Herbívoro induzida Voláteis Blueberry e planta-Intra Sinalização

Summary

Um método push-pull para a recolha de voláteis de plantas é descrito. O método permite uma comparação dos voláteis induzidos pela alimentação herbívora, metil-jasmonato exógena, e danos mecânicos. Esta técnica também é usada para investigar a resposta volátil dos galhos danificados à exposição a substâncias voláteis a partir de ramos herbívoras danificados dentro de plantas de mirtilo.

Abstract

Voláteis herbívoro induzida por planta (HIPVs) são comumente emitidos a partir de plantas após ^1,2 ataque de herbívoros. Estes são principalmente HIPVs regulamentada pela defensiva ácido jasmônico hormônio vegetal (JA) e seu metil-jasmonato voláteis derivativos (MeJA) ^3,4,5. Nos últimos três décadas pesquisadores têm documentado que HIPVs pode repelir ou atrair herbívoros, atraem os inimigos naturais de herbívoros e, em alguns casos podem induzir ou defesas de plantas prime antes do ataque de herbívoros. Em um recente artigo ^6, I informou que a alimentação por lagartas da mariposa, a aplicação exógena MeJA e danos mecânicos induzem as emissões de compostos voláteis de plantas de mirtilo, embora de forma diferente. Além disso, ramos de mirtilo responder a HIPVs emitida a partir de ramos vizinhos da mesma planta, aumentando os níveis de JA e resistência a herbívoros (ou seja, as defesas de plantas direto) e pelas emissões priming volátil (isto é, as defesas de plantas indiretos). Similar encontrarSeres têm sido relatados recentemente para sagebrush ^{7, 8} álamo, e feijão ⁹ ..

Aqui, eu descrevo um método push-pull para coletar voláteis blueberry induzida por herbívoros (mariposa cigana) de alimentação, aplicação MeJA exógena, e danos mecânicos. A unidade de recolha volátil consiste de uma câmara de coleta 4 L volátil, uma guilhotina de 2 peças, um sistema de entrega de ar que purifica o ar que entra, e um sistema de vácuo conectada a uma armadilha cheia de Super-Q adsorvente para coletar voláteis ^5,6,10 . Voláteis coletadas em Super-Q armadilhas são eluídos com diclorometano e depois separados e quantificados por cromatografia gasosa (GC). Este método de coleta de voláteis foi usada n meu estudo de ⁶ a investigar a resposta volátil dos galhos danificados à exposição a substâncias voláteis a partir de ramos herbívoras danificados dentro de plantas de mirtilo. Estes métodos são descritos aqui. Brevemente, sem danos ramos de mirtilo estão expostos a HIPVs from ramos vizinhos dentro da mesma planta. Usando as mesmas técnicas descritas acima, voláteis emitidos a partir de ramos após a exposição ao HIPVs são coletados e analisados.

Protocol

1. Indução locais de voláteis: danos herbívoro

1. Dois ramos de plantas de mirtilo são ensacados com uma luva de poliéster fiado.
2. Seis lagartas da mariposa ⁽² º -3 ^º ínstares) são colocados dentro dos sacos e permitiu que se alimentar de plantas durante 2 dias antes da coleta de voláteis. Plantas controle não recebem qualquer lagartas.
3. Emissões voláteis são coletados como descrito abaixo (protocolo n º 7) no 3 º dia (Figura 1). Mangas de poliéster permanecem nas plantas para evitar a fuga dos insetos.

2. Indução locais de voláteis: danos mecânicos

1. Danos mecânicos às plantas é causado por perfuração buracos para imitar a quantidade de área foliar removida por mariposa cigana.
2. Cinco folhas por planta são feridos com dois furos de 7 mm, localizada na base e parte superior das folhas no final do dia 1 e 2. O tratamento controle não recebe danos mecânicos.

3. Indução locais de voláteis: MeJA

1. Mirtilo plantas são tratadas com 10 mL de uma solução a 1 mM ou 1,5 de MeJA em uma solução a 0,1% Tween-20.
2. MeJA é aplicada através de um 2-oz spray. Plantas controle são pulverizadas com 10 mL de uma solução a 0,1% Tween-20.
3. As plantas são tratadas às 16:00 hr, e mantidos na estufa por 15 horas dentro de um diâmetro de 17 cm e 35 cm de câmara de Plexiglas alta antes de coleções volátil.
4. Emissões voláteis são coletados conforme descrito abaixo.

4. Indução sistêmica de voláteis: sinalização interna

1. A menor ramo de uma planta de mirtilo é ensacado com uma luva de poliéster fiado e danificado, colocando seis ⁽² º -3 ^º ínstares) lagartas mariposa cigana dentro do saco.
2. O ramo danificado continua fora da câmara de coleta volátil, enquanto o branches acima do ramo danificado são colocados no interior da câmara (Figura 2).
3. Lagartas são permitidos para se alimentar no ramo de fundo para dois dias.
4. Começando no dia 3, voláteis são coletados a partir da porção intacta de plantas danificadas.
5. Voláteis são coletados durante 7 dias consecutivos. Plantas controle são tratados de forma semelhante, mas não receberam danos herbívoro.

5. Conectividade Vascular

1. Este estudo determinou o grau de conectividade vascular entre os diferentes ramos dentro de uma planta de mirtilo.
2. A parte final de um ramo inferior de uma planta é cortada para apoiar uma pick água floral contendo 6 mL de uma solução de Rodamina B (Sigma-Aldrich) corante (0,25% w / v), conforme descrito no Orians et al ^11.
3. Movimento do corante através da planta é monitorada diariamente por sete dias.
4. Após 7 dias, a quantidade de coloração vermelha é avaliada visualmente a partir de posições diferentes da planta.

6. Exposição a HIPVs: sinalização externa

1. Ramos dentro de uma planta ou são expostas a partir de um ramo de HIPVs adjacentes ou não receberam a exposição a HIPVs.
2. Para expor ramos para HIPVs, um ramo inferior é ensacado com uma luva de poliéster e seis (2 ^ª instares -3 ^º) lagartas mariposa cigana são colocados dentro de sacos (Figura 3).
3. A planta é enjaulado dentro de uma câmara Plexiglas semelhantes aos descritos acima. Insetos podem se alimentar de plantas durante 2 dias, de modo que ramos adjacentes estão expostos a voláteis emitidos do ramo induzido.
4. Após a exposição (dia 3), ramos expostos são colocados dentro da câmara de coleta volátil, deixando de fora ramo insetos feridos (como visto na Figura 2).
5. Voláteis da HIPV expostas ramos são recolhidos, conforme descrito abaixo, ea quantidade de área foliar consumida do ramo inferior são medidos usando Scion Image Software.

7. Exposição a HIPVs: priming

1. Para determinar se as plantas são "preparados" após a exposição HIPV, as plantas são tratadas como no protocolo n º 5.
2. Metade das plantas estão expostas a partir de um ramo de HIPVs induzida adjacentes, enquanto a outra metade é exposto a galhos danificados.
3. No dia 3, quatro primeiros ² º ínstar as lagartas mariposa cigana são colocados em cada planta e voláteis são coletados como descrito abaixo (Figura 4).
4. Depois de coleções voláteis, folhas danificadas por lagartas inicialmente da mariposa, assim como aqueles que estão danificados no dia 3, são excisadas e as quantidades de consumo de área foliar são medidos.

8. Coleta de voláteis

1. Emissões HIPV são amostrados na estufa usando um sistema push-pull. A parte acima do solo de vasos de plantas (tronco, galhos e folhas), incluindo lagartas no tratamento danos herbívoro, são colocados dentro de uma 4 L volacâmara de coleta de azulejos. A guilhotina de 2 peças suporta a base de plantas. Ar purificado entra no topo de cada câmara a uma taxa de 2 L / min.
2. Voláteis são recolhidos em armadilhas cheias de 30 mg de Alltech Super-Q adsorvente puxando ar das câmaras a uma taxa de 1 L / min.
3. O aparelho coleta de voláteis é composto por quatro câmaras, permitindo coletas simultâneas de compostos voláteis de quatro plantas diferentes (Figura 1).
4. Coleções são realizados durante o dia 9:00-17:00 h.
5. Após a coleta, todas as folhas das plantas são colhidas, secas em estufa a 60 ° C, e pesadas, e as câmaras são lavados com água de torneira e etanol 70%.

9. Análise de compostos voláteis

1. Os voláteis coletadas de Super-Q armadilhas são eluídos com diclorometano (150 mL) e 400 ng de n-octano é adicionado como padrão interno.
2. Separação e quantificação de compostos é feita em uma impressora Hewlett Packard 6890 SeriesCromatógrafo a Gás (GC) (Figura 5), ​​equipado com um detector de ionização de chama (FID) e uma Agilent HP-1 coluna (10 mx 0,53 milímetros x 2,65 mm), e usando como Ele gás portador (fluxo constante = 5 ml / min , velocidade = 39 cm / seg). O programa começou a temperatura a 40 ° C mantida por 1 min, aumentou em 14 ° C / min a 180 ° C (2 min), depois a 40 ° C / min até 200 ° C, e mantidos a 200 ° C por 2 min .
3. Identificação tentativa de compostos é realizada em um GC Varian 3400 acoplado a um espectrômetro de massa Finnigan MAT 8230 (MS), equipado com uma coluna Supelco MDN-5S (30 mx 0,32 mm x 0,25 mm), e com Ele como gás de transporte. O MS é operado em ionização de elétrons (EI) e total de íons modo cromatograma (TIC) em 250 ° C (temperatura da fonte). O programa foi iniciado a 35 ° C (1 min), aumentou a 4 ° C / min a 170 ° C, em seguida, a 15 ° C / min a 280 ° C.
4. Compostos são tentativamente identificados por comparação dos dados espectrais com os da biblioteca NIST e by índice de retenção GC, e comparando seus tempos de retenção com os de compostos disponíveis comercialmente.

10. Resultados representativos:

Vinte e dois compostos voláteis foram identificados a partir de folhas de mirtilo (Figura 6). Figura 7 mostra um cromatógrafo representante de folhas de mirtilo em bom estado e folhas danificadas pela alimentação de mariposa cigana. Danos mecânicos e alimentação por lagartas mariposa cigana aumento das emissões de compostos voláteis localmente a partir de folhas de mirtilo comparados aos controles (Figura 8). Em comparação com a alimentação da lagarta, o tratamento MeJA induzida 11 dos 17 compostos induzida pela mariposa cigana (Figura 9). Houve, no entanto, nenhuma evidência de indução sistêmica de compostos voláteis das folhas não danificadas do gypsy moth-danificados plantas sete dias após o dano inicial de alimentação (ou seja, a falta de sinalização interna) (Figura 10). Além disso, após uma semana, muito lento movimentomento do corante vermelho foi observada entre os ramos de plantas de mirtilo (Figura 11). Houve alta conectividade vascular entre as folhas dentro de um único ramo. No entanto, houve intermediário a baixa conectividade entre os dois ramos alinhados verticalmente dentro de um tiro, e baixa conectividade entre os dois ramos em lados opostos de um tiro.

Não houve diferença entre os montantes dos voláteis emitidos a partir de ramos expostos a HIPVs versus os não expostos ao HIPVs (Figura 12). No entanto, HIPVs atuar como um sinal externo de defensivos em blueberries. Lagartas da mariposa alimentado com folhas previamente expostas ao HIPVs consumido material da folha 71% menor que aqueles alimentados com o controle não exposto folhas (Figura 13). Além disso, as quantidades de compostos voláteis emitidos por quantidade de área foliar consumida em HIPV-ramos foram expostos quatro vezes maior em comparação com ramos não expostos (Figura 14), indicando que deixa de HIPV ex- ramos foram colocados mais responsivos a herbivoria (isto é, eles foram preparados).

Figura 1. Um sistema push-pull é usado para coletar voláteis de plantas de mirtilo. As plantas são colocadas dentro de câmaras de vidro e ar limpo é passado sobre eles. Um filtro contendo um material adsorvente foi anexado ao lado de cada câmara para voláteis emitidos armadilha da planta. Um vácuo é usado para puxar o ar do interior da câmara através do filtro.

Figura 2. Para estudar a resposta sistêmica voláteis de plantas de mirtilo, blueberry ramos mais baixos eram danificadas por lagartas da mariposa (câmara de direito) ou (câmara de esquerda) não danificadas esquerda. Depois de 2 dias (no dia 3), a partir de compostos voláteis não danificadas ramos superiores das plantas danificadas e não danificadas foram coletadas.

ONTEÚDO ">
Figura 3. Para testar se as folhas dos galhos danificados responder a HIPVs de ramos danificados, eu ensacados um dos ramos em cada uma das plantas de mirtilo. Eu, então, colocado lagartas mariposa cigana dentro dos sacos de metade das plantas. Os sacos Eu costumava permitir o movimento de voláteis de dentro para fora dos sacos. As plantas foram colocadas dentro de câmaras de Plexiglas para expor ramos sem danos para HIPVs. Voláteis foram coletados a partir de galhos expostos.

Figura 4. Para testar se as folhas de ramos danificados são "preparados" após a exposição ao HIPVs, experimentos foram repetidos como descrito na Figura 3, mas lagartas mariposa cigana foram colocados em HIPV-expostos e não expostos ramos dentro de cada câmara de coleta volátil.

g "alt =" Figura 5 "/>
Figura 5. Depois de coleções voláteis, as amostras são injetadas em um cromatógrafo a gás (GC) para identificar e quantificar os voláteis emitidos por plantas de mirtilo.

Figura 6. Pelo menos 22 compostos são emitidos a partir de folhas de mirtilo.

Figura 7. Cromatógrafos típica de blueberry sem danos folhas e folhas danificadas por lagartas mariposa cigana. Voláteis são emitidos em quantidades muito baixas de folhas sem danos blueberry. No entanto, quando as folhas estão danificadas por lagartas mariposa cigana, a emissão de voláteis aumentou dramaticamente.

Figura 8. O gráfico mostra os montantes de cada um dos 22 compostos voláteis emitidos pelas folhas não atacadas, mechanically-danificados folhas e folhas danificadas por lagartas mariposa cigana. Danos artificiais para imitar a quantidade de área foliar removida por lagartas aumento de emissões voláteis das folhas de mirtilo, mas a resposta foi diferente da resposta voláteis de folhas para alimentação mariposa cigana.

Figura 9. Testado se o caminho JA regula emissão de voláteis em folhas de mirtilo. As plantas foram pulverizadas com diferentes quantidades de MeJA. Descobri que concentrações crescentes de exógena aplicada MeJA aumento das emissões de compostos voláteis de folhas de mirtilo.

Figura 10. O gráfico mostra a quantidade total de compostos voláteis emitidos a partir de ramos de mirtilo e controle de ramos danificados a partir de plantas da mariposa danificado (resposta sistêmica). Voláteis foram coletados por um atal de 7 dias consecutivos. Eu não encontrei nenhuma indução sistêmica de compostos voláteis até 7 dias após o dano inicial de galhos mais baixos das plantas.

Figura 11. Usei rodamina-B (corante vermelho) para determinar o grau de conectividade entre os ramos vascular nas plantas de mirtilo. Descobri que aprox. 80%, 20%, 5% e 0% de folhas de ramos contendo o corante, ramos diretamente acima do ramo que contém o corante, filiais em todo o ramo que contém corante, e sucursais situadas em um tiroteio diferentes dentro de uma planta de mirtilo, respectivamente, foram totalmente coradas com o corante.

Figura 12. O gráfico mostra a quantidade de compostos voláteis emitidos a partir de ramos expostos a ramos HIPVs e não expostos. Eu achei que a exposição a HIPVs não afetou as emissões voláteis em neighchato ramos de mirtilo sem danos.

Figura 13. O gráfico mostra a quantidade de alimentação por lagartas da mariposa em ramos de mirtilo expostos a ramos HIPVs e não expostos. Lagartas em HIPV expostas ramos consumiram menos quantidade de folhagem em comparação com aqueles em ramos não expostos.

Figura 14. Quando eu calculada a taxa de emissão por unidade de área consumida, descobri que HIPV expostas ramos tinham aumentado as taxas de emissão de compostos voláteis em comparação com ramos não impressionados, indicando que a exposição a HIPVs preparado folhas em ramos de mirtilo para uma resposta aumentada volátil.

Discussion

O push-pull aparelho de coleta de voláteis descrito aqui representa um método padrão para coleções headspace de voláteis de plantas. Este aparelho foi utilizado para determinar a resposta voláteis de folhas de mirtilo à herbivoria por lagartas mariposa cigana e também me permitiu fornecer novas evidências para o papel de HIPVs na planta intra-sinalização.

Os resultados aqui apresentados mostram que a alimentação da lagarta, exógena aplicada MeJA, mecânicos e ferindo aumento das emissões de voláteis no local do dano, ainda que de forma diferente. Estes resultados indicam que o caminho JA desempenha um papel fundamental na indução de HIPVs em blueberries.

HIPV exposição não induziu as emissões voláteis. Ramos no entanto, HIPV expostas foram preparados para um aumento da resposta volátil à alimentação mariposa cigana. Respondendo a HIPVs por um aumento nas emissões de voláteis na ausência de herbívoros pode incorrer ecológica, bem como cos fisiológicasts, porque HIPVs pode fornecer informações confiáveis ​​para os inimigos os herbívoros 'natural. Em vez disso, uma estratégia mais adaptativa pode ser para as plantas prime-se para um aumento da resposta volátil após a exposição ao HIPVs. Este aumento da taxa de emissão de voláteis de HIPV expostas as folhas podem servir como uma defesa indireta por preferencialmente atrair os inimigos naturais de herbívoros ou possam vir a desempenhar um papel de defesa direta desde voláteis induzidos por vários mariposa cigana em blueberries pode ter efeitos repelentes sobre lagartas ^12.

Em resumo, os meus resultados mostram que as folhas de ramos de mirtilo danificado transmitir informações através de compostos voláteis que minimizam os danos de alimentação do inseto e prime emissões voláteis nas folhas recebimento de ramos adjacentes. Estes resultados combinados com os de outros fornecem fortes evidências de que HIPVs desempenhar um papel na planta-intra sinalização e demonstrar ainda mais os papéis multi-funcionais de HIPVs.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Volatile collection chambers	Analytical Research Systems, Inc.	VCC-G6X12DT-1P	Gainesville, FL
Air compressor, 20 gal, oil free, 2 hp	Westward	3JR71	Sold by Grainger, Inc.
Air delivery system	Analytical Research Systems, Inc.	VCS-ADS-4AFM4C	Gainesville, FL
Air collection system	Analytical Research Systems, Inc.	VCS-MVCS-4CX1P	Gainesville, FL
Vacuum pump 100-150V, ¼ hp	Gast Manufacturing, Inc.	4F740	Sold by Grainger, Inc.
Methyl jasmonate	Sigma-Aldrich	J2500	St. Louis, MO
Tween-20	Sigma-Aldrich	93773	St. Louis, MO
Rhodamine-B	Sigma-Aldrich		St. Louis, MO
Plastic spray bottles, 2 oz	Setco Inc.		Cranbury, NJ
Spun polyester sleeves	Rockingham Opportunities Corp.		Reidsville, NC
Super-Q volatile collection traps	Analytical Research Systems, Inc.	VCT-1/4X3-SPQ	Gainesville, FL
Scion Image Software	Scion Corporation		Frederick, MD
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997	St. Louis, MO
Gas chromatograph HP 6890	Hewlett-Packard
Gas chromatograph Varian 3400	Varian Inc., Agilent
n-octane	Sigma-Aldrich	296988	St. Louis, MO
Mass spectrometer MAT 8230	Finnigan		San Jose, CA
HP-1 GC column	Agilent Technologies		Palo Alto, CA
MDN-5S GC column	Supelco, Sigma-Aldrich		Bellefonte, PA