蓝莓虫害诱导挥发物和植物内信令

Summary

一个推拉式的方法收集的植物挥发是描述。该方法允许草食动物喂食，外源茉莉酸甲酯和机械损伤诱导挥发物的比较。这种技术也被用于调查从蓝莓植物内的虫害损坏分行接触到挥发物的挥发反应完好的分支机构。

Abstract

虫害诱导植物挥发物（HIPVs）通常发出的从植物，草食动物攻击^后 1,2 。这些HIPVs都主要受防守的植物激素茉莉酸（JA）和其挥发衍生茉莉酸甲酯（茉莉酸甲酯^）3,4,5 。在过去的三十年中，研究人员已经证明，HIPVs可以排斥或吸引食草动物，吸引食草动物的天敌，在某些情况下，他们可诱发或草食动物攻击前总理植物防御。在最近的一篇论文^6，我报，饲喂舞毒蛾的毛虫，外源茉莉酸甲酯的应用，以及机械损伤，诱发蓝莓植物挥发物的排放量，尽管不同的。此外，蓝莓分行从同一工厂邻近分行排放的增加JA和抗食草动物（即直接植物的防御）水平HIPVs，吸挥发性排放（​​即间接植物防御）。类似的发现ings报道，近日已对杨树山艾树^7，8，和利马豆⁹ ..

在这里，我描述了一个推拉式的方法，收集舞毒蛾（草食动物）喂养，外源茉莉酸甲酯的应用，和机械损伤引起的蓝莓挥发物。挥发的收集装置由一个4升的挥发性收集室，2件断头台，净化进气空气输送系统，真空系统连接到一个充满陷阱与超级Q值吸附剂收集^挥发物5,6,10 。在超级- Q陷阱收集的挥发物用二氯甲烷洗脱，然后用气相色谱（GC）分离和量化。这个动荡的收集方法是使用ñ我的研究调查内蓝莓植物虫害损坏分行完好的分支机构接触到挥发物的挥发反应。这里将介绍这些方法。简言之，完好的蓝莓分行暴露HIPVs来回邻近的分行在同一个工厂的米。使用上述相同的方法，从暴露后，以HIPVs分行排放的挥发性物质的收集和分析。

Protocol

1。本地诱导挥发物：草食性损伤

1. 二级分行的蓝莓植物袋装与涤纶套。
2. 六舞毒蛾的毛虫^（2日-3 ^路龄）放在内袋，并允许挥发收集前2天的植物饲料。对照植株没有收到任何的毛毛虫。
3. 挥发性排放收集3天（图1）如下所述（协议＃7）。聚酯袖子留在植物上，以防止昆虫逃跑。

2。本地诱导挥发物：机械损伤

1. 机械损伤对植物造成冲孔模仿叶面积舞毒蛾删除。
2. 百分之五植物叶片受伤位于在1和2天的月底的基础和叶的上部有两个7毫米的孔。对照处理没有收到机械性损伤。

3。本地诱导挥发物：茉莉酸甲酯

1. 蓝莓植物用10毫升1或1.5毫米的茉莉酸甲酯在0.1％Tween - 20的解决方案解决方案。
2. 茉莉酸甲酯应用使用2盎司的喷雾瓶。对照植株喷洒10毫升0.1％Tween - 20的解决方案。
3. 植物被视为在16:00小时，并在温室中保存15小时内一个直径为17厘米和35厘米高的有机玻璃室前挥发集合。
4. 挥发性排放，收集，如下所述。

4。系统性诱导挥发物：内部信号

1. 较低的一个蓝莓植物的分支，是袋装一个涤纶套和内袋放置六^（2日^-3路龄）吉普赛蛾的损坏。
2. 损坏的分支，挥发收集室以外的，而brancheS是上述损坏的分支放在箱内（ 图2）。
3. 毛毛虫饲料上2天的底部分支。
4. 在第3天开始，收集从完好的部分损坏的植物挥发物。
5. 连续7天收集挥发。控制植物都以类似的方式处理，但没有收到草食动物损害。

5。血管连接

1. 本研究确定的血管连接在蓝莓植物的不同部门之间的程度。
2. 从植物中较低的分支部分切断支持花露水挑一个罗丹明B（Sigma - Aldrich公司），染料（0.25％W / V）Orians等，含6 mL的溶液。
3. 通过植物染料的运动是每天监测7天。
4. 经过7天，红染色的金额是视觉评估来自不同岗位的植物。

6。曝光HIPVs：外部信号

1. 工厂内一个分支是从相邻的分支HIPVs或收到没有接触到HIPVs。
2. 为了揭露分行HIPVs，一个较低的分支袋装聚酯袖舞毒蛾的毛虫放在内袋（ 图3）和六^（2日^-3路龄） 。
3. 该工厂是一个类似上述的有机玻璃室内笼。昆虫饲料植物为2天，从诱导分支排放的挥发性物质接触到相邻的分支。
4. （3天）曝光后，暴露分行放在挥发收集室，留下的昆虫受伤的分支外（ 如图2所示） 。
5. HIPV暴露分行挥发性物质的收集，如下所述，从较低的分支消耗的叶面积量测使用接穗图像Softwa重。

7。暴露到HIPVs：吸

1. 要确定植物是否“底漆”HIPV曝光后，植物被视为在协议＃5。
2. 一半的植物暴露诱导相邻的分支HIPVs;而另一半是裸露完好的分支机构。
3. 在第3天，四早2 ^届龄舞毒蛾幼虫放在每个工厂和挥发物收集如下所述（ 图4）。
4. 挥发后集合，最初叶损坏舞毒蛾的毛虫，以及那些在第3天损坏，切除，测量叶面积消耗的金额。

8。挥发物的收集

1. HIPV排放量进行采样，在使用推拉式系统的温室。盆栽植物的地上部分（干，枝，叶），包括在草食动物损伤治疗的毛毛虫，被放在一个4大号VOLA瓦收集室。 2件断头台支持植物的基地。净化后的空气进入每个室顶部在2升/分钟的速度。
2. 挥发物收集在充满奥特奇超级Q值吸附剂拉分庭在1 L / min的的速率空气30毫克的陷阱。
3. 挥发性收集装置由四个腔室，允许同时从四个不同的植物（图1）的挥发性物质的集合。
4. 集合进行白天09:00至17:00小时
5. 收集后，所有从植物叶子收获，烘箱干燥，在60 ° C，并称重，以及商会是用自来水和70％的乙醇冲洗。

9。挥发物的分析

1. 从超级Q值陷阱收集的挥发物被洗脱二氯甲烷（150μL）和400 N -辛烷值吴是作为内部标准添加。
2. 在惠普6890系列化合物的分离和量化气相色谱仪（GC）（图5），配备火焰离子化检测器（FID）和安捷伦的HP - 1柱（10 × 0.53毫米× 2.65微米），并使用他作为载气（恒流量= 5毫升/分钟，速度= 39厘米/秒）。温度程序开始在40 °彗星保持1分钟，同比增长在14 ° C /分钟至180 ° C（2分钟），然后在40 ° C /分钟至200 ° C，并保持在200 ° C为2分钟。
3. 作为载气耦合到一个Finnigan公司MAT 8230质谱仪（MS）在Varian 3400气相色谱法，配有一个Supelco公司的MDN - 5S柱（30米× 0.32毫米× 0.25微米），并与他进行了初步鉴定化合物。 MS的电子电离（EI）和总离子流图（TIC）模式运作，在250 ° C（源温度）。该计划开始于35℃（1分钟），增加在4 ° C /分钟至170 ° C，然后在15 ° C /分钟至280 ° C。
4. 与NIST谱库和B的光谱数据进行比较，初步确定化合物Ÿ气相色谱保留指数，并通过比较与市售的化合物的保留时间。

10。代表性的成果：

第二十二条挥发物确定了从蓝莓叶（ 图6）。图7显示了一个完好的蓝莓叶代表色谱仪和叶饲养舞毒蛾损坏。机械损伤和舞毒蛾的毛虫喂养增加蓝莓叶挥发性物质排放的本地控制（ 图8） 。卡特彼勒喂养相比，茉莉酸甲酯处理诱导11舞毒蛾（ 图9）诱导的17个化合物。有，但是，没有完好的叶舞毒蛾损坏投饵损害（即缺乏内部信号）（ 图10）后七天植物的系统性诱导挥发物的证据。此外，一个星期后，非常缓慢移动红色染料中观察到的蓝莓植物的分支（ 图11） 。有高血管单支叶片之间的连接。然而，在拍摄垂直排列的两个分支，和上一拍两侧的两个分支之间的低连接之间的连接，中间低。

有没有分行的暴露不暴露HIPVs（ 图12）与那些HIPVs排放的挥发性物质的金额之间的差异。然而，HIPVs作为蓝莓中的外部防御信号。舞毒蛾喂毛毛虫在树叶上以前暴露消耗少叶71％的材料比那些未曝光的控制叶片（ 图13）美联储HIPVs 。此外，每排放量叶面积HIPV暴露的分支消耗的挥发物的数额相比，未曝光的分支（图14）高4倍，这表明，叶HIPV - EX构成分支机构，更加适应草食动物（即他们是催芽）。

图1。推挽系统是用来收集来自蓝莓植物的挥发物。植物放在玻璃商会和清新的空气是通过对它们的。含有吸附材料的过滤器是连接到每个室的一侧，从工厂排放的陷阱挥发物。真空是用来拉腔内部空气通过过滤器。

图2，研究的系统性蓝莓植物挥发反应，降低蓝莓分行损坏，舞毒蛾毛虫（右室）或左（左完好无损室） 。经过2天（3天），从完好的上部分支损坏和完好的植物挥发物收集。

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图3，为了测试是否完好的树枝叶回应HIPVs从损坏的分支，我袋装蓝莓植物的一个分支。然后，我一半的植物袋放在舞毒蛾的毛虫。袋我用允许的挥发物从内到外袋的运动。植物放在有机玻璃商会揭露完好的分支机构HIPVs。然后收集挥发物暴露的分支。

图4为了测试是否完好的树枝叶“底漆”暴露后，以HIPVs，实验重复在图3中描述，但吉普赛蛾的HIPV暴露和未暴露分行放在每个挥发收集室。

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图5。挥发后的集合，样品注射到气相色谱仪（GC）的确定和量化，从蓝莓植物排放的挥发性。

图6，至少有22个化合物排放蓝莓叶。

从完好的蓝莓典型色谱图7。叶片和叶吉普赛蛾的损坏。挥发物排放量非常低，从完好的蓝莓叶。然而，当叶子是吉普赛蛾的损坏，挥发物排放量急剧增加。

图8图表显示完好的树叶，米22挥发物排放量。echanically损坏叶片，叶舞毒蛾的毛虫损坏。人为损坏模仿毛虫删除的叶面积增加了从蓝莓叶挥发排放，但叶舞毒蛾喂养的挥发性反应不同的反应。

图9：测试是否JA途径调节蓝莓叶的挥发排放。茉莉酸甲酯不同的植物进行喷洒。我发现，外生的应用茉莉酸甲酯浓度的增加增加了从蓝莓叶挥发物的排放。

图10：图表显示挥发物的排放控制蓝莓分行和舞毒蛾损坏植物（全身反应）完好无损分行的总金额。挥发物被收集到连续7天的TAL。我发现后，初始伤害，降低分支机构的植物不挥发物，甚至7天的全身感应。

图11，我用罗丹明B（红色染料），以确定蓝莓植物内分支机构之间的血管连接程度。我发现，约。叶含有染料的分支机构的80％，20％，5％和0％，直接以上含有染料，整个含染料的分支的分支，和在不同的拍摄在蓝莓植物分行遍布的分支的分支，分别是完全与染料染色。

图12。图表显示暴露HIPVs和未分支的分支排放的挥发性物质的量。我发现，接触到HIPVs没有影响邻居的挥发性排放枯燥完好的蓝莓分行。

图13：图表显示暴露HIPVs和未分公司蓝莓分行的吉普赛蛾的喂养量。分行HIPV暴露的毛毛虫消耗少，枝叶量，与那些未曝光的分支机构。

图14，当我计算每消耗领域的排放率，我发现HIPV，暴露分行增加了挥发物的排放率比未曝光的分支机构，这表明，暴露于通货膨胀蓝莓树枝叶HIPVs增加的挥发性反应。

Discussion

这里描述的推挽挥发收集仪器代表了植物挥发物的顶空集合的标准方法。该仪器是用来确定由吉普赛蛾的草食动物蓝莓叶挥发响应，也让我HIPVs在工厂内信号的作用提供新的证据。

本文结果表明，卡特彼勒喂养，外生的应用茉莉酸甲酯，机械伤人增加损害的部位虽然不同，但挥发性排放。这些结果表明，JA途径中起着关键作用，在诱导蓝莓HIPVs。

HIPV暴露没有引起挥发性排放。然而，HIPV暴露的分支催芽增加挥发性舞毒蛾喂养。响应挥发性排放增加草食动物的情况下，以HIPVs以及可能招致的生态生理COSTS，因为HIPVs可能提供不可靠的信息，食草动物的天敌。相反，适应性更强的策略可能是植物总理为自己增加后，接触到HIPVs的挥发性响应。这从HIPV暴露叶的挥发排放率增加，可能会作为一个间接防御优先吸引食草动物的天敌，或可能成为自吉普赛蛾在蓝莓诱导挥发物可以有驱蚊效果^上的毛毛虫12直接的防御作用。

总之，我的结果表明，叶片损坏蓝莓分行通过昆虫喂养损坏和总理在相邻的分支机构接收叶挥发性排放的挥发性物质，最大限度地减少传输的信息。由他人结合这些结果提供了有力的证据，HIPVs在工厂内信令发挥的作用，进一步展示HIPVs多功能的作用。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Volatile collection chambers	Analytical Research Systems, Inc.	VCC-G6X12DT-1P	Gainesville, FL
Air compressor, 20 gal, oil free, 2 hp	Westward	3JR71	Sold by Grainger, Inc.
Air delivery system	Analytical Research Systems, Inc.	VCS-ADS-4AFM4C	Gainesville, FL
Air collection system	Analytical Research Systems, Inc.	VCS-MVCS-4CX1P	Gainesville, FL
Vacuum pump 100-150V, ¼ hp	Gast Manufacturing, Inc.	4F740	Sold by Grainger, Inc.
Methyl jasmonate	Sigma-Aldrich	J2500	St. Louis, MO
Tween-20	Sigma-Aldrich	93773	St. Louis, MO
Rhodamine-B	Sigma-Aldrich		St. Louis, MO
Plastic spray bottles, 2 oz	Setco Inc.		Cranbury, NJ
Spun polyester sleeves	Rockingham Opportunities Corp.		Reidsville, NC
Super-Q volatile collection traps	Analytical Research Systems, Inc.	VCT-1/4X3-SPQ	Gainesville, FL
Scion Image Software	Scion Corporation		Frederick, MD
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997	St. Louis, MO
Gas chromatograph HP 6890	Hewlett-Packard
Gas chromatograph Varian 3400	Varian Inc., Agilent
n-octane	Sigma-Aldrich	296988	St. Louis, MO
Mass spectrometer MAT 8230	Finnigan		San Jose, CA
HP-1 GC column	Agilent Technologies		Palo Alto, CA
MDN-5S GC column	Supelco, Sigma-Aldrich		Bellefonte, PA