Summary
MazeSuite собой полный набор инструментов для подготовки, представления и анализа навигационных и пространственных экспериментов. Функциональные ближней инфракрасной спектроскопии (fNIR) является оптический метод визуализации мозга, которая позволяет неинвазивным и портативных мониторинг мозговой изменений оксигенации крови. В настоящем документе кратко коллективного пользования MazeSuite и fNIR в познавательной парадигмы обучения обработке.
Protocol
Maze-Suite состоит из трех основных приложений, программы для редактирования построить лабиринт среды (MazeMaker), визуализация / модуль рендеринга (MazeWalker), и, наконец, анализ и пути инструмента визуализации (MazeAnalyzer). В следующих разделах описывается использование MazeSuite и более подробная информация доступна в трех дополнительных видео, по одному на каждый модуль MazeSuite.
1. Проектирование лабиринты
MazeMaker применение в лабиринт-Suite, позволяющий создавать трехмерные (3D) среде просто привлекая их на двумерной (2D) холст с высоты птичьего птиц. Стены и пол можно сделать, щелчки мыши, чтобы указать координаты, и пользователи могут импортировать файлы 3D объектов или изменения свойств элементов в лабиринте, такие как позиция, ориентация, цвет, текстуру и освещение.
Maze начала и окончания регионах могут быть назначены в дополнение к другим критерии выхода, такие как тайм-аут. РазделениеСообщения те текст может отображаться сообщить участнику для каждого выхода состояния. На этапе проектирования, лабиринты могут быть проверены с помощью функции «быстренько» в рамках MazeMaker.
Для функциональных исследований изображений, участники, как правило, просят выполнить ряд задач с повторными испытаниями. Для облегчения этого испытания повторяют испытания, MazeMaker может создать лабиринт список файлов, которые отсортированы списки лабиринты и текстовые сообщения для экспериментальной сессии. Очень важно, что файл лабиринт список для эксперимента подготовлены и тщательно экспериментальную проверку до дня эксперимента.
Беглый учебник для использования и развития среды с MazeMaker представлена в «Дополнительные видео-II - MazeMaker.
2. Установка fNIR и размещение fNIR датчик-Pad
Подготовка fNIR Box
- Есть два кабельных разъемов за fNIR окно. Один из слотовы предназначен для подключения USB и другие соединения для кабеля питания.
- Подключить коробку fNIR устройству через кабель USB к ПК или ноутбука, который будет использоваться для сбора данных.
- Подключите адаптер питания к устройству и включите устройство.
- Плоский кабель используется для подключения датчика площадку с fNIR окно.
- Датчик площадке дома источника света (светодиоды) и фотоприемники.
- Светодиоды излучают инфракрасный свет на 730nm и 850nm длины волн, которые поглощаются в основном венозная и кислород-гемоглобин, соответственно, и таким образом, могут проникать через биологические ткани.
Размещение датчика-Pad
- Попросите участников поднять свои волосы от лба до датчика размещения. Поместите датчик полосу чуть выше брови. Матч центр датчик с вертикальной осью симметрии, которая проходит также через нос
- Нажмите кнопку датчикапанель вплотную к лбу и использование клипа провести кабели на задней части головы. Хотя это и не является строго обязательным, глава пленку или теннис бандана рекомендуется обеспечить датчик площадку.
- После размещения датчиков накладка на лоб, приложите к двум концам ленты кабель к fNIR окно. Ленточные кабели должны быть присоединены путем сопоставления «Я» и по бокам "II" плоского кабеля с соответствующим "я" и "II" разъемы на устройстве.
Запуск программного обеспечения COBI студия для сбора данных
- Нажмите на когнитивной оптических изображений мозга (COBI), Studio13 значок на рабочем столе, чтобы открыть главное окно.
- Программа будет идти с определенными заранее заданными настройками для сбора данных и визуализации.
- Важно, чтобы проверить и подтвердить параметры сбора данных и запуска (маркер синхронизации) в диалоговом настройки устройства в случае необходимости.
- COBI студия может автоматически назвать все файлы, связанные с данными, если "Experiment режиме "с помощью" Новый эксперимент "мастера.
- В папке данным, 3 типов файлов будут созданы: (* НДК.) Для fNIR данных (* МРК). Для маркеров данных и (* txt.) Для журнала эксперимента сессии.
3. Запуск эксперимента: Оказание лабиринты
Устройство Установка и запуск приобретение fNIR данных
- Светодиодные Drive данной определяет, насколько ярко каждый светодиод светит. Значение по умолчанию для светодиодных тока 20 мА. Это значение может иметь меняться в зависимости от пигментации кожи и другие характеристики участника. Предлагаемый ассортимент для светодиодного тока между 5мА до 20 мА
- Значение по умолчанию для начального роста для всех каналов составляет 20. Предлагаемые значения усиления являются 1,5,10,15,20.
- Нажмите на ссылку "Начать текущего устройства, и изучить качество сигнала. Если исходные значения интенсивности показано на подходе COBI 4000 или ниже 1000, нажмите кнопку "Стоп устройств", а также настроить индикатор Drive тока и устройствоПрибыль до подходящего значения получаются. В странах с низким обстоятельств сигнала, увеличить светодиодной Drive данной прежде чем увеличивать устройства усиления. В условиях насыщенного сигнала уменьшить устройство до снижения коэффициента усиления тока светодиода Drive. Как только качество сигнала является приемлемым, перейдите к шагу 4.
- Начало Baseline. Это будет собирать 10 секунд данные и использовать их в качестве базовых в измененном Beer-Lambert уравнения установить для расчета изменения концентрации для окси-и дезокси-гемоглобина 8.
- Пусть базовой полной (это может занять 10-20 секунд)
- Нажмите кнопку "Начать запись". Это позволит начать экономить все данные. Эксперимент протокол должен начинаться после этого.
- Экспериментатор может выбрать для добавления маркеров руководство на протяжении всего эксперимента сессии для обозначения определенных событий с помощью кнопок «Добавить маркер руководства", используя меню ручной маркер находится в левом нижнем углу экрана.
- Начало Maze Люкс представить визуальные раздражители.
Усинг MazeWalker оказать лабиринты
- Выполнить MazeWalker из меню Пуск> Maze Suite> MazeWalker
- Включите маркер синхронизации, выбрав пункт "Включить Serial Port" из в меню в разделе Advanced> Serial параметры порта. Убедитесь, что правильный адрес порта COM выбран.
- Выберите файл лабиринт списка (который был создан MazeMaker), а также выбрать имя для нового файла журнала для этой сессии. Имя или номер участника может быть записано в поле ходок. Дополнительно AutoLog могут быть использованы для автоматической записи на отметку времени файл журнала, а не вручную указать файл журнала.
- Нажмите кнопку "Пуск", чтобы начать процесс. В зависимости от настроек видео, протокол может работать в полноэкранном режиме или в оконном режиме.
4. Визуализация путь субъекта
Использование MazeAnalyzer, исследователь может визуализировать лабиринт и путь участника из лабиринта и лог-файлов. Кроме того, итоговый отчет, включаяОбщая длина пути и время завершения каждого лабиринта производятся как беглый поведенческие меры. Лог-файлы содержат информацию в миллисекундах время решение о пути, по которому субъект поездки, а также вид объекта векторной и взаимодействия с объектами.
Видео-учебник представлен в "Дополнительной видео I - MazeAnalyzer и описывает использование основных функций MazeAnalyzer наряду с методами для получения поведенческих метрик описано в разделе результатов.
5. Обработка fNIR и анализ данных
Удаление шума является первым шагом для обработки данных. Источники шума включают: 1) руководитель Движения 2) физиологические сигналы, такие как частота сердечных сокращений и дыхания и 3) Инструмент и охраны окружающей среды шумом.
Руководитель движения может привести к fNIR детекторы перенести и теряют контакт с кожей, подвергая их: 1) свет окружающих, 2) свет, излучаемый непосредственно птОМ fNIR источников, или 3) света, отраженного от кожи, а не отраженное от тканей в коре головного мозга. Этот тип движения артефакт легко узнаваем, потому что он вызывает внезапную, большими шипами в fNIR данных. Более тонкие артефакт движения головы связано с эффектами гравитации на мозговой крови. Быстрое перемещение головы может вызвать кровь двигаться к (или от) области, которая находится под контролем, быстро растет (или убывает) объема крови с сопутствующим искажению данных. Так как динамика этого типа движения артефакт медленнее, чем светодиод "поп", они могут быть спутаны с фактическим гемодинамики за счет активации мозга. Таким образом, удаление артефактов движения от fNIR данных является важным и необходимым шагом, если fNIR должны быть развернуты как технологии мониторинга мозга в естественных условиях 16.
Физиологические сигналы, такие как частота сердечных сокращений (более 0,5 Гц) и дыхания (более 0,2 Гц) при более высоких диапазонах частот, чем чemodynamic ответов, таким образом, они могут быть устранены с использованием линейной фазы низкочастотной КИХ-фильтр с частотой среза в пределах от 0,1 до 0,15 Гц 9.
Инструмент и шума окружающей среды может происходить за счет окружающего освещения, таких как дневной свет (DC) и светлой комнате (60 Гц) или свет от монитора компьютера (60-75Гц). Предполагается, что лучший способ избавиться от этого типа шума заключается в подготовке экспериментальной среды и сбора данных соответственно. Аналоговый фильтр нижних частот (фильтра сглаживания) была реализована в fNIR окна для устранения складывания высокочастотных помех на частоте дискретизации диапазоне.
Есть много дополнительных шумов алгоритмы, которые используют различные характеристики сигнала 17-20. Однако, если предмет или сессии могут быть исключены, если данные безвозвратно (т.е. насыщенный).
Рисунок 1.
FNIR сырья сигналы измерения интенсивности света (см. рисунок 1). Путем измерения оптической плотности (ОП) изменений на двух длинах волн, относительное изменение окси-гемоглобина и дезокси-Hb в зависимости от времени может быть получено с помощью модифицированного Beer-Lambert Закон 21-23. ОП при определенной длине волны вход (λ) является логарифмической отношение входной интенсивности света (I в) и выходной (обнаружен) интенсивности света (I выход). OD также связано с концентрацией (с) и коэффициента экстинкции (е) хромофоров, исправлены расстояние (D) между источником света и детектором, а также постоянный коэффициент затухания (G). 
Имея же я в двух различных случаях время и интенсивность света обнаружены во время исследования (я отдыхаю) и во время выполнения задания (I тест), разница в ОП для wavelenGTH λ является 
Измерение ОП при двух различных длинах волн дает 
Это уравнение набор может быть решена, если концентрация 2x2 матрица невырожденная. Как правило, двух длинах волн выбирают я) в рамках 700-900нм, где поглощение окси-гемоглобина и дезокси-Hb являются доминирующими по сравнению с другими хромофоров ткани, и б) выше и ниже изобестической точки (~ 805nm, где спектров поглощения дезокси - и окси-Hb пересекаются друг с другом), чтобы сфокусироваться изменения в поглощении либо дезокси-Hb или окси-Hb, соответственно. FNIR инструмент, используемый в данном исследовании используются 730nm и 850nm длины волны.
Наконец, с помощью маркеров (сигналы синхронизации времени), периоды базового / отдыха и задачи помечены и выбора функций с кислородом данные извлекаются такие, как есть, мин имаксимальные значения. COBI Студия экономит сырье интенсивность света измерений и рассчитанных значений оксигенации (с использованием модифицированных пива закону Ламберта) в текстовых файлов, а также синхронизация времени (маркер) файлы. COBI Студия также может быть использован для удаления шумов применяются такие методы, как конечной импульсной характеристики нижних частот или полосовой фильтр. Выходные файлы могут быть экспортированы в общий анализ программного обеспечения, таких как (Matlab, Excel, SPSS и SPM) или специального программного обеспечения для анализа, таких как fnirSoft 24 для дальнейшей обработки.
6. Представитель Результаты:
Примеры fNIR сигнала
Цифры 2-5 заданной fNIR сырья сигналы из одного места измерения с двумя компонентами волны (730nm и 850nm) показаны отдельно. Рисунок 2 представляет собой действительное и приемлемый сигнал эпоха в то время как рис 3 и 4 являются неприемлемыми и должны быть отброшены. На рисунке 5 представлены сырья сигнал, который был загрязнен артефакт движения и должен быть очищен или дискarded.
Рисунок 2. Хорошие fNIR исходного образца сигнала
Рисунок 3. Плохо fNIR исходного образца сигнала, где 850 каналов насыщен.
Рисунок 4. Плохо fNIR исходного образца сигнала, где есть проблема аппаратного или выпуск кабелей связи.
Рисунок 5. Плохо fNIR исходного образца сигнала, где есть артефактов движения.
Протокол исследования
Оценки обучения лучшим примером сохранения (например, памяти) и передачи (т.е. обобщения) тесты. В нашем исследовании, три лабиринты (maze1, maze2 и maze3) былипрактикуется при приобретении фазы в общей сложности 105 испытаний каждого по три дня. Эти два условия; случайном порядке практики (РНД) и их практика порядке (BLK) приведены на рисунке 6. Два предмета добровольцем на четыре исследовании день. На 4-й день, 10 испытаний были проведены удержания для каждого лабиринта и лабиринты были представлены в случайном порядке. Два романа лабиринты (maze4 и Maze5), которые были созданы имели дополнительные коридоры и различные точки начального и конечного, чем лабиринты изначально практикуется. Субъекты десять успешных испытаний для каждого из двух новых лабиринтов. Эти лабиринты представляют собой передачу фазу, и были представлены в случайном порядке для всех. Лабиринты передачи фазы были использованы для определения степени, в которой каждый субъект смог обобщить свои знания и практику с приобретением лабиринты.
Рисунок 6. Представитель план протокол эксперимента.
Изучение поведенческих результатов
На следующих рисунках с 7 по 9, показывать средние значения признака (длина пути, общее время завершения, и скорость) субъектов на каждый день. Во-первых, результаты maze1, maze2 и maze3 перечислены как RND BLK и практики. Далее, maze4 и Maze5 результаты приведены для сравнения случайных сравнении с их результатами практики. Все ошибки баров стандартная ошибка среднего (SEM).
Рисунок 7. RND практике поведенческие резюме производительности для приобретения и удержания задачи, в том числе общая длина пути, общее время завершения и средней скорости.
Рисунок 8. BLK поведенческие практики резюме производительности для приобретения и удержания задачи, в том числе общая длина пути, общее время завершенияи средняя скорость.
Рисунок 9. Поведенческие сравнения производительности по сравнению с RND BLK практика передачи, включая общую длину пути, общее время завершения и средней скорости.
Результаты исследования fNIR
Оксигемоглобина изменения концентрации по сравнению с исходными были усреднены по времени хода каждого лабиринта с помощью маркерных данных, полученных от MazeWalker (указывает на начало и конец каждого лабиринта). Увеличенная изменения величины концентрации взяты представляют более высокие уровни региональной активации мозга. Более высокий уровень активации наблюдалось в течение как сохранение и передачу задач для практики BLK по сравнению с RND практике. Во время передачи задач, более высокий уровень активации был замечен в практике BLK по сравнению с RND практике (см. рисунок 10).
Для субъекта практики BLK, передачаиспытания требуются более высокой активации по сравнению с сохранением испытаний. Для RND практике субъект, уровень активации не отличаются для передачи и хранения задач, в отличие от темы практике BLK (см. рисунок 11).
Рисунок 10. Сравнение средних окси-Hb изменения концентрации для BLK против RND практики для удержания задач (слева) и передача задач (справа).
Рисунок 11. Сравнение средних окси-Hb изменения концентрации для удержания против передачи задач для обеих BLK (слева) и RND (справа) практики.
Discussion
Префронтальной коры (PFC) в мозге человека способствует когнитивный контроль над координации мысли и действия по отношению к внутренним целям. В частности, передняя / дорсолатеральной PFC, как известно, посредником высших когнитивных функций, таких как задачи управления, планирования и пространственной навигации 25. fNIR представляет собой портативный, безопасный и неинвазивный инструмент мозга мониторинга, который был использован в клинических, лабораторных и естественных условиях изучать активации мозга. Это предварительное исследование продемонстрировало использование люкс Maze и fNIR для изучения нейроповеденческого аспекты пространственной навигации. В этой исследовательской работы платформы MazeSuite используется в сочетании с fNIR для изучения нейроповеденческого аспекты пространственной навигации в дорсолатеральной PFC и продемонстрировать сочетание этих двух инструментов.
MazeSuite является экспериментальным дизайном, представления и анализа платформы. Это дает возможность создания и применения простой 3D-средав экспериментах с удобным графическим интерфейсом и автоматически записывает поведенческие меры для внутри субъекта или через предмет сравнения. Во время презентации среды MazeSuite, одновременно синхронизированы по времени fNIR Измерения проводились с использованием коммерчески доступного, портативные, системы непрерывной fNIR волны (Imager 1000, fNIR устройств, LLC) и COBI студии программы 15. fNIR ранее был создан как безопасный и эффективный неинвазивный инструмент мониторинга мозга в клинических, лабораторных и естественных условиях для изучения мозговой активности 7,11 и используется в данном исследовании исследовать когнитивные реакции, связанные с контекстной помех во время пространственных задач навигации.
Для изучения влияния практики Заказать контекстную помех, испытуемые были представлены либо с низким уровнем помех (BLK) или высокий уровень помех (РНД) практики порядке. Эти различные графики практике были использованы для проверки эффекта обучения мультиPLE виртуальной пространственной навигации лабиринте задач по приобретению, сохранению и передаче испытаний. Поведенческие результаты показывают, что для практики заказы, есть монотонно убывающая тенденция в общее время, необходимое для завершения лабиринт, предполагая, что как показывает практика предметов, они завершили каждого лабиринта в более короткие периоды времени. Кроме того, средняя скорость, с которой субъекты навигации лабиринте (лабиринт скорости) увеличилась с практикой. Эти улучшения в поведенческих мер во времени, как ожидается, выводы обучения. Среднее окси-Hb изменения концентрации во время практики исследования показывают, что практика BLK требуется высшее активации мозга, по сравнению с RND практике порядке.
RND практике привело к ускорению времени завершения и короче длины пути по сравнению с того BLK практики для сохранения и передачи, соответственно. Тенденция к снижению наблюдается в среднем окси-Hb для BLK и RND практика по сохранению испытаний указывает уменьшить переменного токасверхпроводимости в ПФУ. Этот вывод, как ожидается, как и предыдущие исследования показали, что снижение активности PFC на поздних стадиях обучения 12,26.
Кроме того, навигация в новом лабиринты во время передачи фазы требуется высших мозговых активации теме практике BLK по сравнению с RND практика тему. Учитывая, что практика порядке была различной для задач уже научился (т. е. maze1, maze2, и maze3), это стратифицированную случайном порядке практики для субъекта, что узнал задачи в последовательном (BLK практики) того, возможно, был достаточно новым требовать дополнительных усилий и когнитивных ресурсов для выполнения задач 12,26. Однако, для RND практикой, передачи фазы активации нейронных была не выше, чем удержание фазы. Эти данные подтверждают результаты ПЭТ с пространственной навигации виртуального лабиринта сообщил Ван Хорна и его коллеги 12.
В Суммарной, мы описали использование MazeSuite в сочетании с COBI Студия исследования последствий контекстной помех, связанных с практикуют порядка при изучении пространственных навигационных задач. FNIR методы, описанные здесь, не ограничиваются пространственных задач навигации и может быть использован для самых разнообразных задач в других исследованиях нейровизуализации. Проектирование, внедрение, сбор и анализ данных фаз исследования были объяснены с намерением, чтобы обеспечить руководство для будущих исследований.
Disclosures
fNIR Devices, ООО производит оптический инструмент визуализации мозга и лицензированных IP и ноу-хау из Drexel University. Г. Аяз, М. Izzetoglu, К. и Б. Izzetoglu Onaral были вовлечены в разработку технологий и, таким образом предложил незначительную долю в новой фирме fNIR запуска устройства, LLC.
Acknowledgments
Финансирование этой работы была предоставлена частично штата Пенсильвания # 4100037709 # 240468 субподряда и Drexel University субподряда # 280773.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Maze Suite | |||
| fNIR Imager 1000 |
References
- Ayaz, H., Allen, S. L., Platek, S. M., Onaral, B. Maze Suite 1.0: a complete set of tools to prepare, present, and analyze navigational and spatial cognitive neuroscience experiments. Behav. Res Methods. 40, 353-359 (2008).
- Chance, B., Zhuang, Z., UnAh, C., Alter, C., Lipton, L. Cognition-activated low-frequency modulation of light absorption in human brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 3770-3774 (1993).
- Villringer, A., Planck, J., Hock, C., Schleinkofer, L., Dirnagl, U. Near infrared spectroscopy (NIRS): a new tool to study hemodynamic changes during activation of brain function in human adults. Neuroscience letters. 154, 101-104 (1993).
- Hoshi, Y. Non-synchronous behavior of neuronal activity, oxidative metabolism and blood supply during mental tasks in man. Neuroscience letters. 172, 129-133 (1994).
- Strangman, G., Boas, D. A., Sutton, J. P. Non-invasive neuroimaging using near-infrared light. Biological psychiatry. 52, 679-693 (2002).
- Coyle, S., Ward, T. E., Markham, C. M. Brain-computer interface using a simplified functional near-infrared spectroscopy system. Journal of neural engineering. 4, 219-226 (2007).
- Ayaz, H. Optical brain monitoring for operator training and mental workload assessment. Neuroimage. , (2011).
- Izzetoglu, M. Functional near-infrared neuroimaging. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 13, 153-159 (2005).
- Izzetoglu, M., Bunce, S. C., Izzetoglu, K., Onaral, B., Pourrezaei, K. Functional brain imaging using near-infrared technology. IEEE Eng Med Biol Mag. 26, 38-46 (2007).
- Shalinsky, M. H., Kovelman, I., Berens, M. S., Petitto, L. A. Exploring Cognitive Functions in Babies, Children & Adults with Near Infrared Spectroscopy. J. Vis. Exp. (29), e1268-e1268 (2009).
- Izzetoglu, K. The evolution of field deployable fNIR spectroscopy from bench to clinical settings. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 4, 1-12 (2011).
- Van Horn, J. D. Changing patterns of brain activation during maze learning. Brain Res. 793, 29-38 (1998).
- Shewokis, P. A. Memory consolidation and contextual interference effects with computer games. Perc Motor Skills. 97, 581-589 (2003).
- Magill, R. A., Hall, K. G. A review of the contextual interference effect in motor skill acquisition. Human Movement Science. 9, 241-289 (1990).
- Ayaz, H., Onaral, B. Analytical software and stimulus-presentation platform to utilize, visualize and analyze near-infrared spectroscopy measures Masters Degree thesis [dissertation]. , Drexel University. (2005).
- Ayaz, H. Advances in Understanding Human Performance: Neuroergonomics, Human Factors Design, and Special Populations. Marek, T., Karwowski, W., Rice, V. 3, CRC Press Taylor & Francis Group. 21-31 (2010).
- Izzetoglu, M., Chitrapu, P., Bunce, S., Onaral, B. Motion artifact cancellation in NIR spectroscopy using discrete Kalman filtering. Biomedical engineering online. 9, 16-16 (2010).
- Huppert, T. J., Diamond, S. G., Franceschini, M. A., Boas, D. A. HomER: a review of time-series analysis methods for near-infrared spectroscopy of the brain. Appl Opt. 48, 280-298 (2009).
- Zhang, Q., Strangman, G., Ganis, G. Adaptive filtering to reduce global interference in non-invasive NIRS measures of brain activation: How well and when does it work? Neuroimage. 45, 788-794 (2009).
- Izzetoglu, M., Devaraj, A., Bunce, S., Onaral, B. Motion artifact cancellation in NIR spectroscopy using Wiener filtering. IEEE Trans Biomed Eng. 52, 934-938 (2005).
- Cope, M. The development of a near infrared spectroscopy system and its application for non invasive monitoring of cerebral blood and tissue oxygenation in the newborn infant. , University College London. London. (1991).
- Elwell, C. Quantification of adult cerebral hemodynamics by near-infrared spectroscopy. Journal of Applied Physiology. 77, 2753-2753 (1994).
- Wyatt, J. Quantitation of cerebral blood volume in human infants by near-infrared spectroscopy. Journal of Applied Physiology. 68, 1086-1086 (1990).
- Ayaz, H. Functional Near Infrared Spectroscopy based Brain Computer Interface PhD thesis [dissertation]. , Drexel University. (2010).
- Wood, J. N., Grafman, J. Human prefrontal cortex: processing and representational perspectives. Nat Rev Neurosci. 4, 139-147 (2003).
- Shadmehr, R., Holcomb, H. H. Neural correlates of motor memory consolidation. Science. 277, 821-825 (1997).
