Summary
Bitki uçucu toplamak için bir itme-çekme yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem, otçul beslenme, eksojen metil jasmonate ve mekanik hasar kaynaklanan uçucu bir karşılaştırma için sağlar. Bu teknik aynı zamanda yaban mersini bitkileri içinde hasarlı dalları otobur uçucu için maruz hasarsız şube uçucu yanıtını araştırmak için kullanılır.
Abstract
Otobur kaynaklı bitki uçucu (HIPVs) yaygın otobur saldırı 1,2 sonra bitkilerden yayılan. Bu HIPVs ağırlıklı olarak savunma bitki hormonu Jasmonik asit (JA) ve uçucu türev metil jasmonate (Meja) 3,4,5 tarafından düzenlenir. Son 3 yılda araştırmacılar içinde püskürtmek veya HIPVs çekmek otobur, otçul doğal düşmanları çekmek ve bazı durumlarda otobur saldırı öncesinde tetikleyebilir ya da asal bitki savunma olduğunun belgelenmesi var. Son bir kağıt 6, çingene güvesi tırtıllar, eksojen Meja uygulama, ve mekanik hasar farklı olsa da, yaban mersini bitkiler uçucu emisyon neden bu besleme bildirdi . Buna ek olarak, yaban mersini dalları, JA ve otobur (yani, doğrudan bitki savunması) direnç seviyelerini artırarak komşu aynı bitki dalları yayılan HIPVs ve priming uçucu emisyon (yani, dolaylı bitki savunmaları). Bulmak Benzerbulgular adaçayı 7, kavak 8 ve lima fasulye 9 bildirilmiştir ..
Burada, otobur (çingene güvesi) beslenme, eksojen Meja uygulaması ve mekanik hasarlara yol açtığı yaban mersini uçucu toplamak için bir itme-çekme yöntemi açıklar. Uçucu toplama ünitesi, 4 L uçucu toplama odası, 2-parçalı giyotin gelen hava arındırır bir hava dağıtım sistemi ve uçucu 5,6,10 toplamak için Super-Q adsorban ile dolu bir tuzak bağlı bir vakum sistemi oluşur . Super-Q tuzakları toplanan uçucu diklorometan ile yıkandı ve sonra ayrılmış ve Gaz Kromatografisi (GC) kullanılarak kantitatif. Bu uçucu toplama yöntemi, yaban mersini bitkileri içinde hasarlı dalları otobur hasarsız şube uçucu için maruz uçucu yanıt araştırmak için kullanılır n benim çalışma 6 oldu . Bu yöntemler aşağıda açıklanmıştır. Kısaca, hasarsız yaban mersini dalları fro HIPVs maruzm aynı tesis içinde komşu dalları. Yukarıda açıklanan aynı teknikleri kullanarak, HIPVs için maruz kaldıktan sonra dallarından yayılan uçucu toplanır ve analiz edilir.
Protocol
1. Uçucu Yerel indüksiyon: otobur zarar
- Yaban mersini bitkilerin iki şubesi spun polyester kol ile Torbalı.
- Altı çingene güvesi tırtıllar (2. -3 üncü instars) çanta içine yerleştirilen ve uçucu toplama öncesinde 2 gün boyunca bitkiler üzerinde beslemek için izin verilir. Kontrol bitkiler herhangi bir tırtıllar almıyorsunuz.
- Uçucu emisyonları gün 3 (Şekil 1) (protokol # 7) aşağıda anlatıldığı gibi toplanır. Polyester kollu kaçan böcekleri önlemek için bitkiler üzerinde kalır.
2. Uçucu Yerel indüksiyon: mekanik hasar
- Bitkilere mekanik hasar, yaprak alanı miktarını çingene güvesi tarafından kaldırılan taklit etmek için delik delme verdirdiler.
- Başına beş bitki yaprakları, 1 ve 2 gün sonunda taban ve yaprakların üst kısmı bulunan iki adet 7 mm delik kişi yaralandı. Kontrol tedavisi mekanik hasar almaz.
3. Uçucu Yerel indüksiyon: Meja
- 10 ml% 0.1 Tween-20 çözüm Meja ya 1 ya da 1.5 mM çözüm Blueberry bitkiler ile tedavi edilir.
- Meja 2-oz sprey şişesi ile uygulanır. Kontrol bitkiler 10 ml% 0.1 Tween-20 çözüm ile püskürtülür.
- Bitkiler saat 16:00 tedavi, sera ve 17 cm çapında ve uçucu koleksiyonları önce 35 cm yüksekliğinde pleksiglas odasının içinde 15 saat süreyle tutulur.
- Uçucu emisyonları, aşağıda açıklandığı gibi toplanır.
4. Uçucu maddelerin sistemik indüksiyon: iç sinyalizasyon
- Yaban mersini bitkisinin bir alt dalı, bir spun polyester kol ile Torbalı ve altı (2. -3 üncü instars) çingene güvesi tırtıllar poşet içine koyarak zarar görmüştür .
- Hasar şube, uçucu toplama haznesi dışında kalırken dalıs hasarlı şube üzerinde odasının içine yerleştirilir (Şekil 2).
- Tırtıllar, 2 gün boyunca alt dalı beslemek için izin verilir.
- 3. gününde başlayarak, uçucu zarar görmüş bitkilerin hasarsız kısmı tahsil edilir.
- Uçucu, 7 gün boyunca toplanır. Kontrol bitkiler benzer bir şekilde tedavi edilmektedir ama otobur hasar almadı.
5. Vasküler bağlantısı
- Bu çalışmada, yaban mersini bir tesis içinde farklı dalları arasında damar bağlantısı derecesi belirlenir.
- Bir bitkinin bir alt dalı uç kısmı Orians ark açıklanan rodamin-B (Sigma-Aldrich) boya (0.25% w / v), 6 ml solüsyon içeren bir çiçek su seçim desteklemek için kesilir. 11
- Tesisimiz ile boya Hareketi, 7 gün boyunca günlük olarak takip edilmektedir.
- 7 gün sonra, kırmızı boyama miktarı bitkinin farklı pozisyonlarda görsel olarak değerlendirildi.
6. HIPVs Pozlama: harici sinyal
- Bir bitki içinde şube ya bir komşu şube HIPVs maruz veya HIPVs için poz aldı.
- HIPVs dalları ortaya çıkarmak için, bir alt dalı polyester kol ve altı (2. -3 üncü instars) çingene güvesi tırtıllar çanta içine yerleştirilir (Şekil 3) ile Torbalı.
- Yukarıda açıklanan Pleksiglas odasına benzer bir bitki içinde kafesli. Böcekler, yan dalları kaynaklı şube yayılan uçucu maruz kaldığı gibi, 2 gün boyunca bitkiler üzerinde beslemek için izin verilir.
- Maruz kalınması sonrasında (günde 3), maruz dalları böcek yaralı dalı (Şekil 2'de görüldüğü gibi) dışarıda bırakarak, uçucu toplama haznesi içine yerleştirilir.
- HIPV maruz kalan dallarından uçucu aşağıda anlatıldığı gibi toplanır ve Filiz Görüntü Softwa kullanarak yaprak alanının alt dalı tüketilen miktarı ölçülüryeniden.
7. HIPVs için Pozlama: Dolgudan
- Bitkiler HIPV maruz kaldıktan sonra "astarlanmalıdır" olup olmadığını belirlemek için, bitkiler Protokol # 5 olarak kabul edilir.
- Bitkilerin yarısı kaynaklı bir komşu şube HIPVs maruz kalan diğer yarısı hasarsız dallarına maruz kalmaktadır.
- 3. gün, dört erken 2. instar çingene güvesi tırtıllar her bitkinin yerleştirilir ve aşağıda açıklandığı gibi uçucu toplanır (Şekil 4).
- Uçucu koleksiyonları sonra, başlangıçta, çingene güvesi tırtılların yanı sıra 3 gün hasar gören bu hasar bırakır eksize ve yaprak alanı, tüketilen miktarı ölçülür.
8. Uçucu maddelerin toplanması
- HIPV emisyonları, bir itme-çekme sistemi kullanılarak sera örneklenmiş. Otobur hasar tedavisinde tırtıllar da dahil olmak üzere saksı bitkileri yerüstü bölümü (kök, dallar ve yapraklar), 4 L vola içine yerleştirilir.kiremit toplama haznesi. 2-parçalı bir giyotin, bitkilerin temel destekler. Saflaştırılmış hava, 2 L / dak hızında her odasının üst girer.
- Uçucu Alltech Super-Q 1 L / dak hızında odaları hava çekerek tarafından adsorban 30 mg ile dolu tuzakları toplanan.
- Uçucu toplama cihazı aynı anda dört farklı bitki (Şekil 1) uçucu koleksiyonları için izin dört odacıktan oluşur.
- Koleksiyonlar 09:00 ile 17:00 saat için gündüz yapılan
- Toplandıktan sonra, bitkilerden tüm yaprakları hasat edilerek, ° C, 60 kurutulmuş fırın, ve tartılır ve odaları, musluk suyu ve% 70 etanol ile durulanır.
9 - Uçucu maddelerin analizi
- Super-Q tuzakları toplanan uçucu diklorometan (150 ul) ve n-oktan 400 ng dahili standart olarak eklenir ile yıkandı.
- Hewlett Packard 6890 Serisi bileşiklerin ayrılması ve miktar yapılırGaz Kromatografi (GC), alev iyonizasyon dedektörü (FID) ve ile donatılmıştır (Şekil 5), Agilent HP-1 kolon (10 mx 0.53 mm x 2.65 mm) ve taşıyıcı gaz olarak O (sabit akış = 5 ml / dak , hız = 39 cm / sn). Sıcaklık programı başladı 40 ° C 14 artış, 1 dakika boyunca muhafaza ° C / dak - 180 ° C (2 dakika), daha sonra 40 ° C / dak - 200 ° C ve 200 ° C'de muhafaza 2 dk .
- Bileşiklerin Geçici kimlik taşıyıcı gaz olarak Supelco MDN-5S kolon (30 mx 0.32 mm x 0.25 mm) ile donatılmış bir Finnigan MAT 8230 kütle spektrometresi (MS) ile birleştiğinde bir Varian 3400 GC, ve O ile yürütülmektedir. MS 250 elektron iyonizasyon (EI) ve toplam iyon kromatogram (TIC) modu işletilmektedir ° C (kaynak sıcaklığı). Programı 35 ° C (1 dak), 4 ° C / dak 170 ° C, 15 ° C / dak - 280 ° C artış başladı
- Bileşikler, geçici olarak, NIST kütüphane ve b ile spektral veri karşılaştırması tarafından belirleneny GC tutma indeksi ve piyasada bulunan bileşikler ile retansiyon zamanlarını karşılaştırarak.
10. Temsilcisi Sonuçlar:
Yirmi iki uçucu yaban mersini yaprakları (Şekil 6) tespit edildi. Şekil 7 hasarsız yaban mersini yapraklarından bir temsilcisi kromatograf gösterir ve çingene güvesi tarafından beslenme hasar bırakır. Çingene güvesi tırtıllar tarafından mekanik hasar ve besleme denetimleri (Şekil 8) göre, yaban mersini yaprakları yerel uçucu salınımını da artırmıştır . Tırtıl beslenme ile karşılaştırıldığında, Meja tedavi çingene güvesi (Şekil 9) tarafından uyarılan 17 bileşiklerin 11 uyarılan. Ancak uçucu sistemik indüksiyon hasarsız ilk besleme hasar (yani, iç sinyalizasyon eksikliği) (Şekil 10) yedi gün sonra çingene güvesi zarar gören bitkilerin yapraklarından elde hiçbir kanıt vardı. Buna ek olarak, bir hafta sonra, çok yavaş hareketkırmızı boya-yaban mersini bitkilerin dalları arasında (Şekil 11) gözlenmiştir. Tek dal içinde yapraklar arasında yüksek vasküler bağlantı vardı. Ancak, iki dikey dalları, bir ateş içinde uyumlu ve düşük bir ateş ters tarafta iki dalı arasındaki bağlantı arasında orta-düşük bağlantı vardı.
HIPVs (Şekil 12) maruz karşı HIPVs maruz dallarından yayılan uçucu miktarları arasında fark yoktu. Ancak, HIPVs yaban mersini dış savunma sinyalleri olarak hareket ederler. Çingene güve tırtıllar yapraklar üzerinde beslenen, daha önce maruz bırakılmayan kontrol yapraklar (Şekil 13) beslenenlere kıyasla% 71 daha az yaprak malzeme tüketilen HIPVs maruz . Ayrıca, yaprak alanı HIPV maruz dalları tüketilen miktarı başına yayılan uçucu miktarlarda gösteren, Pozlanmamış dalları (Şekil 14) ile karşılaştırıldığında 4 kat daha yüksektir HIPV-ex yaprak yarattığı dalları herbivory (yani onlar astarlanmalıdır) daha duyarlı.
Şekil 1 A itme-çekme sistemi, yaban mersini bitkilerden uçucu toplamak için kullanılır . Bitkiler cam odaları içine yerleştirilir ve temiz hava onlara geçti. Adsorban bir madde içeren bir filtre, bitkinin yayılan tuzak uçucu her odasının yan bağlanmıştır. Vakum filtre yoluyla odanın içindeki havayı çekmek için kullanılır.
Şekil 2. yaban mersini bitkilerden uçucu sistemik yanıt çalışmak için, daha düşük yaban mersini dalları ya çingene güvesi tırtıllar (sağ kamara) veya sol (sol hasarsız odası) tarafından hasar gördü . 2 gün (3 gün) sonra, hasarlı ve hasarsız bitkileri hasarsız üst dallarından uçucu toplanmıştır.
Şekil 3 hasarsız dalları yaprakları hasarlı dallarından HIPVs cevap olup olmadığını sınamak için, yaban mersini bitkileri her bir şube torbalı. Daha sonra bitkilerin yarısının çanta içinde çingene güvesi tırtıllar yerleştirilir. Ben içeriden çanta dışında uçucu hareketi izin çantalar. Bitkiler HIPVs hasarsız dalları ortaya çıkarmak için Pleksiglas odaları içine yerleştirildi. Uçucu sonra maruz şubesi toplandı.
Şekil 4 hasarsız dallarından yapraklar HIPVs için maruz kaldıktan sonra "astarlanmalıdır" olup olmadığını test etmek için deneyler Şekil 3'te anlatıldığı gibi ama çingene güvesi tırtıllar her uçucu toplama haznesi içinde HIPV maruz kalan ve maruz kalmamış dalları yerleştirildi tekrarlandı .
g "alt =" Şekil 5 "/>
Şekil 5 uçucu koleksiyonları sonra, örnekler, yaban mersini bitkileri yayılan uçucu tanımlamak ve ölçmek için gaz kromatografisi (GC) üzerine enjekte edilir .
Şekil 6: en az 22 bileşikleri, yaban mersini yapraklarından yayılan.
Şekil 7 hasarsız yaban mersini Tipik Kromatograflar yaprakları ve çingene güvesi tırtıllar tarafından hasar bırakır. Uçucu hasarsız yaban mersini yapraklarından çok düşük miktarda yayılır. Ancak, yapraklar, çingene güvesi tırtıllar zarar gördüğünde, uçucu emisyonu önemli ölçüde artmıştır.
Şekil 8 grafik hasarsız yaprakları, m yayılan her 22 uçucu tutarları gösteriryaprakları echanically hasar ve çingene güvesi tırtıllar tarafından hasar bırakır. Tırtıllar tarafından kaldırılan yaprak alanı miktarını taklit Yapay hasar yaban mersini yapraklarından uçucu emisyonu artmış ancak yanıt çingene güvesi besleme yaprak uçucu tepkisi farklı oldu.
Şekil 9 JA yolu yaban mersini yapraklarında uçucu emisyon düzenler olup olmadığını test edilmiştir . Bitkiler, Meja farklı miktarlarda püskürtülür. Eksojen olarak uygulanan Meja artan konsantrasyonlarda yaban mersini yapraklarından uçucu emisyonlarının arttığı bulundu.
Şekil 10 grafik kontrol yaban mersini dalları ve çingene güvesi zarar görmüş bitkiler (sistemik yanıt) zarar görmemiş dallarından yayılan uçucu toplam tutarı gösterir. Uçucu bir toplandı7 gün üst üste tal. Ben bitkilerin alt dalları ilk hasarından sonra bile uçucu 7 gün sistemik indüksiyon bulundu.
Şekil 11 yaban mersini bitkileri içinde şube arasında damar bağlantısı derecesini belirlemek için rodamin-B (kırmızı boya). Ben yaklaşık bulundu. % 80,% 20,% 5 ve% 0 boya içeren dalları yaprakları, boya, şube, şube genelinde içeren boya ve böğürtlenli bir tesis içinde farklı bir ateş bulunan şubesi içeren doğrudan şube yukarıda dalları sırasıyla; tam boya ile boyandı.
Şekil 12 grafik HIPVs ve Pozlanmamış dalları maruz dallarından yayılan uçucu miktarını gösterir. HIPVs için maruz neigh uçucu emisyonu etkileyebilir olmadığını bulunduhasarsız yaban mersini dalları sıkıcı.
Şekil 13 grafik, çingene güvesi HIPVs ve Pozlanmamış dalları maruz kalan yaban mersini dalları üzerinde tırtıllar tarafından beslenme miktarını gösterir . Tırtıllar HIPV maruz dalları Pozlanmamış dalları ile karşılaştırıldığında, daha az miktarda bitki örtüsü tüketilmektedir.
Şekil 14 tüketilen alan başına emisyon oranı hesaplanır, HIPV-maruz dalları Pozlanmamış dalları ile karşılaştırıldığında artan bir uçucu yanıt yaban mersini dalları yaprakları astarlanmalıdır HIPVs maruz kalmanın belirten Uçucu maddelerin emisyon oranları artmış olduğu bulundu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada anlatılan, itme-çekme uçucu toplama cihazı bitki uçucu headspace koleksiyonları için standart bir yöntem temsil. Bu cihaz herbivory çingene güvesi tırtıllar tarafından yaban mersini yapraklarından uçucu yanıt belirlemek için kullanılan ve aynı zamanda tesis içi sinyalizasyon HIPVs rolü için yeni kanıtlar sunmak için bana izin verildi.
Sonuçları bu tırtıl beslenme, Eksojen olarak uygulanan Meja burada sunulan ve mekanik yaralama farklı olsa da, hasar yerinde uçucu emisyon artış. Bu sonuçlar, JA yolu, yaban mersini HIPVs indüksiyonunda önemli bir rol oynadığını göstermektedir.
HIPV maruz uçucu emisyon ikna etmedi. Ancak, HIPV maruz kalan dalları çingene güvesi besleme artan bir uçucu yanıtı için astarlanmalıdır. Otçul yokluğunda uçucu emisyonu bir artış HIPVs yanıt ekolojik tabi yanı sıra fizyolojik costs, HIPVs otçul doğal düşmanları güvenilmez bilgi sağlamak çünkü. Bunun yerine, bitkiler HIPVs maruz kalma sonrasında artan uçucu yanıt için kendilerini başbakan daha uyumlu bir strateji olabilir. HIPV maruz yaprakları uçucu emisyon Bu artış oranı, tercihen otçul doğal düşmanları çeken veya yaban mersini de çingene güvesi ile indüklenen birçok uçucu tırtıllar 12 üzerinde kovucu etkisi olabilir bu yana doğrudan bir savunma rolü teşkil edebilecek dolaylı bir savunma olarak hizmet olabilir .
Özetle, benim sonuç uçucu böcek besleme zarar ve yan dalları yapraklar asal uçucu emisyonu en aza indirmek hasarlı yaban mersini dalları yaprakları aracılığıyla bilgi iletimi olduğunu göstermektedir. Başkaları tarafından bu kombine Bu sonuçlar HIPVs tesis içi sinyalizasyon bir rol oynayabilir ve daha HIPVs multi-fonksiyonel rolleri göstermek güçlü bir kanıt sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ifşa etmek için hiçbir şey var
Acknowledgments
Yazar Robert Holdcraft teknik destek için teşekkür eder. Bu çalışmada, USDA CSREES Özel Grant (2009-34155-19957) ve hatch fonları (NJ08192) tarafından kısmen finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Volatile collection chambers | Analytical Research Systems, Inc. | VCC-G6X12DT-1P | Gainesville, FL |
| Air compressor, 20 gal, oil free, 2 hp | Westward | 3JR71 | Sold by Grainger, Inc. |
| Air delivery system | Analytical Research Systems, Inc. | VCS-ADS-4AFM4C | Gainesville, FL |
| Air collection system | Analytical Research Systems, Inc. | VCS-MVCS-4CX1P | Gainesville, FL |
| Vacuum pump 100-150V, ¼ hp | Gast Manufacturing, Inc. | 4F740 | Sold by Grainger, Inc. |
| Methyl jasmonate | Sigma-Aldrich | J2500 | St. Louis, MO |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 | St. Louis, MO |
| Rhodamine-B | Sigma-Aldrich | St. Louis, MO | |
| Plastic spray bottles, 2 oz | Setco Inc. | Cranbury, NJ | |
| Spun polyester sleeves | Rockingham Opportunities Corp. | Reidsville, NC | |
| Super-Q volatile collection traps | Analytical Research Systems, Inc. | VCT-1/4X3-SPQ | Gainesville, FL |
| Scion Image Software | Scion Corporation | Frederick, MD | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | St. Louis, MO |
| Gas chromatograph HP 6890 | Hewlett-Packard | ||
| Gas chromatograph Varian 3400 | Varian Inc., Agilent | ||
| n-octane | Sigma-Aldrich | 296988 | St. Louis, MO |
| Mass spectrometer MAT 8230 | Finnigan | San Jose, CA | |
| HP-1 GC column | Agilent Technologies | Palo Alto, CA |
|
| MDN-5S GC column | Supelco, Sigma-Aldrich | Bellefonte, PA |
References
- Dicke, M., Van Loon, J. J. A. Multitrophic effects of herbivore-induced plant volatiles in an evolutionary context. Entomol. Exp. Appl. 97, 237-237 (2000).
- Mumm, R., Dicke, M. Variation in natural plant products and the attraction of bodyguards involved in indirect plant defense. Can. J. Zool. 88, 628-628 (2010).
- Hopke, J. Herbivore-induced volatiles: the emission of acyclic homoterpenes from leaves of Phaseolus lunatus and Zea mays can be triggered by a β-glucosidase and jasmonic acid. FEBS Lett. 352, 146-146 (1994).
- Rodriguez-Saona, C. Behavioral and electrophysiological responses of the emerald ash borer, Agrilus planipennis, to induced volatiles of Manchurian ash, Fraxinus mandshurica. Chemoecology. 16, 75-75 (2006).
- Rodriguez-Saona, C. Herbivore induced volatiles in the perennial shrub, Vaccinium corymbosum, and their role in inter-branch signaling. J. Chem. Ecol. 35, 163-163 (2009).
- Karban, R. Damage-induced resistance in sagebrush: volatiles are key to intra- and interplant communication. Ecology. 87, 922-922 (2006).
- Frost, C. J. Within-plant signalling by volatiles overcomes vascular constraints on systemic signalling and primes responses against herbivores. Ecol. Lett. 10, 490-490 (2007).
- Heil, M., Bueno Silva, J. C. Within-plant signaling by volatiles leads to induction and priming of an indirect plant defense in nature. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5467-5467 (2007).
- Turlings, T. C. Exploitation of herbivore-induced plant odors by host-seeking parasitic wasps. Science. 250, 1251-1251 (1990).
- Makovic, I. Volatiles involved in the nonhost rejection of Fraxinus pennsylvanica by Lymantria dispar larvae. J. Agric. Food Chem. 44, 929-929 (1996).
