Summary
Мы описываем чувствительный метод для выявления постэмбрионального регуляторов экспрессии белка и локализации
Abstract
C. Элеганс оказалась ценной моделью системы для обнаружения и функциональные характеристики многих генов и генных пути 1. Более сложные инструменты и ресурсы для проведения исследований в этой системе, способствуют дальнейшей открытие генов с более тонким фенотип или ролей.
Здесь мы приводим обобщенный протокол мы адаптировали для выявления C. Элеганс генов постэмбрионального фенотипы интерес использование RNAi 2. Эта процедура легко модифицируется для анализа фенотипа выбор, будь то свет или флуоресценции оптики на вскрытии или составной микроскоп. Этот протокол обследования капитализирует на физические активы организма и молекулярные инструменты C. Элеганс научное сообщество произвел. В качестве примера мы демонстрируем использование интегрированных трансгена, что выражает флуоресцентного продукта в экран RNAi, чтобы идентифицировать гены, необходимые для нормальной локализации этогоПродукт в конце стадии личинки и взрослые. Во-первых, мы использовали коммерчески доступный геномный RNAi библиотека с полной кДНК вставки. Эта библиотека обеспечивает быструю идентификацию нескольких кандидатов RNAi снижение продукт гена кандидата. Во-вторых, мы получили интегрированную трансгена, что выражает наше fluorecently меченый белок в РНК-интерференции с учетом фона. В-третьих, подвергая вылупившихся животных РНК-интерференции, этот экран позволяет идентифицировать генные продукты, которые играют жизненно важную роль эмбриональные, которые могли бы скрыть постэмбрионального роль в регуляции белков, представляющих интерес. Наконец, этот экран используется сложный микроскоп оборудован для одной резолюции клетки.
Protocol
1. Строительство Скрининг деформации
Тщательной разработки скрининга штамм имеет решающее значение для успеха на экране и была описана в другом месте 3. Для некоторых исследователей, используя штамм, который выражает видимый продукт от трансгенов необходимо для эксперимента. Многие штаммы укрывательство интегрированной трансгены можно получить CGC или отдельных исследователей. Если трансгенного штамма, необходимых для экрана, но не доступен, то он может быть создан с помощью метода опубликована как бомбардировка 4 UV / TMP 5 или Mos транспозона вставка 6. Для того, чтобы визуализировать наши белок, мы вставили GFP-кодирующей последовательности в рамке со зрелой кДНК (мы использовали двойной-1 последовательности). Поскольку этот белок GFP слияния не видно анализируя возможности, мы использовали инжекции маркер, который был виден и не влияет на просмотр наших белок (TTX-3p :: RFP 7). Затем мы создали интегрированные трансгена от внехромосомными массива. Мы обнаружили, что бомбардировка трансгена дали низким числом копий интегрированной линии, ни спасены рассечения микроскоп фенотип не производится видимым уровнем GFP-меченый продукт (Beifuss и Gumienny, не опубликовано). UV / TMP интеграции нескольких копию внехромосомными массив первоначально сделаны инъекции 8,9 дали видимый, спасая уровня продукт трансгена (рис. 3А). Вестерн-блот с анти-GFP антител подтвердил, что трансгена (аллель имя texIs100) выражается и обрабатываются правильно (Beifuss и Gumienny, не опубликовано). Комплексная трансгенов должны outcrossed пять раз, чтобы удалить посторонние мутации фон независимо от источника.
Для нашего экрана, мы хотели только белок быть трансгенными, помеченные форме. Таким образом, мы удалили функциональные эндогенные ген путем введения потерей функции двойной мутант-1 аллеля.
Наконец, мы чувствительным штаммом к действию РНК-интерференции. RNAi из библиотеки будет для многих генов, производят более серьезное снижение в геном продукт, если животных содержат мутации, которые сенсибилизирует животных к действию RNAi 10,11 ткани (ы) проценты должны учитываться при выборе подходящего RNAi информирование фоне 11. Мы использовали канонические аллель СБР-3 (pk1426), чтобы сделать наш скрининг напряжения. СБР-3 является РНК-направленной РНК-полимеразы (RDRP) гомологов, которые обычно подавляет соматические RNAi 10. Мутации в других генах RNAi hypersensitizing как эри-1 или эри-1 линейно-15b может быть использована вместо того, чтобы повысить эффективность РНК-интерференции 11-13.
Скрининг штамма мы сделали имеет генотип СБР-3 (pk1426); texIs100; DBL-1 (NK3).
2. Выбор и подготовкаRNAi библиотеки
Коммерчески доступные C. Элеганс кДНК библиотеки составляют около 55% или 87% от предсказанных генов C. Элеганс индивидуально (Vidal лаборатории или лаборатории Ahringer библиотеки, соответственно). Индивидуальные клоны доступны для покупки (Open Biosystems, Geneservice, Ltd.) Мы выбрали ORF-RNAi библиотека построена лаборатория Видал (Open Biosystems), потому что ее клоны в основном полнометражный кДНК клонировали шлюз и готова для последующих применений (Invitrogen Corporation, Карлсбад, Калифорния). Оригинальный Ahringer лаборатории геномной библиотеки кДНК содержит кДНК фрагментов, которые не так широко, полезно для последующих экспериментов характеристика 14,15. Обе библиотеки использовать вектор, который содержит два T7 промоутеров фланговые вставки (рис. 1). Конструкции выращивают в бактериального штамма HT115, который выражает T7 полимеразы по индукции изопропил-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). Бактерии содержащие библиотеки клонов индуцированных ИПТГ кпроизводить дсРНК (см. шаг 3.4).
Скопируйте всю библиотеку на получение и использование дубликатов для всех экспериментов. Оригинал и дубликат библиотеки должны храниться в разных -80 ° C морозильники, которые подключены к отделить линий электропередач.
3. Подготовка бактерий библиотеки клонов
- (В течение двух месяцев эксперимента) подряд бактерии из выбранных кормления библиотеки клонов, а также положительный и отрицательный контроль, помечены на LB-карбенициллин / тетрациклин пластин (мы растем 8 культур на 100 мм пластины) и инкубировать при температуре 37 ° C в течение ночи ( > 16 часов) (рис. 1). Для каждого 24-луночного планшета, мы используем два элемента управления. Положительный контроль, бли-4 (K04F10.4), производит дозозависимое постэмбрионального pheontype 16,17. Отрицательный контроль, C06C3.5, это предсказал псевдоген ( WormBase.org ), который вызывает не наблюдается фенотип (Beifuss и Gumienny, не опубликовано). (В течение двух месяцев эксперимента, желательно раньше) подготовить 24-а нематода Рост средний (НГО), чашки, содержащие 25 - 50 мкг / мл карбенициллин и 1mM IPTG. Хранить при температуре 4 ° C.
- (День 1) Для каждого клона, привить 2 мл LB среды, содержащей 50 мкг / мл карбенициллин с одной колонии с прожилками плита (ы) (в шаге 3.1) с использованием стандартных стерильных. Инкубировать при температуре 37 ° С в течение ночи (> 16 часов) в шейкере до 220 - 240 оборотов в минуту (рис. 1). Решение должно быть облачно, после 16 часов.
- (День 2) На следующее утро, вызывают двухцепочечной РНК (дсРНК) производства путем добавления ИПТГ к культурам до конечной концентрации 1 мм. Инкубируйте культур при 37 ° С, 220 - 240 оборотов в минуту, за дополнительные 4 - 5 часов. Этот шаг обеспечивает более согласованный и надежный RNAi вызванных нокдаун гена продукт, а не полагаться исключительно на IPTG в агар из NGM пластины (в шаге 3.5).
- Пятно 30 мкл каждого индуцированного бактериальными у.е.lture в отдельных скважинах из 24-и РНК-интерференции NGM пластины, содержащей 25 - 50 мкг / мл карбенициллин и 1mM IPTG (рис. 1, см. рис 4 шаблон, используемый для отслеживания RNAi эксперименты). Положите пластины, раскрытый, в стерильных капот поток в течение 20 минут или пока бактериальных пятна сухие. Не пересушивать. Пересушивания вызывает края агар оторваться от плиты и животные будут безвозвратно, если они лезут в результате трещины.
4. Подготовка нематоды
Начните с поэтапным населения нематод. Постановка животных уменьшает вероятность того, что различия, наблюдаемые между контрольной и экспериментальных исследований RNAi просто из-за различий в стадии развития животных (однако, если RNAi вызывает задержку развития, то это должно быть отмечено заслон (рис. 2)) . Кроме того, начиная эксперимент RNAi с личинками L1 устраняет потенциальные вмешивающиеся эффект эмбриональной летальности на РНК-интерференции в поколениех годов, которые также могут играть роль постэмбрионального интерес.
Постановка осуществляется по первому отбеливания смешанной стадии населения скрининг напряжение, которое только яичной скорлупы защищенных эмбрионы выживают. Это этапы животных в течение 12 часов при 20 ° C или 18 часов при 16 ° C 18. Для более плотно стадии животных, арест животных в первой личиночной стадии (L1), позволяя эмбрионов люк в среде M9 без пищи. Голодные животные L1 сделан на продовольствие рост резюме из той же начальной возрасте до 19 лет.
- (День 1) Используйте три 100 мм пластин кормили, чистый отбор штамм животных, которые содержатся беременные взрослых и эмбрионов. Мыть животных из пластины, используя стерильные M9 по пипетировать жидкость по всей поверхности пластины слегка ослабить животных и эмбрионов. Передача стирки в стерильный 15 мл трубка с винтовой крышкой.
- Если мыть больше 3,5 мл, замедления вращения животных (~ 3000 оборотов в минуту в течение 30 секунд) и удалить жидкость до 3,5 мл. Если промывка лESS чем в 3,5 мл, добавляют H 2 0 или M9 к трубке составит 3,5 мл.
- Носите соответствующую защитную одежду (халат, перчатки и очки) при работе с химическими веществами. Смешать 0,5 мл 5 N NaOH 1 мл свежей хлорной извести (5% раствор гипохлорита натрия, менее 1 года). Добавить эту смесь 3,5 мл мытья нематоды. Начало таймер подсчитать. Этот процесс не должен длиться более 10 минут. Если это так, то эмбрионы будут поставлены под угрозу, и выход может быть уменьшен или отбеливатель стар и должен быть заменен.
- Вихревые трубы в течение 10 секунд. Повторите встряхивая каждые две минуты за 4 до 10 минут. После каждого встряхивая, соблюдать решение по вскрытии возможности для туш животных.
- Когда эмбрионы выпускаются и взрослые носят фрагментарный характер (6 - 8 минут), гранулы эмбрионов Вращая трубу в центрифуге столешницы (~ 3000 оборотов в минуту, 30 секунд).
- Аспирируйте столько супернатант насколько это возможно без нарушения гранул. Будьте осторожны, нежадный.
- Добавить стерильной M9 до ~ 10 мл. Кратко Vortex или взболтать для ресуспендирования гранул.
- Спиновые и удалить супернатант снова. Если запах хлорной извести могут быть обнаружены в трубе, повторить полоскание по мере необходимости.
- Ресуспендируйте эмбрионов в 10 - 15 мл стерильной M9 и передачи в небольшом (25 мл) колбу Эрленмейера (для вентиляции). Встряска на должном температуры деформации и эксперимент (15 - 25 ° C) в течение ночи (> 16 часов при 20 ° C). В это время животные все люк и арест в L1 диапаузы.
- (День 2) спином вниз L1 этап животных в 15 мл трубку и ресуспендируют в 0,5 - 1 мл M9 (~ 3000 оборотов в минуту, 30 сек.). Поместите 5 мкл раствора на отдельные пластины и подсчитать количество животных. Внесите изменения в объеме, при необходимости, производить 30 червей / 3 - 10 мкл раствора.
- Найди около 30 гипохлорита синхронизированы L1 этап животных на бактерии в каждую лунку подготовленные 24-луночного планшета. Слишком много моментовповторно чем 30 животных в хорошо может привести к населению голодающих до достижения зрелости. Пусть пластина с сухим косо крышками. Замените крышку и закрепите ее с помощью резиновой ленты. Переверните пластины и поместить его в соответствующую температуру на время, необходимое, чтобы выиграть на нужной стадии. Потому что СБР-3 (pk1426) представляет собой чувствительный к температуре аллель, наши животные отбора штамма выросла на 15 - 17 ° C в течение трех-четырех дней, чтобы наблюдать L4 для взрослых животных этапа (рис. 1).
5. Наблюдение нематоды
(День 5) После того, нематоды выросли до желаемой стадии (рис. 2A), убедитесь, что положительный и отрицательный контроль ожидаемых фенотипов с помощью рассечения микроскопом. Мы используем бли-4 в качестве контроля за эффективностью РНК-интерференции, поскольку он производит дозозависимое постэмбрионального дефекты, которые варьируются от волдырями взрослых (мягкий фенотип РНК-интерференции, не показано) для умственно арестован, крошечные личинки (сильный, электроннаяxpected RNAi фенотип) (рис. 2В). Тогда наблюдать за животными в каждой экспериментальной и использование вскрытия микроскоп и отмечают очевидный патологический фенотип индуцированных РНК-интерференции (рис. 2). После контроля подтверждают и валовой фенотипов отметил, экран RNAi эксперименты фенотипы интерес. Мы используем сложный микроскоп оснащен флуоресценции и 63x целью наблюдать не менее пяти животных из каждого эксперимента RNAi, начиная с управления (рис. 3).
- Подготовка слайдов (стандартный 75 х 25 мм), сделав 4% агар панели (4% агара в H 2 O). Для обеспечения равномерной толщины агарной средой, место чистое предметное стекло между двумя прокладками (каждая прокладка из предметное стекло микроскопа с двумя слоями лаборатории ленты на нем). Внесите 100 мкл (две-три капли из пипетки Пастера стекло) расплавленного 4% агар на центр чистой предметное стекло. Форма агарной средой путем покрытия расплавленный агар использованием дополнительных слайдов размещены быстро, но осторожно, в верхней части прокладкий расплавленного агара. Вынести агар площадку, осторожно передвигая стекол друг от друга, оставляя площадку придерживаясь одного слайда.
- Поместите ~ 5 мкл капли анестетика (левамизол или азид натрия, например) на агар площадку. Горы 8 - 12 животных в анестезии. Залить 22 х 22 мм, № 1.5 покровное (или толщина покровного лучше всего подходит для соединения микроскопа) и наблюдать животных с использованием сложного микроскопа.
- Запись генов, количество животных наблюдается, и фенотип результаты для каждого эксперимента RNAi. Для экрана, создавать и использовать стандартный шаблон (см., например, рисунок 5).
- Убедитесь, что RNAi производства фенотип другой, вторичный фенотип, если возможно, и повторить эксперимент. (Например, на примере экран, показанный использовал изменение GFP с метками DBL-1 локализации в качестве основного экрана и размер тела, как дополнительный экран 20). Бактерии могут быть использованы с той же полосе (хранить при температуре 4 ° С) до два месяца. Пожилые полосы может тesult в плохом росте в жидкой ночь культуры и должны быть restreaked в первую очередь.
- Последовательность по крайней мере, один конец вставки кДНК, чтобы подтвердить, что вставка соответствует библиотеке метки (Ahringer библиотека была надежность проведенного анализа, см. http://biocompute.bmi.ac.cn/CelRNAi/ ) 21. Рекомендуемые грунтовки (для вставок из любой библиотеки) отжига на сайтах L4440 производных вектор и крыло вставки сайте: 5'-AGCGAGTCAGTGAGCGAG-3 'и 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3' (M13f20 грунтовка).
Используя этот метод, один человек вполне может устроить и соблюдать 3:58 серии экспериментов каждую неделю. Например, животные, поставленный на понедельник и вторник можно наблюдать в четверг и пятницу, соответственно, и может быть вновь поставлен на пятницу и субботу в понедельник и вторник наблюдения. В зависимости от фенотипа (ы) показан каждый день, набор может состоять из одного 24-луночного планшета на соединение микро-скопии или больше, если фенотип быстро идентифицированы. Таким образом, по крайней мере 88 различных экспериментов РНК-интерференции можно наблюдать в течение недели, с учетом положительного и отрицательного контроля и скорости проверки. Рассечения область экрана может быть выполнено намного быстрее, без необходимости установки животных на слайды для просмотра. Несколько человек также может увеличить пропускную способность лаборатории ошеломляющим графики и / или с использованием нескольких микроскопов. Альтернативный метод для выращивания животных на тонкую пленку агар и передачи кусочек агара, содержащего животных прямо на слайде для просмотра может сэкономить время. Этот вариант был успешно использован для скрининга мужчин аномалии хвоста на увеличение 400x 22.
6. Представитель Результаты
Примеры нормальных и измененных локализации GFP с метками DBL-1 показаны на рисунке 3. Нормальное выражение GFP с метками DBL-1 включает в себя вентральный нервный шнур клетки органов и ряда punctae (рис. 3А). DBL-1 яс сильно ослабленной, когда животные питаются РНК, которая предотвращает DBL-1 мРНК перевода (рис. 3В). DBL-1 (RNAi) также производит мелких животных, дополнительный экран в данном примере (данные не представлены). Гены, которые влияют на DBL-1 локализации легко определить по RNAi использованием напряжения предназначены для этого экрана (рис. 3).
Рисунок 1. Экран схема для определения внеклеточных регуляторов DBL-1 сигнализации. Бактерии от кормления библиотеки выращивали в течение ночи, индуцированных с ИПТГ, и инкубировали при 37 ° С в течение дополнительных 4 часов, чтобы позволить бактерий для получения двухцепочечной РНК (дсРНК). 30 мкл индуцированного бактериальной культуры заметил одну скважину на 24-и НГО (средний рост нематоды) пластины, содержащей 25 мкг / мл карбенициллин и 1mM IPTG и дать высохнуть в стерильной капот потока. Мы этапе первой личиночной стадии (L1) личинок, позволяя гипохлорита обработанных EMBRйо люк в средствах массовой информации без пищи, которая вызывает L1 диапаузы (арестован развития). Около 30 животных синхронизирован L1 этапе высевают на каждой лунке содержащие бактерии из библиотеки РНК-интерференции, который позволяет поставил животных возобновить рост и потреблять дсРНК созданные бактерии 23. Через 72 часа при 15 ° С, молодые взрослые черви, проверяются на видимый фенотип. В этом возрасте дефекты размером тела очевидны и флуоресценции яркий из texIs100 экспрессии трансгена.
Рисунок 2. Примеры фенотипов определить до скрининга. Все изображения животных в тарелку и были приняты в то же увеличение помощи рассечения микроскопом. Животные были отображаемого около 72 часов после того, как покрытие, как голодных личинок L1. Все изображения обрабатывались одинаково. А) RNAi гена, который не дает валового морфологические дефекты. Животные появляются дикого типа. B) RNА в бли-4. Животные отображения арестован развития, и крошечные по сравнению с животными группы А. С) РНК-интерференции в DPY-13. Животные находятся на той же стадии развития, как животные в панель, но надпись "унылый" тело морфологии.
Рисунок 3. Примеры флуоресцентно помеченный белка и РНК-интерференции как специфических генов изменяет локализации в клетке. Все снимки были сделаны при увеличении 630x с вращением диска конфокальной микроскопии, 5 сек. экспозиции. Шкала бар = 10 мкм. Все изображения обрабатывались одинаково. Открытые стрелки указывают на клеточных тел. Стрелками отмечены линии punctae. Заполненные стрелки указывают некоторые аберрантно локализованных GFP с метками DBL-1. А) RNAi кормили псевдоген C06C3.5 («дикий тип»). B) DBL-1 (RNAi) управления. C) РНК-интерференции генов, необходимых для нормальной локализации GFP с метками DBL-1.
Рисунок 4. Шаблон например для отслеживания RNAi эксперименты (библиотека клонов) в 24-луночных планшетах. Этот шаблон может быть использован для создания постоянной записи экспериментов, в отличие от непосредственно маркировки пластин.
Рисунок 5. Шаблон например для записи фенотипов RNAi. Развернуть по мере необходимости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод РНК-интерференции скрининга представленные здесь позволяет чувствительный и быстрый анализ генных продуктов, необходимых для нормальной (или трансгенных) постэмбрионального фенотипа. Пример приведен экран для генов, вовлеченных в субклеточные локализации флуоресцентной меченый белок. Однако, этот протокол может быть изменена, чтобы идентифицировать гены, влияющие других постэмбрионального фенотипы интерес.
Этот метод использует подход генов кандидатов с помощью РНК-интерференции библиотеки. Вперед генетических экранов с помощью мутагенеза методы выявления случайно индуцированных аллелей роман, но те аллели, требуют значительного времени, усилий и / или средства для идентификации 24. С кДНК библиотеки, с другой стороны, секвенирование кДНК вставки, которые вызвали фенотип RNAi интерес быстро подтверждает генов-кандидатов. Кроме того, клонирование кДНК-вставки готовых содействовать ниже анализ выявленных кандидатов. Кроме того, гены, которые являются летальными, когда мутировалмогут быть выявлены и проанализированы с помощью РНК-интерференции. Размещая вылупившихся животных индуцированных бактерий, этот метод позволяет наблюдать постэмбрионального дефекты генов, которые также имеют жизненно эмбриональных роли.
Позаботьтесь, чтобы подтвердить, что наблюдаемые животные не голодали. Голод может повлиять на фенотип животного. Если роман RNAi фенотипов определены в голодные животные, повторить, чтобы подтвердить, что фенотип есть результат РНК-интерференции, а не голод. Чтобы избежать голода, использовать свежие бактерии, которые были выращены в стационарную фазу (рост средней очень "облачный"), и использовать только около 30 животных на лунку.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-р Рик Паджетт (Ваксман институт, Rutgers University, Нью-Джерси) за дар DBL-1 кДНК и д-р Кристофер ронго (Ваксман институт, Rutgers University, Нью-Джерси) для инъекций маркера. Лаборатории доктора Барта Гранта осуществляется бомбардировка генной пушки низкой интеграции номер копии GFP с метками DBL-1 конструкции. Рене Гарсиа лаборатория оказала техническую помощь в процессе создания texIs100. Рене Гарсиа, Робин Lints и Hongmin Цинь лабораторий, продуктивный совет. Эта работа финансировалась запуска средства TAMHSC Отдел молекулярной и клеточной медицины. Область соединения и вращается диск конфокальной было приобретено на средства, предоставленные отделом и TAMHSC Медицинского колледжа Деканат.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NGM Agar | Nematode growth medium | IPM Scientific, Inc | Can be prepared following NGM agar protocol25 |
| M9 Medium | 22mM KH2PO4, 42mM Na2HPO4, 86mM NaCl, 1 mM MgSO4 |
||
| Agar-Agar | EMD Millipore | 1.01614.1000 | 2% in water for NGM plates. 4% in water for microscope slide pads (autoclave initially and microwave to melt thereafter). |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | 0.25% |
| IPTG | Research Products International Corp. | I56000-5.0 | 1 mM final concentration |
| carbenicillin | Research Products International Corp. | C46000-5.0 | 50 μg/ml working dilution |
| LB Broth Lennox | BD Biosciences | 240230 | 20 g/liter |
| tetracycline | Sigma-Aldrich | 268054 | 12.5 μg/ml working dilution |
| sodium hypochlorite | Any Supplier | 5% household bleach | Use fresh bleach. |
| sodium hydroxide | Any Supplier | CAS 1310-73-2 | 5 N stock |
| M9 medium | Wormlab Recipe Book | http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab | 26 |
| levamisol | Sigma-Aldrich | 31742 | 100 μM - 1 mM working dilution |
| sodium azide | Fisher Scientific | S227 | 10 mM in M9 working dilution |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | VWR distributor |
| microscope slides | Any Supplier | 75 x 25 x 1 mm | |
| microscope cover slips | Any Supplier | 22 x 22 mm No.1.5 | Use the thickness recommended by the microscope manufacturer. |
| compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | A1m | Use objectives and filters to match the needs of the experiment. |
| media pump | Manostat Varistaltic pump | Kate model #72-620-000 | Use tubing and settings appropriate for the machine |
References
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).
- Boutros, M., Ahringer, J. The art and design of genetic screens: RNA interference. Nat. Rev. Genet. 9, 554-566 (2008).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
- Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. Trimethylpsoralen induces small deletion mutations in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 1381-1385 (1994).
- Frokjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 40, 1375-1383 (2008).
- Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cell. Mol. Life. Sci. , (2011).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).
- Mello, C., Fire, A.
- Simmer, F. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
- Zhuang, J. J., Hunter, C. P. Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans enhanced RNAi mutants. Genetics. , (2011).
- Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. Identification of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity using enhanced RNAi-sensitive strains. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 489-497 (2007).
- Wang, D. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
- Fraser, A. G. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
- Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Peters, K., McDowall, J., Rose, A. M. Mutations in the bli-4 (I) locus of Caenorhabditis elegans disrupt both adult cuticle and early larval development. Genetics. , 129-195 (1991).
- Thacker, C., Peters, K., Srayko, M., Rose, A. M. The bli-4 locus of Caenorhabditis elegans encodes structurally distinct kex2/subtilisin-like endoproteases essential for early development and adult morphology. Genes & Development. 9, 956-971 (1995).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Dev. Biol. 51, 23-33 (1976).
- Stiernagle, T.
- Savage-Dunn, C. Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components. Genesis. 35, 239-247 (2003).
- Qu, W. Reliability analysis of the Ahringer Caenorhabditis elegans RNAi feeding library: a guide for genome-wide screens. BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).
- Nelson, M. D. A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, e1002010 (2011).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Sarin, S., Prabhu, S., O'Meara, M. M., Pe'er, I., Hobert, O. Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing. Nature Methods. 5, 865-867 (2008).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T.
- Brenner, S.
