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Biology

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans Published: February 13, 2012 doi: 10.3791/3442
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular and Cellular Medicine, Texas A&M University System Health Science Center

Summary

우리의 단백질 표현 및 현지화의 postembryonic 규제를 식별할 수 sensitized 방법을 설명

Abstract

C. elegans는 많은 유전자와 유전자 경로 1의 발견과 기능적 특성에 대한 유용한 모델 시스템 것으로 입증되었습니다. 보다 정교한 도구와이 시스템의 연구를위한 자원이 더 미묘한 phenotypes이나 역할과 유전자의 지속적인 발견을 촉진하고 있습니다.

여기에서 우리는 C를 식별 맞게 일반화된 프로토콜을 제시 RNAi 2를 사용 흥미 postembryonic phenotypes와 elegans의 유전자. 이 절차는 쉽게 여부 해부 또는 복합 현미경의 빛 또는 형광 광학에 의해 검정 선택의 표현형으로 수정됩니다. 이 심사 프로토콜은 유기체의 물리적 자산 및 분자 도구 C.에 capitalizes elegans 연구 커뮤니티하였습니다. 예를 들어, 우리는 이것의 일반적인 로컬 라이제이션에 필요한 유전자를 식별하기 위해 RNAi 화면에 형광등 제품을 표현하는 통합 transgene의 사용을 보여줍니다늦은 무대 애벌레와 어른의 제품입니다. 첫째, 우리는 전체 길이 cDNA 삽입으로 상용 게놈 RNAi 라이브러리를 사용했습니다. 이 라이브러리는 후보 유전자 산물의 RNAi 감소하여 여러 후보자의 급속한 식별을 용이하게합니다. 둘째, 우리는 RNAi를 구분 배경에 관심이 우리의 fluorecently 태그가 단백질을 표현 통합 transgene을 올렸습니다. 셋째, RNAi에 부화 동물을 노출하여,이 화면은 특별히 관심 단백질을 규제에서 사후 배아 역할을 숨길 수있는 중요한 배아 역할을 유전자 제품의 식별을 허용합니다. 마지막으로,이 화면은 단세포 결의안에 대한 갖춘 복합 현미경을 사용합니다.

Protocol

1. 상영 스트레인 공사

심사 변형의주의 디자인 화면의 성공에 중요하고 다른 곳에서 3 설명되었습니다. 일부 연구자의 경우 transgene에서 눈에 띄는 제품을 표현하는 변형을 사용하는 것은 실험을 위해 필요합니다. 통합 transgenes을 품고 많은 변종이 CGC 또는 개별 연구자로부터 구할 수 있습니다. 유전자 변형 변형율가 화면에 필요하지만, 사용할 수없는 경우, 그것은 충격 4, UV / TMP 5 또는 모스 transposon 삽입 6과 같은 출판 방법을 사용하여 생성할 수 있습니다. 관심의 단백질을 시각화하기 위해, 우리는 (우리가 dbl-1 시퀀스를 사용) 성숙 cDNA 시퀀스와 프레임에 GFP-코딩 순서를 삽입. 이 GFP 융합 단백질이 범위를 해부하여 표시되지이기 때문에, 우리는 가시였다 coinjection 마커를 사용하고 관심이 우리의 단백질의 감상에 영향을주지 않았다 (ttx-3P :: RFP 7을 참조하십시오. 그러면 extrachromosomal 배열에서 통합 transgene을 만들었습니다. 우리는 transgene의 충격은 역시 (Beifuss 및 Gumienny, 게시되지 않은) 해부 현미경의 표현형를 구하지 않고 GFP-태그를 제품의 표시 수준을 생산하는 낮은 사본 번호 통합된 라인을 굴복 발견. 원래 주사 8,9 만든 여러 사본 extrachromosomal 배열의 UV / TMP 통합 transgene 제품의 수준 (그림 3A)을 구조, 표시 굴복. 안티 GFP 항체와 서양 얼룩은 transgene (allele 이름 texIs100)이 표현하고 (Beifuss 및 Gumienny, 게시되지 않은) 정확하게 처리되고 있음이 확인되었습니다. 통합 transgenes에 관계없이 소스의 관계없는 배경 변이를 제거하는 다섯 번이나 outcrossed해야합니다.

우리의 스크린에 대해서는이자 유일한 단백질은 유전자 변형, 태그가 추가된 형태가되고 싶었어요. 따라서 기능적 내생 G를 제거손실의 기능 돌연변 dbl-1 allele을 도입하여 에너지 절약.

RNAi의 효과에 마지막으로, 우리는 sensitized 변형. 동물이 적절한을 선택할 때이자 조직 (S)가 고려되어야 RNAi 10,11의 영향으로 동물을 sensitizes 돌연변이 포함될 경우 라이브러리에서 RNAi는 여러 유전자에 대해 유전자 산물에 더 심각한 감소를 생산합니다 RNAi 배경 11 sensitizing. 우리는 우리의 심사 부담을 만들기 위해 표준 rrf-3 (pk1426) allele를 사용했습니다. RRF-3는 일반적으로 체세포 RNAi 10을 억제 RNA의 감독의 RNA 중합 효소의 (RdRP) 상동체입니다. eri-1 또는 eri-1-15b 린과 같은 다른 RNAi hypersensitizing 유전자의 변이는 RNAi 11-13의 효과를 높이기 위해 대신 사용할 수 있습니다.

texIs100; dbl-1 (nk3) 우리가 만든 심사 발표했던 유전자형 rrf-3 (pk1426)이 있습니다.

2. 선택 및 준비RNAi 라이브러리

상용 C. elegans cDNA 도서관은 C.에 예측된 유전자의 약 55% 또는 87%를 나타냅니다 elegans 개별적으로 (비달 연구실이나 실험실 Ahringer 라이브러리, 각각). 개인 클론 구매 (열기 Biosystems, Geneservice 공사)에 사용할 수 있습니다. 그것의 클론 대부분 장편 cDNAs 게이트웨 복제 및 다운 스트림 응용 프로그램 (Invitrogen 주식 회사, Carlsbad, CA)에 대한 준비가되어 있기 때문에 우리는 비달 연구소 (열기 Biosystems)에 의해 건설 ORF-RNAi 라이브러리를 선택했습니다. 원래 Ahringer 연구소 게놈 cDNA 라이브러리는 하류 특성화 실험 14,15 위해 널리 유용하지 않은 cDNA 조각이 포함되어 있습니다. 두 도서관은 삽입합니다 (그림 1) 측면이 T7의 발기인을 포함하는 벡터를 사용합니다. 구조는 이소 프로필-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)에 의해 유도시 T7의 효소를 표현 세균성 변형 HT115, 재배하고 있습니다. 도서관 클론을 포함하는 박테리아에 IPTG로 유도하고 있습니다dsRNA를 (단계 3.4를 참조) 생산하고 있습니다.

수령시 전체 라이브러리를 복사하고 모든 실험에 대한 중복을 사용합니다. 원본과 중복되는 라이브러리는 전기 라인을 분리하는 연결된 다른 -80 ° C의 냉동고에 보관해야합니다.

3. 도서관 클론과 세균의 작성

  1. 선택한 먹이 라이브러리 클론뿐만 아니라 긍정적이고 부정적인 통제, 레이블 LB-carbenicillin / 테트라 사이클린 접시에 (우리는이 100 밀리미터 판 당 8 문화를 성장)에서 깨져 박테리아 (두 실험 개월 이내)과 37 ° C에서 하룻밤 (를 품어 > 16시간) (그림 1). 각각 24도 접시, 두 컨트롤을 사용하세요. 긍정적인 제어, BLI-4 (K04F10.4)는 복용량에 의존 사후 배아 pheontype 16,17을 생산하고 있습니다. 부정적인 제어, C06C3.5는 예측 pseudogene (즉 WormBase.org 더 관찰된 phenotypes (Beifuss 및 Gumienny, 게시되지 않은)을 발생하지 않음). 50 μg / ML carbenicillin 및 1mM IPTG - (실험 2 개월 이내, 기왕이면 빨리) 25을 포함한 24 잘 선충류 성장 매체 (NGM) 접시를 준비합니다. 4 ° C.에 저장
  2. (주 1) 각 클론의 경우, 표준 무균 기술을 사용 streaked 접시 (S) (단계 3.1)에서 하나의 식민지로 50 μg / ML carbenicillin를 포함하는 두 ML의 LB 미디어의 예방. 37 품어 ° C에서 하룻밤 (> 16시간) 220까지 흔드는 집합에 - 240 RPM (그림 1). 솔루션은 16 시간 이후 흐린 있어야합니다.
  3. (주 2) 다음날 아침, 1mM의 최종 농도로 문화 IPTG 추가하여 표류하는 RNA (dsRNA) 생산을 두 배로 유도. 5시간 - 추가 4 240 RPM, - 37 ° C, 220에서 문화를 품다. 이 단계 NGM 판 (3.5 단계에서)의 한천에 전적으로 IPTG에 의존보다 유전자 산물의보다 일관되고 강력한 RNAi-유도 최저를 보장합니다.
  4. 각 유도된 세균성 세제곱의 명소 30 μl50 μg / ML carbenicillin 및 1mM IPTG (그림 1, RNAi 실험을 추적하는 데 사용되는 템플릿에 대한 그림 4 참조) - 25을 포함한 24 잘 NGM RNAi 플레이트 별도의 우물에 lture. 20 분 동안 멸균 유동 후드이나 세균성 반점이 건조까지 밝혀낸 접시, 놔. overdry하지 마십시오. Overdrying는 한천의 가장자리들이 인한 틈새로 크롤 링하지 않으면 회복할 수없는 것이다 판과 동물에서 떨어져 당길됩니다.

4. nematodes의 작성

nematodes의 무대 인구 시작합니다. 동물을 준비하는 것은 컨트롤과 실험적인 RNAi 실험 사이에서 관찰 차이 (RNAi가 발달 지연을 초래하는 경우 그러나, 이것은 (그림 2) Screener가에 의해 언급되어야 함) 단순히 동물의 발달 단계의 차이로 인해 발생하는 기회를 감소 . 또한, L1의 애벌레와 RNAi 실험을 시작하는 것은 세대의 RNAi에 의해 배아 주죠 잠재적인 혼란함을 주죠 효과를 obviates초밖에 그것은 또한 흥미 postembryonic 역할을 수 있습니다.

스테이징 처음에만 달걀 껍질로 보호되는 배아는 생존 심사 변형의 혼합 단계 인구를 표백하여 수행됩니다. 20 ° C에서 약 12 시간 또는 16 ° C ~ 18시 약 18 시간 이내에 이러한 단계는 동물. 더 단단히 무대 동물, 음식없이 M9 매체에서 배아의 부화를시키는하여 최초의 애벌레 단계 (L1)에서 체포 동물. 굶어 L1 동물 19 같은 시작 연령으로부터 식품 이력서 성장에 위치.

  1. (1 일) 수사관 세 100mm 접시, gravid 성인과 배아를 포함하는 깨끗한 심사 변형 동물을 사용합니다. 동물 배아를 풀어야 부드럽게 플레이트 표면을 가로질러 액체를 pipeting하여 멸균 M9를 사용하여 접시에서 동물을 씻으십시오. 스크루 캡과 멸균 15 ML 관에 빨래를 전송합니다.
  2. 빨래가 3.5 ML보다 큰 경우 동물 (30 초 ~ 3,000 RPM) 다운 스핀 3.5 ML에 액체 제거합니다. 빨래 내가있다면3.5 ML보다 ESS는, 3.5 ML를 집계하는 튜브에 H 2 0이나 M9를 추가합니다.
  3. 화학 물질을 취급하면서 적절한 보호 장구를 (실험실 외투, 장갑 및 고글) 착용하십시오. 한 ML 신선한 표백제 (5 % 나트륨 차아 염소 산염, 이전 미만 1 년)로 0.5 ML 5 N NaOH를 섞습니다. 3.5 ML의 선충류 세척에이 혼합물을 추가합니다. 세는 타이머를 시작합니다. 이 과정은 10 분 이상 걸리지 않을 거예요. 그것을 행하는 경우, 배아가 파괴되고 수확량이 줄어들 수 있거나 표백제가 오래되어 교체해야합니다.
  4. 약 10 초 동안 소용돌이 튜브를. vortexing에게 4~10분 위해 2 분마다 반복합니다. 각 vortexing 후, 동물의 시체에 대한 해부 현미경 솔루션을 관찰합니다.
  5. 배아가 출시되어 성인 (6-8분) 조각하는 경우 테이블 탑 원심 분리기 (~ 3,000 rpm을 30 초)에 튜브를 방적하여 펠렛에게, 배아합니다.
  6. 펠렛을 방해하지 않고 가능한 한 뜨는의만큼 기​​음. 조심하지욕심.
  7. ~ 10ml에 살균 M9를 추가합니다. 와동의 짧게 또는 펠렛을 resuspend 위해 잘 흔들.
  8. 스핀 다시 뜨는 제거합니다. 표백제 냄새가 튜브에서 감지할 수있다면, 필요한 린스 반복한다.
  9. 10 Resuspend 배아 - 15 ML 멸균 M9과 소형 (25 ML) Erlenmeyer 플라스크 (통기 용)로 전송. 야간 (20시> 16시간 ° C). - 변형 및 실험을위한 적정 온도 (25 ° C ~ 15)에서 흔들어 이 시간에 동물들은 모두 부화되고 L1의 diapause에서 체포.
  10. 한 ML M9 (~ 3000 RPM, 30 초.) - (주 2) 0.5의 15 ML 튜브 및 resuspend의 L1 무대 동물을 아래 던가. 별도의 접시에 5 μL 솔루션을 놓고 동물의 수를 계산합니다. 10 μL 솔루션 - 필요한 경우 30 웜 / 3를 양보하기 위해, 볼륨을 조정합니다.
  11. 준비된 24 잘 플레이트의 각 우물에 세균쪽으로 약 30 염소산 동기 L1 단계 동물을 정확 해요. 너무 많은 MO물론 30 동물보다 다시 성숙에 도달하기 전에 굶주린 인구가 발생할 수 있습니다. 뚜껑에 비스듬히로 건조 판 구. 뚜껑을 교체하고 고무 밴드로 고정하십시오. 접시를 반전하고 원하는 단계에서 득점을하는 데 필요한 시간에 적절한 온도에 가져 오십시오. rrf-3 (pk1426)는 온도에 민감한 allele이기 때문에, 우리의 심사 변형 동물 15에서 재배되었다 - 17 ° C 3-4일 동안 성인 무대 동물 (그림 1) L4 관찰합니다.

5. nematodes의 관측

nematodes 원하는 단계 (그림 2A)로 성장했으면 (5 일), 긍정적이고 부정적인 컨트롤 해부 현미경을 사용하여 예상 phenotypes를 생성했는지 확인합니다. 그것이 선량 종속적인 사후 배아 결함을 생산하기 때문에 우리는 RNAi의 효능에 대한 제어로서 BLI-4를 사용하여 그 물집 성인 (가벼운 RNAi의 표현형, 보이지 않음)에서 다양한 발달 체포, 작은 애벌레 (에 강한 전자xpected RNAi의 표현형) (그림 2B). 그런 다음 잘 RNAi (그림 2C)에 의해 유도된 해부 현미경과 메모 명백한 비정상 phenotypes을 사용하여 각 실험에 동물을 관찰합니다. 컨트롤이 확정하고 총 phenotypes가 언급되고 나면, 관심 phenotypes에 대한 RNAi 실험을 차단. 우리는 컨트롤 (그림 3)으로 시작, 형광 및 각 RNAi 실험에서 적어도 다섯 동물을 관찰하기 위해 63x 목적 갖춘 복합 현미경을 사용합니다.

  1. 4 % 한천 패드 (H 2 O 4 %의 한천)을 만들어 슬라이드 (표준 75 X 25mm)를 준비합니다. 한천 패드의 균일한 두께를 보장하기 위해 두 개의 스페이서 (각 스페이서는 그것에 실험실 테이프 두 레이어와 현미경 슬라이드로 만들어져있다) 사이의 깨끗한 유리 슬라이드를 넣습니다. 깨끗한 유리 슬라이드의 중앙쪽으로 용융 4 % 한천 100 μL (유리 파스퇴르의 pipet 2-3 드랍스)에 대한 피펫. 스페이서 상단에 신속하게하지만 천천히 삽입 추가 슬라이드를 사용하여 용융 한천을 포함하여 한천 패드를 형성차 녹은 한천합니다. 부드럽게 패드 한 슬라이드에 준수 떠나는 사슴이 유리 슬라이드를 밀어서 한천 패드를 쉽게받을 수 있습니다.
  2. 한천 패드에 마취 중 ~ 5 μL 드롭 (levamisole 또는 나트륨 azide, 예를 들어)를 놓습니다. 산 8 - 마취 12 동물. 22 X 22mm # 1.5 coverslip (또는 최고의 복합 현미경 적합 coverslip의 두께)과 복합 현미경을 사용하여 동물을 관찰로 커버.
  3. 각각의 RNAi 실험에 대한 기록 유전자 관찰 동물의 수, 그리고 표현형 결과입니다. 화면을 보려면하고 표준 템플릿 (예을 참조 그림 5)을 사용합니다.
  4. 가능하다면, 그리고 실험을 반복하여, 또, 중등 표현형 의해 RNAi 생산 표현형을 확인합니다. (예를 들어, 예제 화면이 보조 화면을 20과 같은 기본 화면 및 신체 크기로 GFP-태그를 DBL-1 지방화의 변조를 사용하여 표시됩니다.) 박테리아까지에 대해 동일한 행진 (4 ° C에 저장된)에서 사용될 수 이개월. 이전 줄무늬는 R 수액체 야간 문화와 가난한 성장 esult 먼저 restreaked해야합니다.
  5. 순서 적어도 하나 이상 삽입 라이브러리 라벨 (Ahringer 도서관 수행 신뢰성 분석을했다,보고와 일치하는지 확인하기 위해 cDNA 삽입 끝 http://biocompute.bmi.ac.cn/CelRNAi/을 ) 21. 5'-AGCGAGTCAGTGAGCGAG-3 '와 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'(M13f20 프라이머) : 추천 primers는 (어느 라이브러리에서 삽입을위한) L4440-파생된 벡터 및 측면 삽입 사이트의 사이트에 어닐링.

이 방법을 사용하여, 한 사람이 합리적으로 무대와 실험 2-4 세트 매주 볼 수 있습니다. 예를 들어, 동물들은 월요일에 개최하고 화요일은 각각 목요일과 금요일 관찰할 수있다, 다시 월요일과 화요일 관찰을 위해 금요일과 토요일에 개최됩니다. 매일 상영 표현형 (들)에 따라 세트 화합물 마이크로하여 한 24도 플레이트를 구성하는 수scopy 또는 표현형가 신속하게 식별되는 경우 더. 따라서 적어도 88 가지 RNAi 실험은 계정에 긍정적이고 부정적인 컨트롤과 심사의 속도로 복용 한 일주일 만에 볼 수 있습니다. 해부 스코프 화면보기를위한 슬라이드에 동물을 장착 필요없이 훨씬 빠르게 수행할 수 있습니다. 여러 사람들이 여러 현미경을 사용하여 엄청난 스케줄 및 / 또는에 의해 실험실의 처리량을 높일 수 있습니다. 한천의 박막에 동물 성장하고 볼 슬라이드에 직접 동물을 포함 한천의 슬라이스를 전송하는 다른 방법은 시간을 절약할 수 있습니다. 이러한 변화가 성공적으로 400x 배율 22 시에 남성 꼬리 이상 상영을 위해 사용되었다.

6. 대표 결과

GFP-태그가 DBL-1의 정상과 변경된 로컬 리 제이션의 예는 그림 3에 표시됩니다. GFP-태그가 DBL-1의 정상적인 표현이 복부 신경 코드 세포 기관 및 punctae (그림 3A)의 행을 포함합니다. DBL-1 전의 동물이 RNA를 먹인 때 심각하게 감쇠 dbl-1 mRNA의 번역을 방지 그 (그림 3B). dbl-1 (RNAi)는 또한이 예제 (데이터가 표시되지 않음)의 보조 화면이 작은 동물을 생산하고 있습니다. DBL-1 지방화에 영향을 미치는 유전자는 즉시이 화면 (그림 3C)을 위해 설계 변형을 사용하여 RNAi에 의해 식별됩니다.

그림 1
1 그림. 화면 구성표는 DBL-1 신호 전달의 세포 규제를 식별합니다. 수유 라이브러리에서 박테리아, 하룻밤 재배 IPTG로 유도하고, 박테리아가 이중 좌초 RNA (dsRNA)를 생산할 수 있도록 추가로 4 시간 동안 37 ° C에서 incubated됩니다. 유도된 세균성 문화의 30 μl은 25 μg / ML carbenicillin 및 1mM IPTG를 포함하는 24 잘 NGM (선충류의 성장 매체) 플레이트 위에 인당 잘 발견하고 멸균 흐름 후드에 건조 허용됩니다. 우리는 차아 염소 산염 - 대우 embr 놓아 첫번째 애벌레 단계 (L1) 애벌레를 개최yos는 L1 diapause (체포 개발)를 유도 음식없이 언론에 부화. 약 30 동기 L1 단계 동물은 성장을 재개하고 세균 23 일까지 만든 dsRNA를 소비하는 동물을 개최있게 RNAi 라이브러리에서 각각 잘 포함하는 박테리아에 도금하고 있습니다. 15 ° C, 젊은 성인 벌레가 눈에 띄는 표현형 동안 상영되는에서의 72 시간 후에. 이 나이, 신체 크기 결함이 분명하며 형광이 texIs100 transgene 발현의 밝고입니다.

그림 2
그림 2. 심사 전에 확인하는 phenotypes의 예. 접시에있는 동물의 모든 이미지는 잘 해부 현미경을 사용하여 같은 배율로 촬영되었다. 동물은 모든 굶주린 L1의 유충과 같은 도금 후 72 시간 정도 몇 군데 있었다. 모든 이미지는 동일하게 취급되었다. )에는 총 형태학의 결함을 제공하지 유전자의 RNAi. 동물 야생 유형을 나타납니다. B) RNBLI-4의 아이. 동물 dpy-13의 RNAi)은 체포 개발을 표시하고, 패널 A. C의 동물에 비해 작은 수 있습니다. 동물 패널의 동물로서 발전의 동일한 단계에서지만, "땅딸보"신체 형태를 표시합니다.

그림 3
그림 3. fluorescently 태그가 단백질의 예로는 방법과 RNAi 특정 유전자가 지방화 패턴을 바꿀지도 모르겠어. 모든 이미지는 스피닝 디스크 공촛점 현미경, 5 초과 630x 배율에서 찍은되었다. 노출. 스케일 막대 = 10 μm의. 모든 이미지는 동일하게 취급되었다. 오픈 화살촉은 세포의 시체를 나타냅니다. 화살표는 punctae의 라인을 표시합니다. 채움 화살촉 어떤 aberrantly화된 GFP-태그를 DBL-1을 나타냅니다. ) RNAi로 자란 pseudogene C06C3.5 ( "야생 형"). B) dbl-1 (RNAi) 제어. C) GFP-태그를 DBL-1의 정상적인 지방화에 필요한 유전자의 RNAi.

"그림 4 그림. 24 잘 접시에 RNAi 실험 (라이브러리 클론)를 추적하는 템플릿 예제. 이 템플릿은 직접 번호판을 레이블링 달리 실험 영구 기록을 작성하는 데 사용할 수 있습니다.

그림 5
그림 5. 녹음 RNAi의 phenotypes에 대한 템플릿 예제. 필요한 경우를 확장합니다.

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Discussion

여기서 제시 RNAi 심사 방법은 정상적인 (또는 형질) postembryonic 표현형에 필요한 유전자 제품의 민감하고 빠른 분석을 가능하게합니다. 표시 예제 fluorescently 태그가 단백질의 subcellular 지방화에 관련된 유전자에 대한 화면입니다. 그러나,이 프로토콜은 관심사의 다른 postembryonic phenotypes에 영향을 미치는 유전자를 식별하기 위해 수정할 수 있습니다.

이 방법은 RNAi 라이브러리를 사용하여 후보 유전자 접근 방법을 이용합니다. 돌연변이 유발 기술을 사용하여 앞으로 유전 화면 무작위로 유도된 소설 대립 유전자를 식별하지만, 이러한 대립 유전자는 24을 식별하는 데 상당한 시간과 노력, 그리고 / 또는 자금을 필요로합니다. cDNA 라이브러리로, 반면에 관심이 RNAi의 표현형 빠르게 후보 유전자를 확인 의한 cDNA 삽입 순서. 또한 복제 가능한 cDNA 삽입이 확인된 후보자의 다운 스트림 분석을 용이하게합니다. 변이된 때 치명적이다 또한, 유전자식별 및 RNAi를 사용하여 분석할 수 있습니다. 유도 박테리아에 부화 동물을 배치하면이 방법은 또한 중요한 배아 역할을 유전자에 대한 postembryonic 결함의 관찰을 허용합니다.

관찰된 동물 굶주려 있지 않은지 확인하기 위해주의를 기울입니다. 기아 동물의 표현형 영향을 미칠 수 있습니다. 소설 RNAi의 phenotypes는 굶주린 동물에서 확인된 경우, 표현형는 RNAi 아니라 기아의 결과임을 확인하기 위해 반복한다. 기아를 방지하기 위해 고정 단계 (성장 매체는 매우 "구름"입니다)에 재배되어 신선한 박테리아를 사용하고, 잘마다 ~ 30 동물을 사용합니다.

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Disclosures

우리는 공개 할게 없다.

Acknowledgments

저자 분사 마커에 대한 dbl-1 cDNA와 닥터 크리스토퍼 Rongo (Waksman 연구소, Rutgers 대학, 뉴저지)의 선물 박사 릭 Padgett (Waksman 연구소, Rutgers 대학, 뉴저지)에 감사드립니다. 닥터 바스 그랜트의 연구실에서 GFP-태그를 dbl-1 구조의 낮은 사본 번호 통합을위한 유전자 총기 포격을 수행. 르네 가르시아 연구실 texIs100의 창출 동안 기술 지원을 제공했습니다. 르네 가르시아, 로빈의 Lints 및 Hongmin 진 실험실 생산적인 조언을 제공했습니다. 이 작품은 분자 및 세포 의학 TAMHSC학과 시동 기금에 의해 자금 지원되었다. 화합물 범위와 회전 디스크 공촛점는 부서와 딘의 의학 사무소의 TAMHSC 대학에서 제공하는 자금으로 구입했습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NGM Agar Nematode growth medium IPM Scientific, Inc Can be prepared following NGM agar protocol25
M9 Medium 22mM KH2PO4,
42mM Na2HPO4,
86mM NaCl,
1 mM MgSO4
Agar-Agar EMD Millipore 1.01614.1000 2% in water for NGM plates. 4% in water for microscope slide pads (autoclave initially and microwave to melt thereafter).
Bacto Peptone BD Biosciences 211677 0.25%
IPTG Research Products International Corp. I56000-5.0 1 mM final concentration
carbenicillin Research Products International Corp. C46000-5.0 50 μg/ml working dilution
LB Broth Lennox BD Biosciences 240230 20 g/liter
tetracycline Sigma-Aldrich 268054 12.5 μg/ml working dilution
sodium hypochlorite Any Supplier 5% household bleach Use fresh bleach.
sodium hydroxide Any Supplier CAS 1310-73-2 5 N stock
M9 medium Wormlab Recipe Book http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab 26
levamisol Sigma-Aldrich 31742 100 μM - 1 mM working dilution
sodium azide Fisher Scientific S227 10 mM in M9 working dilution
24-well plate Greiner Bio-One 662160 VWR distributor
microscope slides Any Supplier 75 x 25 x 1 mm
microscope cover slips Any Supplier 22 x 22 mm No.1.5 Use the thickness recommended by the microscope manufacturer.
compound microscope Carl Zeiss, Inc. A1m Use objectives and filters to match the needs of the experiment.
media pump Manostat Varistaltic pump Kate model #72-620-000 Use tubing and settings appropriate for the machine

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References

  1. Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
  2. Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).
  3. Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nat. Rev. Genet. 9, 554-566 (2008).
  4. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
  5. Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. Trimethylpsoralen induces small deletion mutations in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 1381-1385 (1994).
  6. Frokjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 40, 1375-1383 (2008).
  7. Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cell. Mol. Life. Sci. , (2011).
  8. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).
  9. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
  10. Simmer, F. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
  11. Zhuang, J. J., Hunter, C. P. Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans enhanced RNAi mutants. Genetics. , (2011).
  12. Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity using enhanced RNAi-sensitive strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 489-497 (2007).
  13. Wang, D. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
  14. Fraser, A. G. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
  15. Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
  16. Peters, K., McDowall, J., Rose, A. M. Mutations in the bli-4 (I) locus of Caenorhabditis elegans disrupt both adult cuticle and early larval development. Genetics. , 129-195 (1991).
  17. Thacker, C., Peters, K., Srayko, M., Rose, A. M. The bli-4 locus of Caenorhabditis elegans encodes structurally distinct kex2/subtilisin-like endoproteases essential for early development and adult morphology. Genes & Development. 9, 956-971 (1995).
  18. Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Dev. Biol. 51, 23-33 (1976).
  19. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  20. Savage-Dunn, C. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
  21. Qu, W. Reliability analysis of the Ahringer Caenorhabditis elegans RNAi feeding library: a guide for genome-wide screens. BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).
  22. Nelson, M. D. A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, e1002010 (2011).
  23. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
  24. Sarin, S., Prabhu, S., O'Meara, M. M., Pe'er, I., Hobert, O. Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing. Nature Methods. 5, 865-867 (2008).
  25. Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology. 48, 3-29 (1995).
  26. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).

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발달 생물학 이슈 60 RNAi 라이브러리 화면, postembryonic 개발
에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사<em> C. elegans</em
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Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. RNAi … More

Beifuss, K. K., Gumienny, T. L. RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3442, doi:10.3791/3442 (2012).

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