. חרקים מותר להאכיל על צמחים עבור 2 ימים, כך הענפים הסמוכים נחשפים נדיפים הנפלטים הסניף המושרה.
- לאחר החשיפה (יום 3), ענפים חשופים ממוקמים בתוך חדר אוסף נדיפים, ומשאיר בחוץ חרקים נפצעו הסניף (כפי שניתן לראות באיור 2).
- נדיפים מן HIPV חשוף סניפים נאספים כמתואר להלן, ואת כמות השטח עלה נצרך מענף התחתון נמדדים באמצעות Scion תמונה Softwaמחדש.
7. חשיפה HIPVs: תחול
- כדי לקבוע אם הצמחים הם "דרוך" לאחר החשיפה HIPV, צמחים כאל בפרוטוקול מס '5.
- מחצית הצמחים נחשפים HIPVs מסניף סמוך המושרה, בעוד החצי השני נחשף סניפים ניזוק.
- ב -3 ימים, ארבעה מוקדם 2 nd-instar עש זחלים צועני ממוקמות על כל צמח נדיפים נאספים כמתואר להלן (איור 4).
- אחרי האוספים נדיפים, עלים פגומים מלכתחילה על ידי עש זחלים צועני, כמו גם אלה שנפגעו ביום 3, הם נכרת וכמויות נצרך באזור עלה נמדדים.
8. אוסף של נדיפים
- פליטת HIPV נדגמים בחממה באמצעות מערכת שכיבות למשוך. החלק מעל הקרקע של עציצים (גזע, ענפים, ועלים), לרבות זחלים בטיפול נזק אוכלי עשב, ממוקמים בתוך 4 L volaאוסף חדר אריח. הגיליוטינה 2 חלקים תומך בסיס צמחים. מטוהר האוויר נכנס העליון של תא זה בקצב של 2 ליטר / דקה.
- נדיפים נאספו במלכודות מלא של 30 מ"ג Alltech Super-Q הסופח ידי משיכת אוויר החדרים בקצב של 1 ליטר / דקה.
- מנגנון גבייה נדיף מורכב מארבעה חדרים, המאפשר אוספים נדיפים סימולטני של ארבעה צמחים שונים (איור 1).
- אוספים נערכים בשעות היום 9:00-17:00 h.
- לאחר איסוף כל העלים מצמחים נקצרים, מיובש בתנור ב 60 ° C, ו - שקל, ותאי הם לשטוף במי ברז ו 70% אתנול.
9. ניתוח נדיפים
- נדיפים שנאספו Super-Q הם מלכודות eluted עם dichloromethane (150 μl) ו - 400 ng של אוקטן-n הוא הוסיף כסטנדרט פנימי.
- ההפרדה וכימות של תרכובות נעשית על סדרה Hewlett Packard 6890גז כרומטוגרף (GC) (איור 5), מצוידים גלאי להבה יינון (FID) ו Agilent HP-1 טור (10 mx 0.53 מ"מ x 2.65 מיקרומטר), ושימוש הוא כמו גז הספק (זרם קבוע = 5 מ"ל / דקה , מהירות = 39 ס"מ / שנייה). תוכנית הטמפרטורה התחיל ב 40 ° C שמרה דקות 1, גדל ב 14 ° C / min עד 180 ° C (2 דקות), ואז בגיל 40 ° C / min עד 200 ° C, ושמר על 200 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות .
- זיהוי סופי של תרכובות מתבצעת על 3400 וריאן GC מצמידים את ספקטרומטר מסה פיניגן 8230 MAT (MS), מצויד עמודה Supelco MDN-5S (30 mx 0.32 מ"מ x 0.25 מיקרומטר), ועם הוא כמו הגז המוביל. טרשת נפוצה היא פעלה יינון אלקטרון (EI) ו יון סך chromatogram (עוית) מצב ב 250 מעלות צלזיוס (טמפרטורת המקור). התוכנית החלה בשעה 35 ° C (1 דקות), עלתה 4 ° C / min עד 170 ° C, אז על 15 ° C / min עד 280 ° C.
- תרכובות מזוהים בהיסוס על ידי השוואה של נתונים ספקטרליים עם אלה של NIST הספרייה בy מדד GC השמירה, ועל ידי השוואת זמני השמירה שלהם עם אלה של חומרים זמינים מסחרית.
10. נציג תוצאות:
עשרים ושניים נדיפים זוהו מהעלים אוכמניות (איור 6). איור 7 מראה כרומטוגרף נציג עלים אוכמניות ניזוק ועלים שניזוקו על ידי האכלה של עש צועני. נזק האכלה מכנית ועל ידי זחלי עש צועני גדל פליטת נדיפים מקומי מ אוכמניות עלים בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 8). לעומת האכלה זחל, הטיפול MeJA המושרה 11 מתוך 17 תרכובות המושרה על ידי עש צועני (איור 9). היה, עם זאת, אין עדות אינדוקציה מערכתית של נדיפים מן העלים ניזוק נזק של עש צועני צמחים שבעה ימים לאחר הפגיעה הראשונית האכלה (כלומר, חוסר איתות פנימי) (איור 10). בנוסף, אחרי שבוע אחד, מאוד איטי לנועment של צבע אדום נצפתה בקרב ענפי צמחים אוכמניות (איור 11). היה קישוריות כלי הדם גבוה בין העלים בתוך סניף אחד. עם זאת, היה בינוני עד נמוך קישוריות בין שני ענפי בציר אנכי בתוך לירות, קישוריות נמוכה בין שני ענפים בצדדים מנוגדים של לירות.
לא היה הבדל בין הסכומים של נדיפים הנפלטים ענפים חשופים HIPVs לעומת אלו שלא נחשפו HIPVs (איור 12). עם זאת, HIPVs לשמש אותות הגנה חיצוני אוכמניות. עש הצועני נמאס זחלים על העלים חשופים בעבר HIPVs נצרך החומר עלה 71% פחות לעומת אלו שניזונו unexposed מלאה עלים (איור 13). יתר על כן, כמויות של נדיפים הנפלטים לכל כמות של שטח עלה נצרך HIPV חשוף סניפים היו גבוה פי 4 לעומת ענפים שלא נחשפו (איור 14), המציין כי העלים HIPV לשעבר ענפים הנשקף היו קשובים יותר herbivory (כלומר, הם היו טעונים).
באיור 1. מערכת שכיבות למשוך משמש לאיסוף נדיפים מצמחים אוכמניות. צמחים ממוקמים בתוך חדרי זכוכית ואוויר נקי הוא עבר אותם. מסנן המכיל חומר הסופח צורפה בצד של החדר לכל מלכודת נדיפים הנפלטים מהמפעל. ואקום משמש למשוך אוויר מבפנים של החדר דרך מסנן.
באיור 2. כדי לחקור את התגובה נדיפים מערכתית מצמחים אוכמניות, אוכמניות סניפים התחתון נפגעו גם על ידי עש זחלים צועני (חדר ימין) או (חדר שמאל) שמאל ניזוק. אחרי 2 ימים (ביום 3), נדיפים מן הענפים העליונים ניזוק מצמחים פגום ניזוק נאספו.
באיור 3. כדי לבדוק אם העלים מענפי ניזוק להגיב HIPVs מהענפים שנפגעו, אני שקיות באחד הענפים בכל אחד הצמחים אוכמניות. ואז הנחתי עש צועני זחלים בתוך שקיות של חצי הצמחים. שקיות נהגתי לאפשר תנועה של נדיפים מבפנים החוצה של שקיות. צמחים הונחו בתוך פרספקס לתאי לחשוף סניפים ניזוק כדי HIPVs. נדיפים נאספו אז על הענפים חשופים.
איור 4. כדי לבדוק אם העלים מענפי ניזוק הם "דרוך" לאחר חשיפה HIPVs, ניסויים חזרו כמתואר באיור 3 זחלים אבל עש צועני הונחו על HIPV חשוף סניפים unexposed בתוך חדר כל אוסף נדיפים.
g "alt =" איור 5 "/>
איור 5. לאחר אוספים נדיפים, דגימות מוזרקים על גז כרומטוגרף (GC) כדי לזהות ולכמת את נדיפים הנפלטים מתחנות אוכמניות.
איור 6. לפחות 22 תרכובות נפלטים עלים אוכמניות.
איור 7. Chromatographs אופיינית של אוכמניות ניזוק עלים עלים שנפגעו זחלי עש צועני. נדיפים נפלטים בסכומים נמוכים מאוד מהעלים אוכמניות ניזוק. עם זאת, כאשר העלים שנפגעו זחלי עש צועני, פליטת נדיפים עלה באופן דרמטי.
איור 8. הגרף מראה את הסכומים של כל אחד 22 נדיפים הנפלטים עלים ניזוק, מ 'echanically שניזוק עלים, ועלים שנפגעו זחלי עש צועני. פגיעה מלאכותית לחקות את כמות שטח עלה הוסר על ידי פליטה מוגברת זחלים נדיף מהעלים אוכמניות אבל התגובה היתה שונה בתגובה נדיף של עלי כדי האכלה עש צועני.
איור 9. נבדק אם מסלול JA מסדיר פליטת נדיפים בעלים אוכמניות. הצמחים רוססו עם כמויות שונות של MeJA. מצאתי כי ריכוז גדל והולך של exogenously-להחיל MeJA גדל פליטת נדיפים מעלי אוכמניות.
איור 10. הגרף מציג את סך כל נדיפים הנפלטים סניפים אוכמניות מלאה מענפי ניזוק מן הצמחים עש צועני פגום (תגובה מערכתית). נדיפים נאספו עבור אלטל של 7 ימים רצופים. לא מצאתי השראה מערכתית של נדיפים אפילו 7 ימים לאחר הפגיעה הראשונית הענפים הנמוכים של צמחים.
איור 11. השתמשתי rhodamine-B (צבע אדום) כדי לקבוע את מידת הקישוריות של כלי הדם בקרב סניפים בתוך צמחים אוכמניות. מצאתי כי כ. 80%, 20%, 5% ו -0% עלים מהענפים המכילים את צבען, סניפים ישירות מעל ענף המכיל את צבען, סניפים ברחבי הסניף המכיל צבען, סניפים הממוקמים לירות שונים בתוך מפעל אוכמניות, בהתאמה, היו מוכתמת באופן מלא עם הצבע.
איור 12. הגרף מראה את כמות נדיפים הנפלטים ענפים חשופים סניפים HIPVs ו unexposed. מצאתי כי חשיפה HIPVs לא השפיע על פליטת נדיפים צהלתמשעמם סניפים אוכמניות ניזוק.
איור 13. הגרף מראה את כמות ההאכלה על ידי עש זחלים צועני אוכמניות על ענפים חשופים סניפים HIPVs ו unexposed. זחלים על HIPV חשוף סניפים צרכו כמות העלווה פחות בהשוואה לאלו שלא נחשפו על ענפים.
איור 14. כאשר חישבתי את שיעור פליטת לכל אזור נצרך, מצאתי כי HIPV חשוף ענפים עלה שיעור פליטת נדיפים לעומת ענפים unexposed, המציין כי חשיפה HIPVs דרוך עלים סניפים אוכמניות לתגובה תנודתי יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שכיבות למשוך מנגנון גבייה נדיפים המתואר כאן מייצג שיטה סטנדרטית אוספים אמיץ נדיפים של הצמח. מנגנון זה שימש כדי לקבוע את התגובה נדיף של עלי אוכמניות על ידי זחלי עש herbivory צוענית מותר גם לי לספק ראיות חדשות על תפקיד HIPVs איתות צמח פנים.
התוצאות המוצגות כאן מראות כי האכלה זחל, exogenously-להחיל MeJA, ופצעו מכני מוגבר פליטת נדיפים באתר של נזק, אם כי באופן שונה. תוצאות אלו מצביעות כי מסלול JA ממלא תפקיד מרכזי ב אינדוקציה של HIPVs ב אוכמניות.
חשיפה HIPV לא לגרום פליטת נדיפים. ענפים עם זאת, HIPV החשופים היו טעונים לתגובה תנודתי עלה ל האכלה עש צועני. בתגובה HIPVs ידי גידול פליטת נדיפים בהיעדר אוכלי עשב עלול להיגרם אקולוגיים כמו גם cos פיזיולוגייםTS, בגלל HIPVs עשוי לספק מידע אמין על אויבים טבעיים של אוכלי עשב. במקום זאת, אסטרטגיה אדפטיבית יותר עשוי להיות עבור הצמחים הממשלה עצמם לתגובת תנודתי מוגבר לאחר חשיפה HIPVs. זה שיעור מוגבר של פליטת נדיפים מן HIPV חשוף עלים עשוי לשמש הגנה עקיפה על ידי מעדיפים למשוך את האויבים הטבעיים של אוכלי עשב או עשוי למלא תפקיד ביטחוני ישיר מאז נדיפים מספר הנגרם על ידי עש הצועני אוכמניות יכולה להיות השפעה על זחלים דוחה 12.
לסיכום, התוצאות שלי מראות כי העלים מהענפים שנפגעו אוכמניות להעביר מידע דרך נדיפים כי למזער את הנזק האכלה חרקים פליטת נדיפים הממשלה העלים קבלת סניפים סמוכים. תוצאות אלו, בשילוב עם אלה על ידי אחרים מספקים ראיות מוצקות לכך HIPVs לשחק תפקיד איתות צמח התוך ו נוספת להדגים את רב תפקודי תפקידי HIPVs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לי מה לחשוף
Acknowledgments
המחבר מודה רוברט Holdcraft לקבלת סיוע טכני. מחקר זה מומן בחלקו על ידי משרד החקלאות CSREES מיוחד גרנט (2009-34155-19957) וקרנות לבקוע (NJ08192).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Volatile collection chambers | Analytical Research Systems, Inc. | VCC-G6X12DT-1P | Gainesville, FL |
| Air compressor, 20 gal, oil free, 2 hp | Westward | 3JR71 | Sold by Grainger, Inc. |
| Air delivery system | Analytical Research Systems, Inc. | VCS-ADS-4AFM4C | Gainesville, FL |
| Air collection system | Analytical Research Systems, Inc. | VCS-MVCS-4CX1P | Gainesville, FL |
| Vacuum pump 100-150V, ¼ hp | Gast Manufacturing, Inc. | 4F740 | Sold by Grainger, Inc. |
| Methyl jasmonate | Sigma-Aldrich | J2500 | St. Louis, MO |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 | St. Louis, MO |
| Rhodamine-B | Sigma-Aldrich | St. Louis, MO | |
| Plastic spray bottles, 2 oz | Setco Inc. | Cranbury, NJ | |
| Spun polyester sleeves | Rockingham Opportunities Corp. | Reidsville, NC | |
| Super-Q volatile collection traps | Analytical Research Systems, Inc. | VCT-1/4X3-SPQ | Gainesville, FL |
| Scion Image Software | Scion Corporation | Frederick, MD | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | St. Louis, MO |
| Gas chromatograph HP 6890 | Hewlett-Packard | ||
| Gas chromatograph Varian 3400 | Varian Inc., Agilent | ||
| n-octane | Sigma-Aldrich | 296988 | St. Louis, MO |
| Mass spectrometer MAT 8230 | Finnigan | San Jose, CA | |
| HP-1 GC column | Agilent Technologies | Palo Alto, CA |
|
| MDN-5S GC column | Supelco, Sigma-Aldrich | Bellefonte, PA |
References
- Dicke, M., Van Loon, J. J. A. Multitrophic effects of herbivore-induced plant volatiles in an evolutionary context. Entomol. Exp. Appl. 97, 237-237 (2000).
- Mumm, R., Dicke, M. Variation in natural plant products and the attraction of bodyguards involved in indirect plant defense. Can. J. Zool. 88, 628-628 (2010).
- Hopke, J. Herbivore-induced volatiles: the emission of acyclic homoterpenes from leaves of Phaseolus lunatus and Zea mays can be triggered by a β-glucosidase and jasmonic acid. FEBS Lett. 352, 146-146 (1994).
- Rodriguez-Saona, C. Behavioral and electrophysiological responses of the emerald ash borer, Agrilus planipennis, to induced volatiles of Manchurian ash, Fraxinus mandshurica. Chemoecology. 16, 75-75 (2006).
- Rodriguez-Saona, C. Herbivore induced volatiles in the perennial shrub, Vaccinium corymbosum, and their role in inter-branch signaling. J. Chem. Ecol. 35, 163-163 (2009).
- Karban, R. Damage-induced resistance in sagebrush: volatiles are key to intra- and interplant communication. Ecology. 87, 922-922 (2006).
- Frost, C. J. Within-plant signalling by volatiles overcomes vascular constraints on systemic signalling and primes responses against herbivores. Ecol. Lett. 10, 490-490 (2007).
- Heil, M., Bueno Silva, J. C. Within-plant signaling by volatiles leads to induction and priming of an indirect plant defense in nature. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5467-5467 (2007).
- Turlings, T. C. Exploitation of herbivore-induced plant odors by host-seeking parasitic wasps. Science. 250, 1251-1251 (1990).
- Makovic, I. Volatiles involved in the nonhost rejection of Fraxinus pennsylvanica by Lymantria dispar larvae. J. Agric. Food Chem. 44, 929-929 (1996).
