Summary
Beskriver vi en sensibiliseret metode til at identificere postembryonic regulatorer af proteinekspression og lokalisering i
Abstract
C. elegans har vist sig at være en værdifuld modelsystem til opdagelse og funktionelle karakterisering af mange gener og genprodukter veje 1. Mere avancerede værktøjer og ressourcer til studier i dette system er lettere fortsat opdagelsen af gener med mere subtile fænotyper eller roller.
Her præsenterer vi en generel protokol, vi er tilpasset til at identificere C. elegans gener med postembryonic fænotyper af interesse ved hjælp af RNAi 2. Denne fremgangsmåde kan let modificeres til bestemmelse af fænotype valg, hvad enten de lette eller fluorescens optik på et dissektionsmikroskop eller forbindelse mikroskop. Denne screening protokol udnytter de fysiske aktiver i organismen og molekylære værktøjer til C. elegans forskning fællesskab har frembragt. Som et eksempel viser vi anvendelse af en integreret transgen, som udtrykker et fluorescerende produkt i en RNAi skærmen for at identificere gener, der kræves for normal lokalisering af detteprodukt i sent larver og voksne. Først brugte vi en kommercielt tilgængelig genomisk RNAi bibliotek med fuld-længde cDNA skær. Dette bibliotek letter den hurtige identifikation af flere kandidater ved RNAi reduktion af kandidat-genproduktet. For det andet har vi skabt en integreret transgen som udtrykker vores fluorecently taggede protein af interesse i et RNAi-følsom baggrund. Det tredje ved at udsætte skraverede dyr RNAi, tillader dette skærmbillede identifikation af genprodukter, der har en afgørende embryonisk rolle, som ellers ville maskere en post-embryonale rolle i reguleringen af proteinet af interesse. Endelig Denne screening anvender en forbindelse mikroskop udstyret til enkelt celle opløsning.
Protocol
1. Screening stammen byggeri
Den omhyggelig udformning af screeningen stammen er kritisk for succesen af skærmen, og er blevet beskrevet andetsteds 3. For nogle forskere ved anvendelse af en stamme, der udtrykker et synligt produkt fra en transgen nødvendig for eksperimentet. Mange stammer, der indeholdt integrerede transgener er tilgængelige fra CGC eller individuelle forskere. Hvis en transgen stamme er nødvendig for skærmen, men ikke er tilgængelig, kan det dannes ved hjælp af en offentliggjort metode som bombardement 4, UV / TMP 5 eller Mos transposon insertion 6. For at visualisere vores protein af interesse, vi indsat GFP-kodende sekvens i ramme med den modne cDNA-sekvens (vi anvendt DBL-1-sekvens). Fordi denne GFP fusionsprotein ikke er synlig ved at dissekere omfang, vi brugte en coinjektion markør, der var synligt og ikke påvirker visning af vores protein af interesse (TTX-3P :: RFP 7). Vi har nu oprettet en integreret transgen fra ekstrakromosomale array. Vi fandt, at bombardement af transgenet gav en lav kopiantal integreret linie, der hverken reddede dissektionsmikroskop fænotypen eller fremstilles synlige niveauer af GFP-mærkede produkt (Beifuss og Gumienny, upubliceret). UV / TMP integration af en multipel kopi ekstrakromosomalt matrix oprindeligt fremstillet ved sprøjtestøbning 8,9 gav synlig, redning niveauer af transgen produkt (fig. 3A). Western blot med anti-GFP-antistof bekræftede, at transgenet (allel navn texIs100) udtrykkes og behandles korrekt (Beifuss og Gumienny, upubliceret). Integrerede transgener skal udkrydsede fem gange for at fjerne uvedkommende baggrund mutationer uanset kilden.
Til vores skærm, ønskede vi kun proteinet af interesse at være transgene, mærkede form. Derfor har vi fjernet den funktionelle endogene gENE ved at indføre en tab-af-funktion mutant DBL-1 allel.
Endelig har vi sensibiliseret stammen for virkningerne af RNAi. Det RNAi fra biblioteket vil for mange gener, producere en mere alvorlig reduktion i gen-produkt, hvis dyrene indeholder en mutation, der sensitizes dyrene til virkningerne af RNAi 10,11 The væv (r) af interesse, bør overvejes ved valg af en passende RNAi sensibiliserende baggrund 11. Vi brugte den kanoniske RRF-3 (pk1426) allel for at gøre vores screening stamme. RRF-3 er en RNA-dirigeret RNA-polymerase (RdRp) homolog, som normalt forhindrer somatisk RNAi 10. Mutationer i andre RNAi hypersensitizing gener som ERI-1 eller ERI-1 lin-15b kan anvendes i stedet for at øge effektiviteten af RNAi 11-13.
Screeningen stammen vi lavede har genotypen RRF-3 (pk1426); texIs100, DBL-1 (NK3).
2. Valg og forberedelse af enRNAi bibliotek
Kommercielt tilgængeligt C. elegans cDNA-biblioteker udgør cirka 55% eller 87% af de forudsagte gener i C. elegans individuelt (Vidal laboratoriet eller Ahringer lab biblioteker, henholdsvis). Individuelle kloner er tilgængelige for køb (Open Biosystems, Geneservice, Ltd). Vi valgte ORF-RNAi bibliotek konstrueret ved Vidal laboratoriet (Open Biosystems), fordi dens kloner er det meste af fuld længde cDNA'er Gateway klonet og er klar til efterfølgende anvendelser (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Den oprindelige Ahringer laboratoriet genomisk cDNA bibliotek indeholder cDNA fragmenter, der ikke er så bredt anvendelig for downstream karakterisering eksperimenter 14,15. Begge biblioteker anvende en vektor, der indeholder to T7-promotorer, der flankerer insertet (figur 1). De konstruktioner dyrkes i bakteriel stamme HT115, som udtrykker T7-polymerase efter induktion med isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG). Bakterier indeholdende biblioteket kloner induceret med IPTG for atproducerer dsRNA'et (se Trin 3,4).
Dupliker hele biblioteket ved modtagelsen og bruge dobbelt for alle eksperimenter. De oprindelige og duplikat biblioteker skal opbevares i forskellige -80 ° C fryser, der er forbundet til separate elektriske ledninger.
3. Fremstillinq af bakterier med biblioteket kloner
- (Senest to måneder efter forsøget) Streak-bakterier fra udvalgte fodring bibliotek kloner samt positive og negative kontroller, om mærket LB-carbenicillin / tetracyclin plader (vi vokser 8 kulturer pr 100 mm plade) og inkuberes ved 37 ° C natten over ( > 16 timer) (figur 1). For hver 24-brønds plade, bruger vi to kontroller. Den positive kontrol, bli-4 (K04F10.4), frembringer en dosisafhængig post-embryonisk pheontype 16,17. Den negative kontrol, C06C3.5 er en forudsagt pseudogen ( WormBase.org ), som forårsager nogen observerede fænotyper (Beifuss og Gumienny, upubliceret). (Inden for to måneder af forsøget, fortrinsvis før) fremstilles med 24 brønde nematode vækstmedium (NGM) plader indeholdende 25 - 50 ug / ml carbenicillin og 1 mM IPTG. Opbevares ved 4 ° C.
- (Dag 1) For hver klon, podning 2 ml LB-medier indeholdende 50 ug / ml carbenicillin med en enkelt koloni fra stribede plade (s) (trin 3.1) under anvendelse af standard steril teknik. Inkuber ved 37 ° C natten over (> 16 timer) i et rysteapparat indstillet til 220 til 240 rpm (figur 1). Opløsningen bør være uklar efter 16 timer.
- (Dag 2) Den næste morgen, inducerer dobbeltstrenget RNA (dsRNA) ved tilsætning af IPTG til kulturerne til en slutkoncentration på 1 mM. Inkuber kulturer ved 37 ° C, 220 - 240 rpm i en yderligere 4 - 5 timer. Dette trin sikrer en mere konsekvent og robust RNAi-induceret knockdown af gen-produkt, end at forlade sig alene på IPTG i agar af NGM pladen (i trin 3,5).
- Plet 30 ul af hver inducerede bakterielle culture i separate brønde i en 24-brønds NGM RNAi plade indeholdende 25 - 50 ug / ml carbenicillin og 1 mM IPTG (figur 1, se figur 4 til skabelon anvendes til at spore RNAi eksperimenter). Læg plader, utildækket i et sterilt flow-bænk i 20 minutter eller indtil de bakterielle pletter er tørre. Må ikke overdry. Overtørring forårsager kanter agar at trække væk fra pladen, og dyrene vil blive uigenkaldeligt hvis de krybe i den resulterende sprækkerne.
4. Fremstillinq af nematoder
Start med en iscenesat befolkning på nematoder. Mellemstationer dyr formindsker chancen for, at forskellene mellem kontrollen og de eksperimentelle RNAi forsøg er simpelthen skyldes forskelle i udviklingstrin af dyrene (men hvis RNAi bevirker en forsinket udvikling, bør blive bemærket af screener (fig. 2)) . Endvidere begynder RNAi forsøget med L1 larver overflødiggør potentielle forstyrrende virkninger af embryonisk letalitet ved RNAi GENes, der også kan spille postembryonic roller interesse.
Mellemstation opnås ved først at blegning en blandet fase population af screeningen stamme, som kun æggeskal-beskyttede embryoer overleve. Dette trin dyr til inden for omkring 12 timer ved 20 ° C eller 18 timer ved 16 ° C 18. Til mere stramt scene dyr, arrestation dyr i den første larvestadiet (L1) ved at lade embryoner luge i M9-medium uden mad. Udsultede L1 dyr placeret på mad genoptage væksten fra det samme udgangspunkt 19 år.
- (Dag 1) Brug tre 100 mm plader af fed, rene screening strain dyr, der indeholder gravide voksne og embryoner. Vask dyr fra plader under anvendelse af sterilt M9 ved pipettering væske hen over pladens overflade forsigtigt for at løsne dyr og embryoer. Overfør vask i en steril 15 ml reagensglas med skruelåg.
- Hvis vask er større end 3,5 ml, vågeblus dyrene (~ 3000 rpm i 30 sekunder) og fjernelse af væske til 3,5 ml. Hvis vask er lces end 3,5 ml, tilsættes H2O 0 eller M9 til røret til total 3,5 ml.
- Bær passende beskyttelsesudstyr (lab coat, handsker og beskyttelsesbriller), mens håndtering af kemikalier. Bland 0,5 ml 5 N NaOH med 1 ml frisk blegemiddel (5% natriumhypochlorit, mindre end 1 år gammel). Denne blanding til 3,5 ml nematode vask. Start en timer at tælle op. Denne proces bør ikke tage mere end 10 minutter. Hvis det gør, så embryoner vil blive bragt i fare, og udbyttet kan reduceres, eller blegemiddel er gamle og skal udskiftes.
- Vortex røret til cirka 10 sekunder. Gentag vortexing hvert andet minut i 4 til 10 minutter. Efter hver omhvirvling, observere opløsning under en dissekere mulighed for døde dyr.
- Når embryoner frigives og voksne fragmenteres (6 - 8 minutter), pelleten embryonerne ved at dreje røret i en bordcentrifuge (~ 3000 rpm, 30 sekunder).
- Aspirer så meget af supernatanten som muligt, uden at forstyrre pelleten. Vær forsigtig, ikkegrådige.
- Tilføj sterilt M9 til ~ 10 ml. Vortex kort eller ryst godt til pellet resuspenderes.
- Spinde og fjern supernatanten igen. Hvis lugten af blegemiddel kan detekteres i røret, gentages skylles efter behov.
- Resuspender embryoner i 10 - 15 ml sterilt M9 og overføres til en lille (25 ml) Erlenmeyer-kolbe (til beluftning). Ryste ved den korrekte temperatur for stammen og forsøget (15 - 25 ° C) natten over (> 16 timer ved 20 ° C). I denne tid, vil dyrene alle klækkes og anholdelse i L1 diapause.
- (Dag 2) spinnes L1 fase dyr i et 15 ml rør og resuspender i 0,5 - 1 ml M9 (~ 3000 rpm, 30 sek.). Anbring 5 ul opløsning på en separat plade, og tælle antallet af dyr. Foretag justeringer til den mængde, hvis det er nødvendigt, at give 30 orme / 3 - 10 uL løsning.
- Øje cirka 30 hypochlorit synkroniserede L1 fase dyr på bakterier i hver brønd i den fremstillede 24-brønds plade. For mange more end 30 dyr pr og kan resultere i populationen sulte før modnes. Lad pladen tørre med låg skævt. Sæt låget, og fastgør den med en elastik. Invertere pladen og anbringe det på en passende temperatur i den nødvendige tid til at score på det ønskede tidspunkt. Fordi RRF-3 (pk1426) er en temperaturfølsom allel, var vores screening strain dyr dyrket ved 15 - 17 ° C i tre til fire dage til observation L4 til voksne trin dyr (figur 1).
5. Observation af nematoder
(Dag 5) Når nematoderne er vokset til den ønskede fase (figur 2A), bekræfter, at de positive og negative kontroller giver de forventede fænotyper ved anvendelse af et dissektionsmikroskop. Vi anvender bli-4 som en kontrol for RNAi effektivitet, fordi den frembringer dosisafhængige post-embryonale defekter, der spænder fra forbrændte voksne (mild RNAi fænotype, ikke vist) til udviklingsmæssigt standset, lille larver (stærk, expected RNAi fænotype) (figur 2B). Derefter observere dyr i hver forsøgsgruppe og anvendelse af et dissektionsmikroskop og noter indlysende unormale fænotyper induceret af RNAi (figur 2C). Når kontrollerne er bekræftet og grove fænotyper bemærkes, screene RNAi eksperimenter for fænotyper af interesse. Vi anvender en forbindelse mikroskop udstyret med fluorescens og en 63x objektiv at observere mindst fem dyr fra hver RNAi forsøg begynder med kontroller (figur 3).
- Fremstille et objektglas (standard 75 x 25 mm) ved at foretage en 4% agar pude (4% agar i H2O). At sikre en ensartet tykkelse på agar pude placere en ren glasplade mellem to afstandsstykker (hvert afstandselement fremstillet af et objektglas med to lag af lab tape på det). Pipetter omkring 100 uL (to til tre dråber fra en glas Pasteur-pipette) af smeltet 4% agar på midten af den rene objektglas. Dannelse af en agar pude ved at dække smeltede agar under anvendelse af en yderligere glide placeret hurtigt, men forsigtigt på toppen af afstandsstykkerne ennd det smeltede agar. Udsætte agar puden ved at skyde den objektglas fra hinanden, efterlader puden klæber til et objektglas.
- Placere en ~ 5 uL dråbe af bedøvelsesmiddel (levamisol eller natriumazid, for eksempel) på agar puden. Mount 8 - 12 dyr i den anæstetiske. Dække med en 22 x 22 mm # 1,5 dækglas (eller tykkelsen af dækglasset er bedst egnet til forbindelsen mikroskop) og observere dyr under anvendelse af en forbindelse mikroskop.
- Record gen, antallet af observerede dyr, og fænotype resultaterne for hver RNAi eksperiment. For en skærm, lave og bruge en standard skabelon (se eksempel, figur 5).
- Verificere RNAi produceret fænotype af en anden, sekundær fænotype, hvis det er muligt, og ved at gentage eksperimentet. (For eksempel som vist i eksempel skærmen anvendes ændring af GFP-mærkede DBL-1 lokalisering som en primær screening og krop størrelse som en sekundær screening 20). Bakterier kan anvendes af den samme stribe (opbevaret ved 4 ° C) i op til to måneder. Ældre striber kan rRK i dårlig vækst i flydende overnatskulturer og bør genudstrøget først.
- Sekvensen i det mindste en ende af cDNA-insertet at bekræfte, at indsatsen passer biblioteket mærke (Ahringer biblioteket har haft en pålidelig analyse gennemføres, se http://biocompute.bmi.ac.cn/CelRNAi/ ) 21. Anbefalede primere (for inserter fra enten bibliotek) annealer på steder i L4440-afledte vektor og flankerer insertionsstedet: 5'-AGCGAGTCAGTGAGCGAG-3 'og 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3' (M13f20 primer).
Ved hjælp af denne metode, kan en enkelt person med rimelighed iscenesætte og iagttage to til fire sæt eksperimenter hver uge. For eksempel, iscenesat dyr på mandag og tirsdag kan observeres torsdag og fredag, henholdsvis, og kan igen blive afholdt fredag og lørdag til mandag og tirsdag observation. Afhængigt af fænotype (r) screenes hver dag, kan et sæt omfatte en plade med 24 brønde ved forbindelsen mikroorganismerscopy eller mere, hvis fænotype hurtigt identificeres. Således kan mindst 88 forskellige RNAi eksperimenter ses i en uge, under hensyntagen til positive og negative kontroller og sats på screeningen. En dissektionsmikroskop skærm kan udføres meget hurtigere, uden behov for montering dyr på objektglas til visning. Flere mennesker kan også øge en Lab-gennemløb ved at forskyde skemaer og / eller ved hjælp af flere mikroskoper. En alternativ fremgangsmåde til dyrkning af dyrene på en tynd film af agar og overføre en del af den agar indeholdende dyr direkte til et objektglas til visning kan spare tid. Denne variation blev med succes anvendt til screening mandlige hale abnormiteter ved 400X forstørrelse 22.
6. Repræsentative resultater
Eksempler på normal og ændret lokalisering af GFP-mærkede DBL-1 er vist i figur 3. Normal ekspression af GFP-mærkede DBL-1 indbefatter ventrale nerve ledning cellelegemer og en række af punctae (figur 3A). DBL-1 is alvorligt svækket, når dyr fodres RNA, der forhindrer DBL-1 mRNA translation (figur 3B). DBL-1 (RNAi) producerer også små dyr, den sekundære screening i dette eksempel (data ikke vist). Gener, der påvirker DBL-1 lokalisering identificeres let ved RNAi anvendelse af en stamme designet til dette skærmbillede (figur 3C).
Figur 1. Screen-ordningen til at identificere ekstracellulære regulatorer af DBL-1-signalering. Bakterier fra fodring biblioteket dyrkes natten over, induceret med IPTG og inkuberedes ved 37 ° C i yderligere 4 timer for at tillade de bakterier til at fremstille dobbeltstrenget RNA (dsRNA). 30 ul af den inducerede bakteriekultur plettet per brønd på en 24-brønds NGM (nematodevækst medium) plade indeholdende 25 ug / ml carbenicillin og 1 mM IPTG og får lov at tørre i en steril stinkskab. Vi iscenesætter 1. Larvestadiet (L1) larver ved at lade hypochlorit-behandlet embrYOS klækkes i medierne uden mad, som fremkalder en L1 diapause (arresteret udvikling). Ca. 30 synkroniserede L1 fase dyr udpladet på hver brønd indeholdende bakterier af RNAi biblioteket, som tillader trinvis dyr at genoptage vækst og til at forbruge den dsRNA skabt af bakterierne 23. Efter 72 timer ved 15 ° C, unge voksne orme screenes for en synlig fænotype. I denne alder, er kroppens størrelse defekter indlysende og fluorescens er lys fra texIs100 transgenekspression.
Figur 2. Eksempler på fænotyper at identificere før screening. Alle billeder af dyrene på en plade og blev taget ved den samme forstørrelse ved hjælp af et dissektionsmikroskop. Dyrene blev hele afbildes cirka 72 timer efter udpladning med udsultet L1 larver. Alle billeder blev behandlet identisk. A) RNAi af et gen, der giver nogen grove morfologiske defekter. Dyr er vildtype. B) RNAi af bli-4. Dyr viser standset udvikling og er lille i forhold til dyrene i panel A. C) RNAi af dpy-13. Dyr er på samme udviklingstrin som dyr i panel A, men vise en "dumpy" krop morfologi.
Figur 3. Eksempler på fluorescerende taggede protein, og hvor RNAi af specifikke gener ændrer lokalisering mønster. Alle billeder blev taget med 630x forstørrelse med roterende skive konfokal mikroskopi, 5 sek. eksponering. Målestokken = 10 um. Alle billeder blev behandlet identisk. Åbne pilespidser angiver cellelegemer. Pile markerer linje punctae. Udfyldte pilespidser angiver nogle aberrerende lokaliseret GFP-mærkede DBL-1. A) RNAi-fodrede pseudogen C06C3.5 ("vildtype"). B) DBL-1 (RNAi) kontrol. C) RNAi af et gen påkrævet for normal lokalisering af GFP-mærkede DBL-1.
Figur 4. Skabelon eksempel til sporing RNAi eksperimenter (bibliotek kloner) i 24-brønds plader. Denne skabelon kan anvendes til at skabe en permanent registrering af forsøgene, i modsætning til direkte mærkning plader.
Figur 5. Skabelon eksempel til optagelse RNAi fænotyper. Ekspandere efter behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNAi screeningsmetode præsenteret her muliggør en følsom og hurtig analyse af genprodukter, der kræves for en normal (eller transgene) postembryonic fænotype. Det viste eksempel er en screening for gener involveret i den subcellulære lokalisering af en fluorescens-mærket protein. Imidlertid kan denne protokol kan modificeres til at identificere gener, der påvirker andre postembryonic fænotyper af interesse.
Denne fremgangsmåde drager fordel af en kandidat-gen fremgangsmåde ved anvendelse af en RNAi bibliotek. Forward genetiske skærme med mutageneseteknikker teknikker identificere tilfældigt fremkaldte nye alleler, men de alleler kræve en betydelig tid, kræfter og / eller midler til at identificere 24. Med cDNA-biblioteket, på den anden side sekventering af cDNA-insertet, der forårsagede en RNAi fænotype af interesse hurtigt bekræfter kandidat-gen. Også kloning-ready cDNA inserts lette efterfølgende analyser af de identificerede kandidater. Endvidere, gener, der er dødelige, når muteretkan identificeres og analyseres ved hjælp af RNAi. Ved at placere klækkede dyr på de inducerede bakterier, tillader denne metode observation af postembryonic fejl og mangler i gener, der også har vitale embryonale roller.
Vær omhyggelig med at bekræfte, at observerede dyr ikke bliver sultet. Sult kan påvirke fænotype af dyret. Hvis hidtil ukendte RNAi fænotyper er identificeret i sultne dyr, gentages for at bekræfte, at fænotypen er et resultat af RNAi og ikke sult. At forhindre sult, anvendes friske bakterier, som er blevet dyrket til stationær fase (vækstmediet meget "uklar"), og bruger kun ~ 30 dyr per brønd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dr. Rick Padgett (Waksman Institute, Rutgers University, NJ) for gaven af DBL-1 cDNA og Dr. Christopher Rongo (Waksman Institute, Rutgers University, NJ) for en injektion markør. Dr. Barth Grant laboratorium udførte genkanonen bombardement for lavt kopital integration af GFP-mærkede DBL-1-konstruktionen. Den René Garcia Laboratoriet ydet faglig bistand under oprettelsen af texIs100. Den René Garcia, Robyn Lints, og Hongmin Qin laboratorier forudsat produktiv rådgivning. Dette arbejde blev finansieret af start-up midler fra TAMHSC Institut for Molekylær og cellemedicin. Den forbindelse omfang og spinning disk konfokal blev købt med midler fra afdelingen og TAMHSC College of Medicine kontor dekanen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NGM Agar | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc | Can be prepared following NGM agar protocol25 |
| M9 Medium | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1 mM MgSO4 |
||
| Agar-Agar | EMD Millipore | 1.01614.1000 | 2% in water for NGM plates. 4% in water for microscope slide pads (autoclave initially and microwave to melt thereafter). |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | 0.25% |
| IPTG | Research Products International Corp. | I56000-5.0 | 1 mM final concentration |
| carbenicillin | Research Products International Corp. | C46000-5.0 | 50 μg/ml working dilution |
| LB Broth Lennox | BD Biosciences | 240230 | 20 g/liter |
| tetracycline | Sigma-Aldrich | 268054 | 12.5 μg/ml working dilution |
| sodium hypochlorite | Any Supplier | 5% household bleach | Use fresh bleach. |
| sodium hydroxide | Any Supplier | CAS 1310-73-2 | 5 N stock |
| M9 medium | Wormlab Recipe Book | http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab | 26 |
| levamisol | Sigma-Aldrich | 31742 | 100 μM - 1 mM working dilution |
| sodium azide | Fisher Scientific | S227 | 10 mM in M9 working dilution |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | VWR distributor |
| microscope slides | Any Supplier | 75 x 25 x 1 mm | |
| microscope cover slips | Any Supplier | 22 x 22 mm No.1.5 | Use the thickness recommended by the microscope manufacturer. |
| compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives and filters to match the needs of the experiment. |
| media pump | Manostat Varistaltic pump | Kate model #72-620-000 | Use tubing and settings appropriate for the machine |
References
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).
- Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nat. Rev. Genet. 9, 554-566 (2008).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
- Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. Trimethylpsoralen induces small deletion mutations in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 1381-1385 (1994).
- Frokjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 40, 1375-1383 (2008).
- Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cell. Mol. Life. Sci. , (2011).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).
- Mello, C., Fire, A.
- Simmer, F. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Zhuang, J. J., Hunter, C. P. Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans enhanced RNAi mutants. Genetics. , (2011).
- Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity using enhanced RNAi-sensitive strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 489-497 (2007).
- Wang, D. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- Fraser, A. G. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
- Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Peters, K., McDowall, J., Rose, A. M. Mutations in the bli-4 (I) locus of Caenorhabditis elegans disrupt both adult cuticle and early larval development. Genetics. , 129-195 (1991).
- Thacker, C., Peters, K., Srayko, M., Rose, A. M. The bli-4 locus of Caenorhabditis elegans encodes structurally distinct kex2/subtilisin-like endoproteases essential for early development and adult morphology. Genes & Development. 9, 956-971 (1995).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Dev. Biol. 51, 23-33 (1976).
- Stiernagle, T.
- Savage-Dunn, C. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Qu, W. Reliability analysis of the Ahringer Caenorhabditis elegans RNAi feeding library: a guide for genome-wide screens. BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).
- Nelson, M. D. A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, e1002010 (2011).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sarin, S., Prabhu, S., O'Meara, M. M., Pe'er, I., Hobert, O. Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing. Nature Methods. 5, 865-867 (2008).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T.
- Brenner, S.
