Summary
Двухтактный метод сбора летучих растительных веществ описывается. Метод позволяет сравнению летучих индуцированных травоядных питания, экзогенными jasmonate метил, и механических повреждений. Этот метод также используется для исследования летучих ответ неповрежденных ветвей к воздействию летучих из травоядных поврежденных ветвей в пределах черники растений.
Abstract
Травоядным вызванных летучих растительных веществ (HIPVs) обычно излучается из растений после травоядного 1,2 атаки. Эти HIPVs в основном регулируется оборонительных растительный гормон жасмоновой кислота (JA) и его летучие производные jasmonate метил (ЗЭЮВ) 3,4,5. За последние 3 десятилетия исследователи документально подтверждено, что HIPVs может отталкивать или привлекать травоядных животных, привлекают естественных врагов травоядных животных, а в некоторых случаях они могут вызывать или возражения премьер растение до травоядных атаки. В недавней работе 6, я сообщил, что кормление гусениц непарного шелкопряда, экзогенные применение ЗЭЮВ, а также механические повреждения вызывают выбросы летучих веществ из растений черники, хотя и по-разному. Кроме того, черника отраслей реагировать на HIPVs излучаемого из соседних ветвей одного и того же завода за счет увеличения уровня JA и устойчивость к травоядных животных (например, прямой защиты растений), а также грунтовки летучих веществ (например, косвенные защиты растений). Подобные найтиINGS были зарегистрированы в последнее время для полыни 7, тополь 8, и бобы Лимы 9 ..
Здесь я описываю двухтактный метод сбора черники летучих индуцированных травоядных (непарный шелкопряд) кормления, применение экзогенных ЗЭЮВ, и механических повреждений. Летучих единицы Коллекция состоит из 4 л летучих камеры сбора, 2-х частей гильотины, система подачи воздуха, которая очищает поступающий воздух и вакуумная система подключена к ловушки заполнены Super-Q адсорбент для сбора летучих 5,6,10 . Летучие вещества, собранные в Супер-Q ловушки элюировали дихлорметаном и затем отделяется и количественно с помощью газовой хроматографии (GC). Это летучие метод сбора был использован н моем кабинете с 6 по расследованию летучих ответ неповрежденных ветвей к воздействию летучих из травоядных поврежденных ветвей в пределах черники растений. Эти методы описаны здесь. Короче говоря, неповрежденные черники отраслей подвергаются HIPVs сюдам соседней ветви в пределах одного растения. Используя те же методы, описанные выше, испускаемые летучими с ветвей после воздействия HIPVs собраны и проанализированы.
Protocol
1. Местные индукции летучих: травоядное повреждения
- Две ветви голубики растений мешках с рукавом нити полиэстера.
- Шесть гусениц непарного шелкопряда (2-й -3 возрастов й) должны быть размещены внутри сумки и позволило питаются растениями в течение 2 дней до летучих коллекции. Контрольные растения не получают гусениц.
- Летучие выбросы собираются, как описано ниже (протокол № 7) на 3-й день (рис. 1). Полиэстер рукава остаются на растениях, чтобы предотвратить насекомых от побега.
2. Местные индукции летучих: механические повреждения
- Механическое повреждение растений причиняются государственным должностным лицом пробивая отверстия для имитации количества листовой поверхности удаляются непарного шелкопряда.
- Пять листьев одного растения получают травмы с двумя 7-мм отверстий, расположенных у основания и верхней части листьев в конце 1-й и 2. Контроля лечения не получает механических повреждений.
3. Местные индукции летучих: ЗЭЮВ
- Черника растения обрабатывают 10 мл или 1 или 1,5 мМ раствор ЗЭЮВ в 0,1% Твин-20 решение.
- ЗЭЮВ применяется с использованием 2-унции распылитель. Контрольные растения опрыскивают 10 мл 0,1% Твин-20 решение.
- Растения лечат в 16:00 часов, и все в теплице в течение 15 ч в 17-см в диаметре и 35-см камеры оргстекла до летучих коллекций.
- Летучие выбросы собираются, как описано ниже.
4. Системная индукция летучих: внутренняя сигнализация
- Нижней ветви голубики завод мешках с полиэфирной нити рукав и поврежденные размещения шести (2-й -3 возрастов й) гусеницы непарного шелкопряда в сумке.
- Поврежденные ветви остается вне летучие камеры сбора, в то время как Brancheа над поврежденным филиала расположены внутри камеры (рис. 2).
- Гусеницы могут питаться нижней ветви на 2 дня.
- Начиная с 3-й день, летучие собираются из неповрежденной части поврежденных растений.
- Летучие вещества собираются в течение 7 дней подряд. Контрольные растения обрабатываются таким же образом, но не получил травоядных повреждения.
5. Сосудистые подключения
- Это исследование определило степень сосудистой связи между различными ветвями внутри черники завода.
- Концевой части нижней ветви из растения разрезается на поддержку цветочный забрать воду, содержащую 6 мл раствора родамина-B (Sigma-Aldrich) краситель (0,25% вес / объем), как описано в Orians и др. 11.
- Движение краску через завод контролируется ежедневно в течение 7 дней.
- После 7 дней, количество красного окрашивания визуально оценивать с разных позиций завода.
6. Воздействие HIPVs: внешней сигнализации
- Филиалы в пределах завода, либо подвергается HIPVs из соседнего отделения или не получил воздействия HIPVs.
- Чтобы разоблачить филиалов HIPVs, одна нижняя ветвь мешках с рукавом полиэстера и шесть (2-й -3 возрастов й) гусеницы непарного шелкопряда помещают внутрь сумки (рис. 3).
- Завод клетке внутри камеры оргстекла, подобные описанным выше. Насекомые могут питаться растениями в течение 2 дней, таких смежных отраслей, которые подвергаются воздействию летучих излучаемый индуцированных отрасли.
- После экспозиции (день 3), подвергаются ветви должны быть размещены внутри летучих камеры сбора, оставив насекомых ранения филиал за пределами (как показано на рисунке 2).
- Летучие вещества из HIPV, подвергшихся воздействию ветви собирают, как описано ниже, а количество листовой поверхности, потребляемая от нижней ветви уровни производительности измеряются для Scion Image Softwaповторно.
7. Воздействие HIPVs: грунтовки
- Для определения того, растения "загрунтовать" после воздействия HIPV, растения обрабатываются как в протоколе № 5.
- Половина растений подвергаются HIPVs из индуцированных смежные отрасли; в то время как другая половина подвергается неповрежденных ветвей.
- На 3-й день, четыре ранние 2-го возраста гусениц непарного шелкопряда размещены на каждом заводе и летучие собираются, как описано ниже (рис. 4).
- После летучих коллекций, листья, поврежденные от гусениц непарного шелкопряда, а также те, которые были повреждены в день 3, вырезали и количества потребляемой площади листа измеряются.
8. Коллекция летучих
- HIPV выбросы, отобранных в парниковых использовании двухтактной системы. Выше доля основании горшечных растений (ствол, ветви и листья), в том числе гусеницы в лечении повреждений травоядное животное, помещают внутрь 4 л VolaКамера плитки коллекции. 2-х частей гильотины поддерживает базу растений. Очищенный воздух поступает в верхней части каждой камеры со скоростью 2 л / мин.
- Летучие вещества собираются в ловушки заполнены 30 мг Alltech Super-Q адсорбента, потянув воздух из камер со скоростью 1 л / мин.
- Летучий аппарат коллекция состоит из четырех камер, что позволяет одновременное коллекции летучих из четырех различных растений (рис. 1).
- Коллекции проводятся в дневное время с 09:00 до 17:00 ч.
- После сбора все листья с растений собирают, печи сушат при 60 ° С и взвешивают, и камер промывают водопроводной водой и 70% этанола.
9. Анализ летучих веществ
- Собранных летучих из Super-Q ловушки элюировали дихлорметаном (150 мкл) и 400 нг н-октана добавляется в качестве внутреннего стандарта.
- Разделение и количественное определение соединений производится на Hewlett Packard 6890 серииГазовый хроматограф (GC) (рис. 5), оснащен детектором ионизации пламени (FID) и Agilent HP-1 колонку (10 м х 0,53 мм х 2,65 мкм), и используя его в качестве газа-носителя (постоянный поток = 5 мл / мин , скорость = 39 см / сек). Температура программа началась при 40 ° С выдерживают в течение 1 мин, увеличился на 14 ° C / мин до 180 ° С (2 мин), затем при 40 ° С / мин до 200 ° С, и выдерживают при 200 ° С в течение 2 мин .
- Предварительные идентификации соединений осуществляется на Varian 3400 ГК связан с MAT Finnigan 8230 масс-спектрометр (MS), оснащенный Supelco MDN-5S колонке (30 м х 0,32 мм х 0,25 мкм), и с его качестве газа-носителя. MS работает в электронной ионизации (EI) и полного ионного хроматограмм (TIC) режиме при температуре 250 ° C (температура источника). Программа началась при температуре 35 ° С (1 мин), увеличилась на 4 ° С / мин до 170 ° С, затем при 15 ° С / мин до 280 ° C.
- Соединения предварительно определены путем сравнения спектральных данных с теми, от NIST библиотеке и бу GC удержания индекса, и, сравнивая их хранения с теми, коммерчески доступных соединений.
10. Представитель Результаты:
Двадцать два летучих веществ были определены из черники листьев (рис. 6). На рисунке 7 показана представитель хроматограф неповрежденных листьев черники и листьев повреждены кормления непарного шелкопряда. Механические повреждения и кормления гусениц непарного шелкопряда увеличилась летучих выбросов локально с черникой листьев по сравнению с контрольной группой (рис. 8). По сравнению с кормлением гусеница, лечение ЗЭЮВ индуцированных 11 из 17 соединений индуцированных непарного шелкопряда (рис. 9). Существовал, однако, никаких доказательств системной индукции летучих из неповрежденных листьях непарного шелкопряда-поврежденных растений семи дней после первоначального повреждения кормление (например, отсутствие внутренней сигнализации) (рис. 10). Кроме того, через неделю, очень медленно двигатьсяМент из красного красителя наблюдалась между ветвями голубики растений (рис. 11). Существовал высокой сосудистой соединения между листьями в пределах одной отрасли. Однако не было среднего до низкого связи между двумя ветвями вертикально внутри стрелять, и низкая связность между двумя ветвями по разные стороны стрелять.
Существовал никакой разницы между количеством летучих излучаемый отраслей подвергается HIPVs против тех, кто не подвергается HIPVs (рис. 12). Тем не менее, HIPVs выступать в качестве внешнего оборонительного сигналов в чернике. Гусеницы непарного шелкопряда питаются листьями, ранее подвергшимися воздействию HIPVs потребляется 71% меньше листа материала, чем те, питались неэкспонированные контрольных листьях (рис. 13). Кроме того, количество летучих веществ, испускаемых на количество листовой поверхности, потребляемого в HIPV, подвергшихся воздействию филиалы в 4 раза выше по сравнению с неэкспонированные ветвей (рис. 14), указывая, что выходит из HIPV-ех поставленные ветви более чутко реагировать на herbivory (то есть, они были загрунтовать).
Рисунок 1. Двухтактный система используется для сбора летучих из черники растений. Растения должны быть размещены внутри стекла камеры и чистый воздух проходит над ними. Фильтр, содержащий адсорбент материал был прикреплен к стороне каждой камере для улавливания летучих излучаемый завода. Вакуум используется для тянуть воздух из внутренней камеры через фильтр.
Рисунок 2. Для изучения системных летучих ответ от черники растений, нижние ветви черники были либо повреждены гусеницами непарного шелкопряда (правая камера) или влево неповрежденной (левого желудочка). Через 2 дня (в день 3), летучих из неповрежденных верхних ветвей с поврежденных и неповрежденных растений были собраны.
Рисунок 3. Для проверки того, неповрежденные листья с ветвей реагировать на HIPVs из поврежденных ветвей, я мешках одного из филиалов в каждом из черники растений. Затем я помещен гусениц непарного шелкопряда внутри сумки половины растений. Мешки я использовал чтобы обеспечить движение летучих изнутри вне сумки. Растения были помещены в оргстекла камер подвергать неповрежденной филиалов HIPVs. Летучие вещества, то собранные подвергается филиалов.
Рисунок 4. Для проверки того, неповрежденные листья с ветвей "загрунтовать" после контакта с HIPVs, эксперименты были повторены, как указано на рисунке 3, но гусеницы непарного шелкопряда были размещены на HIPV экспонированные и неэкспонированные ветвей внутри каждого летучих камеры коллекции.
г "ALT =" Рисунок 5 "/>
Рисунок 5. После летучих коллекции, образцы вводятся на газовый хроматограф (ГХ) для идентификации и количественного определения летучих излучаемый черники растений.
Рисунок 6. По крайней мере 22 соединений выбрасываются из черники листьев.
Рисунок 7. Типичные хроматографов с неповрежденными листьями черники и листьев поврежденные гусеницами непарного шелкопряда. Летучие вещества выделяются при очень низких количествах из неповрежденных черники листьев. Однако, когда листья поврежденные гусеницами непарного шелкопряда, эмиссия летучих резко возросло.
Рисунок 8. График показывает количество каждого из 22 летучих излучаемый неповрежденные листья, мechanically поврежденных листьях, и листья повреждены гусеницы непарного шелкопряда. Искусственное повреждение имитировать количество листовой поверхности удаляются гусениц увеличился летучих выбросов из черники листья, но ответ был отличаются от летучих ответ листьев до цыганской кормления шелкопряда.
Рисунок 9. Протестировано ли путь JA регулирует летучих выбросов в черника листьев. Растения опрыскивают различными количествами ЗЭЮВ. Я обнаружил, что повышение концентрации экзогенно-прикладного ЗЭЮВ увеличению выбросов летучих из черники листьев.
Рисунок 10. График показывает общее количество летучих излучаемый ветвей контроль черники и из неповрежденных ветвей от непарного шелкопряда поврежденных растений (системный ответ). Летучие вещества были собраны вТаль от 7 дней подряд. Я не нашел системной индукции летучих даже 7 дней после первоначального повреждения нижних ветвей растений.
Рисунок 11. Я использовал родамин-В (красный краситель), чтобы определить степень сосудистые соединения между ветвями внутри черники растений. Я обнаружил, что ок. 80%, 20%, 5% и 0% листьев с ветвей содержащей краситель, ветки прямо над ветки, содержащей краситель, филиалов по всей ветки, содержащей краситель и филиалов, расположенных в различных стрелять в черника завода, соответственно, были полностью окрашивали красителем.
Рисунок 12. График показывает количество летучих излучаемый отраслей подвергается HIPVs и неэкспонированные филиалов. Я обнаружил, что воздействие HIPVs не влияет летучих выбросов в соседнихскучно неповрежденной ветви голубики.
Рисунок 13. График показывает количество кормления гусениц непарного шелкопряда на чернику отраслей подвергается HIPVs и неэкспонированные филиалов. Гусеницы на HIPV, подвергшихся воздействию отраслях потребляется меньшее количество листьев по сравнению с теми, на ветвях не подвергавшихся воздействию.
Рисунок 14. Когда я вычислил интенсивность выбросов на единицу площади потребляется, я обнаружил, что HIPV, подвергшихся воздействию отраслях возросла интенсивность выбросов летучих веществ по сравнению с неэкспонированные отраслей, что свидетельствует о воздействии HIPVs загрунтовать листьев черники ветви увеличился летучих ответ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Двухтактный летучих аппарата коллекции описаны здесь представляет собой стандартный метод для коллекций паровой фазы летучих растительных веществ. Этот аппарат был использован для определения летучих реакция листьев черники herbivory гусеницами непарного шелкопряда, а также позволили мне предоставить новые доказательства роли HIPVs в внутризаводского сигнализации.
Результаты, представленные здесь, показывают, что кормление гусеница, экзогенно-прикладного ЗЭЮВ и механические ранения увеличилось летучих выбросов на месте повреждения, хотя и по-разному. Эти результаты показывают, что путь JA играет ключевую роль в индукции HIPVs в чернике.
HIPV воздействие не вызывает летучих выбросов. Тем не менее, HIPV, подвергшихся воздействию филиалы нацелены на повышение летучих ответ на цыганский кормления шелкопряда. Отвечая на HIPVs увеличением летучих выбросов в отсутствие травоядных может понести экологические, а также физиологических совтс, потому что HIPVs может предоставить недостоверную информацию, чтобы естественные враги травоядных животных. Вместо этого, более адаптивные стратегии может быть для растений к премьер собой за увеличился летучих ответа после контакта с HIPVs. Это увеличило скорость летучих выбросов из HIPV, подвергшихся воздействию листьев может служить косвенным оборону преимущественно привлекают естественных врагов травоядных животных или могут служить непосредственной роли обороны, поскольку некоторые летучие индуцированных непарного шелкопряда в чернике может иметь репелленты воздействие на гусеницах 12.
Таким образом, мои результаты показывают, что выходит из поврежденных ветвей черники передавать информацию с помощью летучих насекомых, которые минимизируют повреждения кормления и премьер летучих выбросов в получении листья смежных отраслей. Эти результаты в сочетании с теми другими предоставлять убедительные доказательства, что HIPVs играть роль в внутризаводского сигнализации и дальнейшей демонстрации многофункциональной роли HIPVs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Мне нечего раскрывать
Acknowledgments
Автор благодарит Роберта Holdcraft для оказания технической помощи. Это исследование финансировалось частично за счет министерства сельского хозяйства США CSREES Специальные Грант (2009-34155-19957) и люк средств (NJ08192).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Volatile collection chambers | Analytical Research Systems, Inc. | VCC-G6X12DT-1P | Gainesville, FL |
| Air compressor, 20 gal, oil free, 2 hp | Westward | 3JR71 | Sold by Grainger, Inc. |
| Air delivery system | Analytical Research Systems, Inc. | VCS-ADS-4AFM4C | Gainesville, FL |
| Air collection system | Analytical Research Systems, Inc. | VCS-MVCS-4CX1P | Gainesville, FL |
| Vacuum pump 100-150V, ¼ hp | Gast Manufacturing, Inc. | 4F740 | Sold by Grainger, Inc. |
| Methyl jasmonate | Sigma-Aldrich | J2500 | St. Louis, MO |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 | St. Louis, MO |
| Rhodamine-B | Sigma-Aldrich | St. Louis, MO | |
| Plastic spray bottles, 2 oz | Setco Inc. | Cranbury, NJ | |
| Spun polyester sleeves | Rockingham Opportunities Corp. | Reidsville, NC | |
| Super-Q volatile collection traps | Analytical Research Systems, Inc. | VCT-1/4X3-SPQ | Gainesville, FL |
| Scion Image Software | Scion Corporation | Frederick, MD | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | St. Louis, MO |
| Gas chromatograph HP 6890 | Hewlett-Packard | ||
| Gas chromatograph Varian 3400 | Varian Inc., Agilent | ||
| n-octane | Sigma-Aldrich | 296988 | St. Louis, MO |
| Mass spectrometer MAT 8230 | Finnigan | San Jose, CA | |
| HP-1 GC column | Agilent Technologies | Palo Alto, CA |
|
| MDN-5S GC column | Supelco, Sigma-Aldrich | Bellefonte, PA |
References
- Dicke, M., Van Loon, J. J. A. Multitrophic effects of herbivore-induced plant volatiles in an evolutionary context. Entomol. Exp. Appl. 97, 237-237 (2000).
- Mumm, R., Dicke, M. Variation in natural plant products and the attraction of bodyguards involved in indirect plant defense. Can. J. Zool. 88, 628-628 (2010).
- Hopke, J. Herbivore-induced volatiles: the emission of acyclic homoterpenes from leaves of Phaseolus lunatus and Zea mays can be triggered by a β-glucosidase and jasmonic acid. FEBS Lett. 352, 146-146 (1994).
- Rodriguez-Saona, C. Behavioral and electrophysiological responses of the emerald ash borer, Agrilus planipennis, to induced volatiles of Manchurian ash, Fraxinus mandshurica. Chemoecology. 16, 75-75 (2006).
- Rodriguez-Saona, C. Herbivore induced volatiles in the perennial shrub, Vaccinium corymbosum, and their role in inter-branch signaling. J. Chem. Ecol. 35, 163-163 (2009).
- Karban, R. Damage-induced resistance in sagebrush: volatiles are key to intra- and interplant communication. Ecology. 87, 922-922 (2006).
- Frost, C. J. Within-plant signalling by volatiles overcomes vascular constraints on systemic signalling and primes responses against herbivores. Ecol. Lett. 10, 490-490 (2007).
- Heil, M., Bueno Silva, J. C. Within-plant signaling by volatiles leads to induction and priming of an indirect plant defense in nature. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5467-5467 (2007).
- Turlings, T. C. Exploitation of herbivore-induced plant odors by host-seeking parasitic wasps. Science. 250, 1251-1251 (1990).
- Makovic, I. Volatiles involved in the nonhost rejection of Fraxinus pennsylvanica by Lymantria dispar larvae. J. Agric. Food Chem. 44, 929-929 (1996).
