Summary
En push-pull metoden för att samla in växter flyktiga ämnen beskrivs. Metoden möjliggör en jämförelse av flyktiga inducerad av växtätande utfodring, exogena metyl jasmonate och mekaniska skador. Denna teknik används också för att undersöka flyktiga svar oskadade grenar exponering för flyktiga ämnen från växtätare-skadade filialer inom blåbär växter.
Abstract
Växtätare-inducerad växt flyktiga ämnen (HIPVs) ofta ut från växter efter växtätare attack 1,2. Dessa HIPVs huvudsakligen regleras av den defensiva växthormonet jasmonic syra (JA) och dess flyktiga derivat metyl jasmonate (Meja) 3,4,5. Under de senaste tre decennierna har forskare dokumenterat att HIPVs kan avvärja eller locka växtätare, locka naturliga fiender växtätare, och i vissa fall kan framkalla eller prime försvar anläggning innan det växtätare attack. I en nyligen papper 6, rapporterade jag att utfodring av larver zigenare fjäril, exogena Meja program och mekanisk skada förmå utsläpp av flyktiga ämnen från blåbär växter, om än annorlunda. Dessutom blåbär grenar svara på HIPVs avges från närliggande grenar av samma växt genom att öka nivåerna av JA och motstånd mot växtätare (dvs direkt växt försvar), och genom grundmålning flyktiga utsläpp (dvs. indirekta anläggning försvar). Liknande hittamöten har nyligen rapporterats för Sagebrush 7, poppel 8 och limabönor 9 ..
Här beskriver jag en push-pull metoden för att samla in blåbär flyktiga inducerad av växtätande (zigenska malen) utfodring, exogena Meja program och mekaniska skador. De flyktiga kollektionen består av en 4 L flyktiga uppsamlingsbehållaren, ett 2-delat giljotinen, en luft leverans system som renar inkommande luft, och ett vakuumsystem är ansluten till en fälla fylld med Super-Q adsorbent för att samla flyktiga 5,6,10 . Flyktiga ämnen samlas i Super-Q fällor elueras med diklormetan och därefter separeras och kvantifieras med hjälp av gaskromatografi (GC). Denna flyktiga insamlingsmetoden användes n min studie 6 att undersöka flyktiga svar oskadade grenar exponering för flyktiga ämnen från växtätare-skadade filialer inom blåbär växter. Dessa metoder beskrivs här. Kortfattat är oskadade blåbär grenar utsätts för HIPVs tillbakam närliggande grenar inom samma anläggning. Genom att använda samma tekniker som beskrivs ovan, är flyktiga ämnen som avges från grenar efter exponering för HIPVs samlas in och analyseras.
Protocol
1. Lokala induktion av flyktiga ämnen: växtätare skador
- Två grenar av blåbär växter säckar med en spunnen polyester ärm.
- Sex zigenare mal larver (2: a -3: e instars) är placerade inuti väskor och får livnära sig på växter för 2 dagar före flyktiga samlingen. Kontroll växter inte får några larver.
- Flyktiga utsläpp samlas som beskrivs nedan (protokoll # 7) på dag 3 (Figur 1). Polyester ärmarna kvar på växter för att hindra insekter från att fly.
2. Lokala induktion av flyktiga ämnen: mekaniska skador
- Mekaniska skador på växter är orsakade av stansning hål för att efterlikna mängden bladyta bort av gypsy mal.
- Fem blad per planta är skadade med två 7-mm hål ligger vid basen och övre delen av löv i slutet av dag 1 och 2. Kontrollen behandling tar inte emot mekaniska skador.
3. Lokala induktion av flyktiga ämnen: Meja
- Blåbär växter behandlas med 10 ml av antingen en 1 eller 1,5 mm lösning av Meja i en 0,1% Tween-20-lösning.
- Meja appliceras med en 2-oz sprayflaska. Kontroll växter besprutas med 10 ml av en 0,1% Tween-20-lösning.
- Växter behandlas vid 16:00 HR, och förvaras i växthus för 15 tim inne i en 17-cm diameter och 35 cm högt plexiglas kammare innan flyktiga samlingar.
- Flyktiga utsläpp samlas som beskrivs nedan.
4. Systemisk induktion av flyktiga ämnen: intern signalering
- En lägre gren av ett blåbär anläggning säckar med en spunnen polyester ärm och skadas genom att placera sex (2: a -3: e instars) zigenare nattfjäril larver inuti väskan.
- Den skadade grenen förblir utanför den flyktiga uppsamlingsbehållaren, medan Branches över det skadade grenen är placerade inne i kammaren (figur 2).
- Larver är tillåtet att mata på botten grenen i 2 dagar.
- Från och med dag 3, är flyktiga hämtas från oskadade delen av skadade växter.
- Flyktiga ämnen samlas in för 7 dagar i följd. Kontroll växter behandlas på ett liknande sätt men inte fått växtätare skador.
5. Blodkärl anslutning
- Denna studie bestäms av graden av vaskulära anslutningar mellan olika filialer inom ett blåbär anläggning.
- Slutet del av en lägre gren från en anläggning kapas för att stödja en blomvatten plocka innehåller 6 ml lösning av ett Rhodamine-B (Sigma-Aldrich) färgämne (0,25% w / v), som beskrivs i Orians et al. 11
- Förflyttning av färgen genom anläggningen kontrolleras dagligen i 7 dagar.
- Efter 7 dagar, är mängden röda fläckar visuellt bedömas utifrån olika positioner av anläggningen.
6. Exponering för HIPVs: extern signalering
- Filialer inom en anläggning är antingen utsätts för HIPVs från ett angränsande filial eller fått någon exponering mot HIPVs.
- Utsätta grenar till HIPVs är en lägre gren säckar med polyester ärm och sex (2: a -3: e instars) zigenare nattfjäril fjärilslarver är placerade inuti påsar (Figur 3).
- Anläggningen är i bur i en plexiglas kammare liknande dem som beskrivs ovan. Insekter får livnära sig på växter för 2 dagar, så att intilliggande branscher är utsatta för flyktiga ämnen som avges från den inducerade grenen.
- Efter exponering (dag 3), utsätts grenar placeras inuti den flyktiga uppsamlingsbehållaren och lämnar insekten-skadade filial utanför (som visas i figur 2).
- Flyktiga ämnen från HIPV exponerade-grenar samlas som beskrivs nedan, och mängden bladyta konsumeras från nedre grenen mäts med hjälp av Scion Image SoftwaRe.
7. Exponering för HIPVs: grundning
- För att avgöra om växterna är "primade" efter HIPV exponering, växter behandlas som i protokoll # 5.
- Hälften av växter utsätts för HIPVs från en inducerad angränsande filial, medan den andra halvan är utsatt för oskadade grenar.
- På dag tre, fyra första 2: a-INSTAR zigenare mal fjärilslarver placeras på varje anläggning och flyktiga samlas som beskrivs nedan (Figur 4).
- Efter flyktiga samlingar, lämnar inledningsvis skadas av larver zigenare fjäril, liksom de som är skadade på dag 3, är censurerade och mängder konsumeras bladyta mäts.
8. Insamling av flyktiga
- HIPV utsläppen samplas i växthuset med hjälp av en push-pull-systemet. Den ovan jord del av krukväxter (stam, grenar och löv), inklusive larver i växtätare skadan behandling, är placerad inuti en 4 L volakakel uppsamlingsbehållaren. En 2-delad giljotinen stöder basen av växter. Renade luften kommer in i toppen av varje kammare med en hastighet av 2 l / min.
- Flyktiga ämnen samlas i fällor fyllda med 30 mg Alltech Super-Q adsorbent genom att dra luft från kamrarna med en hastighet av 1 l / min.
- De flyktiga kollektionen Utrustningen består av fyra avdelningar, vilket möjliggör samtidig samlingar av flyktiga ämnen från fyra olika växter (Figur 1).
- Samlingar sker under dagtid från 9:00 till 17:00 h.
- Efter samlingen är alla löv från växter skördas, torkas i ugn vid 60 ° C, och vägde, och kammare sköljs med kranvatten och 70% etanol.
9. Analys av flyktiga
- De insamlade flyktiga ämnen från Super-Q fällor elueras med diklormetan (150 l) och 400 ng av n-oktan läggs till som intern standard.
- Separation och kvantifiering av föreningar görs på en Hewlett Packard 6890-serienGaskromatograf (GC) (Figur 5), utrustad med en flamjonisationsdetektor (FID) och en Agilent HP-1 kolumn (10 mx 0,53 mm x 2,65 mikrometer), och använder han som bärgas (konstant flöde = 5 ml / min , hastighet = 39 cm / sek). Temperaturen Programmet startade vid 40 ° C hålls under 1 minut, ökade vid 14 ° C / min till 180 ° C (2 min), därefter vid 40 ° C / min till 200 ° C, och förvaras på 200 ° C i 2 min .
- Preliminär identifikation av föreningarna utförs på en Varian 3400 GC kopplat till en Finnigan MAT 8230 masspektrometer (MS), utrustad med en Supelco MDN-5S kolonn (30 mx 0,32 mm x 0,25 mikrometer), och med han som bärgas. MS används i elektron jonisering (EI) och total jon kromatogram (TIC) läge vid 250 ° C (källa temperatur). Programmet startade vid 35 ° C (1 min), ökade vid 4 ° C / min till 170 ° C, därefter vid 15 ° C / min till 280 ° C.
- Föreningar är preliminärt identifierats genom jämförelse av spektrala data med dem från NIST bibliotek och By GC behålla index och genom att jämföra deras retentionstider med de kommersiellt tillgängliga föreningar.
10. Representativa resultat:
Tjugotvå flyktiga ämnen identifierades från blåbär blad (Figur 6). Visar ett representativt kromatografens av oskadade blåbär löv och blad skadas av utfodring av gypsy mal Figur 7. Mekaniska skador och utfodring av larver gypsy mal ökat flyktiga utsläpp lokalt från blåbär bladen jämfört med kontroller (Figur 8). Jämfört med caterpillar utfodring, framkallade de Meja behandling 11 av de 17 föreningar som orsakas av gypsy mal (Figur 9). Det fanns dock inga tecken på systemisk induktion av flyktiga ämnen från oskadade blad av zigenare mal-skadade växter sju dagar efter den första utfodring skada (dvs. brist på intern signalering) (Figur 10). Dessutom, efter en vecka, mycket långsamt flyttaning av röd färg observerades bland grenarna av blåbär växter (Figur 11). Det var hög vaskulär anslutningsmöjligheter bland bladen i en enda gren. Det fanns dock mellan-och låg anslutning mellan två grenar lodrätt i ett skott och låg anslutning mellan två grenar på motsatta sidor av ett skott.
Det var ingen skillnad mellan mängder flyktiga ämnen som avges från grenar utsätts för HIPVs kontra de som inte utsätts för HIPVs (Figur 12). Men HIPVs fungera som extern defensiva signaler i blåbär. Gypsy mal larver matas på blad utsätts tidigare för att HIPVs konsumerade 71% mindre blad material än gjorde de utfodras med oexponerade kontroll blad (Figur 13). Dessutom var mängder flyktiga ämnen som släpps ut per mängd bladyta som konsumeras i HIPV exponerade branscher fyra gånger högre jämfört med oexponerade grenar (Figur 14), vilket indikerar att blad från HIPV-ex ställde grenar var mer lyhörda för herbivori (dvs, de var grundmålad).
Figur 1. En push-pull system används för att samla in flyktiga ämnen från blåbär växter. Växter är placerad inuti glaset kammare och ren luft förs över dem. Ett filter som innehåller ett absorberande material fästes på sidan av varje kammare för att fånga flyktiga ämnen som avges från anläggningen. Ett vakuum används för att dra luft från insidan av kammaren genom filtret.
Figur 2. För att studera systemiska flyktiga svar från blåbär växter, var lägre blåbär grenar antingen skadas av larver gypsy mal (höger kammare) eller vänster oskadade (vänster kammare). Efter 2 dagar (dag 3), var flyktiga ämnen från oskadade övre grenarna från skadade och oskadade växter samlas in.
Figur 3. För att testa om bladen från oskadade grenar svara på HIPVs från skadade grenar, säckar jag en av grenarna i varje blåbär växter. Jag placerade sedan larver gypsy nattfjäril inne i påsar med hälften av växterna. Påsarna jag använde tillåter förflyttning av flyktiga ämnen från insidan till utsidan av väskor. Växterna var placerade inne plexiglas kammare för att exponera oskadade grenar HIPVs. Flyktiga ämnen var då in från utsatta branscher.
Figur 4. För att testa om bladen från oskadade grenar är "primade" efter exponering för HIPVs, experiment upprepades som beskrivs i figur 3, men zigenare nattfjäril larver placerades på HIPV-exponerade och oexponerade grenar inuti varje flyktiga uppsamlingsbehållaren.
g "alt =" Figur 5 "/>
Figur 5. Efter flyktiga kollektioner, prover sprutas in i en gaskromatograf (GC) för att identifiera och kvantifiera de flyktiga ämnen som avges från blåbär växter.
Figur 6. Minst 22 föreningar som släpps ut från blåbär blad.
Figur 7. Typisk Kromatografer från oskadad blåbär blad och löv skadas av fjärilslarver gypsy mal. Flyktiga ämnen avges vid mycket låga belopp från oskadade blåbär blad. Men när bladen är skadade av larver zigenska nattfjäril, ökade utsläpp av flyktiga dramatiskt.
Figur 8. Grafen visar de belopp varje 22 flyktiga ämnen som avges från oskadade blad, mechanically-skadade blad, och blad skadas av fjärilslarver gypsy mal. Konstgjord skador efterlikna mängden bladyta bort av larver ökat flyktiga utsläpp från blåbär löv men effekten skiljer sig från den flyktiga svar av löv till zigenare mal utfodring.
Figur 9. Testad om JA väg reglerar flyktiga utsläpp i blåbär blad. Växter var besprutas med olika mängder av Meja. Jag tyckte att öka halterna av exogent-tillämpad Meja ökade utsläpp av flyktiga ämnen från blåbär blad.
Figur 10. Diagrammet visar den totala mängden flyktiga ämnen som avges från grenar kontroll blåbär och från oskadade grenar från zigenare skadade nattfjäril växter (systemisk reaktion). Flyktiga samlades för en tillTal av 7 dagar i följd. Jag hittade ingen systemisk induktion av flyktiga ämnen, även 7 dagar efter den första skadan på lägre grenar av växter.
Figur 11. Jag använde Rhodamine-B (röd färg) för att fastställa graden av vaskulära anslutningsmöjligheter bland filialer inom blåbär växter. Jag upptäckte att ca. 80%, 20%, 5% och 0% av bladen från grenarna som innehåller färgämnet, grenar direkt ovanför den gren som innehåller färgämnet, grenar över den gren som innehåller färg, och filialer i en annan skjuta inom ett blåbär anläggningen, respektive, var helt färgas med färgen.
Figur 12. Grafen visar mängden flyktiga ämnen som avges från grenar utsätts för HIPVs och oexponerade grenar. Jag tyckte att exponering för HIPVs inte påverkar flyktiga utsläpp i grannländertråkigt oskadade blåbär grenar.
Figur 13. Grafen visar hur mycket föda som larver gypsy mal på blåbär grenar utsätts för HIPVs och oexponerade grenar. Larver på HIPV exponerade grenar förbrukade mindre mängd blad jämfört med dem på oexponerade grenar.
Figur 14. När jag beräknade utsläppen per konsumerade området, fann jag att HIPV exponerade grenar hade ökat utsläppsnivåer av flyktiga ämnen jämfört med oexponerade grenar, vilket tyder på att exponering för HIPVs primas löv i blåbär grenar för en ökad flyktiga svar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den push-pull-flyktiga samling apparat som beskrivs här är en standardmetod för headspace samlingar av växter flyktiga ämnen. Denna apparat användes för att fastställa den flyktiga svar blåbär blad för att herbivori av larver zigenska mal och även tillät mig att ge nya bevis för rollen som HIPVs i handeln inom anläggning signalering.
De resultat som presenteras här visar att larv utfodring, exogent-tillämpad Meja och mekaniska såra ökat flyktiga utsläpp på platsen för skadan, om än annorlunda. Dessa resultat tyder på att JA vägen spelar en nyckelroll i induktion av HIPVs i blåbär.
HIPV exponering inducerade inte flyktiga utsläpp. Men HIPV exponerade grenarna var förberedd för en ökad flyktiga svar på zigenare mal utfodring. Svara på HIPVs av en ökning av flyktiga utsläpp i avsaknad av växtätare kan ha ådragit sig ekologiska samt fysiologiska costs, eftersom HIPVs kan ge otillförlitlig information till växtätare "naturliga fiender. Istället kan en mer adaptiv strategi för växter att prima sig för en ökad flyktiga svar efter exponering för HIPVs. Den ökade graden av flyktiga utsläpp från HIPV exponerade blad kan tjäna som ett indirekt försvar av företrädesvis locka naturliga fiender växtätare eller kan tjäna en direkt försvar roll eftersom flera flyktiga framkallas av zigenska malen i blåbär kan ha avskräckande effekt på fjärilslarver 12.
Sammanfattningsvis mina resultat visar att löv från skadade blåbär grenar överföra information via flyktiga ämnen som minimerar insekt utfodring skador och statsminister flyktiga utsläpp i den mottagande bladen av intilliggande kontor. Dessa resultat i kombination med de som av andra ger starka belägg för att HIPVs spela en roll i handeln inom växt-signalering och ytterligare påvisa multifunktionella roller HIPVs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Jag har inget att lämna ut
Acknowledgments
Författaren tackar Robert Holdcraft för tekniskt stöd. Denna studie har finansierats delvis av en USDA CSREES Special Grant (2009-34155-19957) och fonder lucka (NJ08192).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Volatile collection chambers | Analytical Research Systems, Inc. | VCC-G6X12DT-1P | Gainesville, FL |
| Air compressor, 20 gal, oil free, 2 hp | Westward | 3JR71 | Sold by Grainger, Inc. |
| Air delivery system | Analytical Research Systems, Inc. | VCS-ADS-4AFM4C | Gainesville, FL |
| Air collection system | Analytical Research Systems, Inc. | VCS-MVCS-4CX1P | Gainesville, FL |
| Vacuum pump 100-150V, ¼ hp | Gast Manufacturing, Inc. | 4F740 | Sold by Grainger, Inc. |
| Methyl jasmonate | Sigma-Aldrich | J2500 | St. Louis, MO |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 | St. Louis, MO |
| Rhodamine-B | Sigma-Aldrich | St. Louis, MO | |
| Plastic spray bottles, 2 oz | Setco Inc. | Cranbury, NJ | |
| Spun polyester sleeves | Rockingham Opportunities Corp. | Reidsville, NC | |
| Super-Q volatile collection traps | Analytical Research Systems, Inc. | VCT-1/4X3-SPQ | Gainesville, FL |
| Scion Image Software | Scion Corporation | Frederick, MD | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | St. Louis, MO |
| Gas chromatograph HP 6890 | Hewlett-Packard | ||
| Gas chromatograph Varian 3400 | Varian Inc., Agilent | ||
| n-octane | Sigma-Aldrich | 296988 | St. Louis, MO |
| Mass spectrometer MAT 8230 | Finnigan | San Jose, CA | |
| HP-1 GC column | Agilent Technologies | Palo Alto, CA |
|
| MDN-5S GC column | Supelco, Sigma-Aldrich | Bellefonte, PA |
References
- Dicke, M., Van Loon, J. J. A. Multitrophic effects of herbivore-induced plant volatiles in an evolutionary context. Entomol. Exp. Appl. 97, 237-237 (2000).
- Mumm, R., Dicke, M. Variation in natural plant products and the attraction of bodyguards involved in indirect plant defense. Can. J. Zool. 88, 628-628 (2010).
- Hopke, J. Herbivore-induced volatiles: the emission of acyclic homoterpenes from leaves of Phaseolus lunatus and Zea mays can be triggered by a β-glucosidase and jasmonic acid. FEBS Lett. 352, 146-146 (1994).
- Rodriguez-Saona, C. Behavioral and electrophysiological responses of the emerald ash borer, Agrilus planipennis, to induced volatiles of Manchurian ash, Fraxinus mandshurica. Chemoecology. 16, 75-75 (2006).
- Rodriguez-Saona, C. Herbivore induced volatiles in the perennial shrub, Vaccinium corymbosum, and their role in inter-branch signaling. J. Chem. Ecol. 35, 163-163 (2009).
- Karban, R. Damage-induced resistance in sagebrush: volatiles are key to intra- and interplant communication. Ecology. 87, 922-922 (2006).
- Frost, C. J. Within-plant signalling by volatiles overcomes vascular constraints on systemic signalling and primes responses against herbivores. Ecol. Lett. 10, 490-490 (2007).
- Heil, M., Bueno Silva, J. C. Within-plant signaling by volatiles leads to induction and priming of an indirect plant defense in nature. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5467-5467 (2007).
- Turlings, T. C. Exploitation of herbivore-induced plant odors by host-seeking parasitic wasps. Science. 250, 1251-1251 (1990).
- Makovic, I. Volatiles involved in the nonhost rejection of Fraxinus pennsylvanica by Lymantria dispar larvae. J. Agric. Food Chem. 44, 929-929 (1996).
