Summary
Чтобы проследить прогрессирование иммунного ответа с течением времени в той же мыши, лимфатические узлы могут быть последовательно удалены хирургическим путем. Здесь мы опишем, как эта техника может быть выполнена.
Abstract
В области иммунологии, чтобы понять, прогрессирование иммунного ответа на вакцину, инфекции или опухоли, ответ часто сопровождается с течением времени. Кроме того, исследование лимфоцитов гомеостаза требует экспериментов время курса. Выполнение этих работ в том же мышь идеально подходит для уменьшения экспериментальной изменчивости, а также количество мышей использовали. Забора крови позволяет проводить эксперименты время, конечно, но это только дает информацию о циркулирующих лимфоцитов и предоставляет ограниченное количество ячеек 1-4. Так как лимфоциты циркулируют по всему телу и проживающих в лимфатические узлы имеют различные свойства, важно изучить обоих местах. Последовательное удаление лимфатических узлов хирургическим путем предоставляет уникальную возможность следить за иммунный ответ или иммунной расширения ячейки в той же мыши с течением времени. Кроме того, этот метод дает от 1-2х10 6 клеток в лимфатических узлах, достаточное для пеrform фенотипические характеристики и / или функционального анализа. Последовательные операции лимфатических узлов или лимфаденэктомия была успешно использована нами и другими 5-11. Здесь мы опишем, как плечевой и паховые лимфатические узлы могут быть удалены, сделав небольшой разрез в коже anesthetised мыши. Поскольку операция является поверхностным и сделать быстро, мыши восстанавливается очень быстро, заживает хорошо и не испытывает чрезмерную боль. Каждый второй день, можно собрать один или два лимфатических узлов позволяет эксперименты время курса. Этот метод, таким образом, подходящим для изучения характеристик лимфатических узлов, проживающих лимфоцитов с течением времени. Такой подход годится для различных экспериментальных проектов и мы считаем, что многие лаборатории выиграют от выполнения последовательных операций лимфатических узлов.
Protocol
1. Подготовка перед операцией
Мыши были обработаны в соответствии с Канадским советом по руководящим принципам Animal Care.
- Anesthetise мышам инъекции кетамина / ксилазина (150/300 мг / кг, внутрибрюшинно) или при вдыхании ИФ (2%, 1 л кислорода). Если возможно, ИФ следует использовать, поскольку оно позволяет лучше контролировать анестезии времени и глубины. Кроме того, кислород вводится в то же время, поддерживает физиологические функции животных. Кроме того, ИФ непосредственно устранить легкие и, следовательно, не требует печени или почек метаболизм.
- Вводите бупренорфин (0,05 - 0,1 мг / кг, подкожно) или другой анальгетик.
- Применять мазь на глаза мыши до операции, чтобы избежать сухости глаз (если используется ИФ).
- Убедитесь, что мышь спит, зажимая лапой и подвижного хвоста. Если мышь не реагирует, приступить к операции.
2. Хирургия
- Поместите мышь на его стороне.
- Локализация региона, где вы будете выполнять incisioп., в зависимости от LN вы хотите собрать. (Рис. 1).
- Применение хлоргексидина или другого дезинфицирующего средства, в этом регионе.
- Сделать крошечный разрез с острыми ножницами (около 5 мм) или на задней части передней ноги или выше задней лапы у брюшной полости (рис. 1).
- Удалить волосы свободно вы сократили с щипцами. Если вы предпочитаете, вы можете брить мыши перед созданием разреза. Тем не менее, это удлиняет процедуру, и мы находим, что это не нужно, так, как показано ниже, это не улучшает заживление или уменьшение инфекции, которые являются очень редкими.
- Протяните разрез с 2 щипцы для того, чтобы увидеть LN. Разрез может достигать 10 мм. Л.Н. появляется сероватый или темнее, чем окружающие жира.
- Зажмите фасции (тонкие оболочки, покрывающей жир и ткани) в верхней части Л. с одним пинцетом и слегка потяните без нарушения окружающих тканей.
- Поместите второй щипцы, насколько это возможно недеформированнойrneath LN. С первым щипцы, сломать фасции и удаление LN. Если вы успешно собрали Л.Н., пятна крови должны находиться в месте, где LN ранее находились. Отметим, что Л. Н. тонет в изотонический раствор. Этот простой тест позволяет проверить, что вы извлекли Н., а не жировой ткани.
- Убедитесь, что не волосы в ране.
- Закройте разрез, придерживаясь 2 части кожи вместе (внутри кожи) и сшивания их клип. Мы используем несколько клипов Мишель с применением щипцов. Установите один или 2 ролика в зависимости от размера разреза. Чаще всего клипы упасть, когда ткань заживает.
3. Ведение послеоперационного периода
- Добавьте немного влажный корм на дно клетки мышей таким образом, может легко кормить после операции.
- Около 6 до 8 часов после операции, проверить мышей, чтобы они не испытывают боли. Внимательно наблюдать за их поведением (осанка, походка, ввзаимодействие с соединением и внешний вид меха). Если внешний вид мышей бедных, управлять второй дозы бупренорфина. На следующий день мыши должны восстановить их нормальное поведение в противном случае продолжить администрации бупренорфина. Мыши никогда не достигают конечных ранее определены и приняты Советом вашей помощи животных. Вы можете обратиться за советом и помощью к зоотехник виварий помощи.
4. Обработка лимфатических узлов
- В лабораторных условиях для получения суспензии отдельных клеток, отделить LN в соответствии с вашей обычной процедуре. Жмем Л.Н. против слайды матового и регулярно получать 1-2 × 10 6 клеток на LN. Кроме того, мы готовим LN для извлечения РНК.
- Пятно клеток в соответствии с вашим обычным протоколом. Вы должны получить ожидаемый Л.Н. профили проточной цитометрии.
5. Представитель Результаты
Например вперед и стороной разброс рМногое показано LNS собран из наркоза мыши хирургическим путем или пожертвовать мыши (рис. 2). Профиль и процент клеток в живых лимфоцитов ворот такие же, показывая, что Л.Н. хирургии соответствующую технику для уборки клетки.
Рисунок 1. Паховой и плечевой локализации LN в мышь. А. Н. паховой находится чуть выше задних лап, немного в сторону живота. В. Н. плечевой находится за передней ноги.
Рисунок 2. Проточная цитометрия профиля лимфоцитов, полученных после Л.Н. операции. Вперед и боковые профили разброс показаны для LNS найденным Anesthetized мыши хирургическим путем (A) или пожертвовать мыши (B). LNS были собраны, проанализированы и диссоциированных на проточной цитометрии. Процент клеток в живых лимфоцитов ворота показаны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описали протокол Л.Н. операции, которые могут применяться в отношении многих экспериментальных систем. Хотя очень полезно следовать иммунный ответ или иммунного гомеостаза клетки, этот метод имеет ряд ограничений. Во-первых, только четыре LNS могут быть собраны. Во-вторых, иммунный ответ должен быть изучен системным или происходят в поверхностных паховых или плечевой (кожа-слив) LNS. Наконец, число клеток, полученных зависит от качества Л.Н. удаления, технические ограничения, которые могут способствовать экспериментальной изменчивости, когда абсолютное число клеток необходимо. Тем не менее, процент клеток-мишеней, само по себе, может предоставить актуальную и точную информацию, в частности, когда Л. Н. размер не меняется в различных экспериментальных условиях. К счастью, после того как метод хорошо освоили, качество Л.Н. удаления улучшается, что позволяет очень воспроизводимые числа клеток в каждом LN. Мы считаем, что, несмотря на эти несколько ограничений, Л. Н. хирургии обеспечивает ключевые преимущества для изученияпрогрессирование иммунного ответа. Во-первых, иммунный ответ в течение долгого времени могут быть отслежены в данной мыши, снижение экспериментальной изменчивости, а также количество мышей использовали. Во-вторых, такие события, как лимфоцит или гомеостаза иммунной начала ответа, происходящие в LNS может быть непосредственно изучены. Другим важным преимуществом является то, что больше клеток могут быть взысканы с LNS, чем из крови позволяет в течение длительного характеристики клеток. Этот метод также подходит для других целей, таких как генотипирования трансгенных мышей или изучение других клеточных популяций, проживающих или торговля через LNS, таких как В-клетки, дендритные клетки и макрофаги.
Наша лаборатория и другие уже используют эту технику в течение нескольких лет, и мы никогда не наблюдали какого-либо вмешательства в ходе иммунного ответа 7-9,12,13 и иммунного гомеостаза 5-7. Последовательные операции LN в состоянии покоя дикого типа C57BL / 6 мышей не влияет на процент и количество CD4 + + Т-клеток, 5-7. Кроме того, оно не влияет на эти параметры в остаточном LNS. Кроме того, в ходе иммунного ответа, поверхностное удаление LN не влияют на кинетику Т-клеточного ответа, ни поколения Т-клеток памяти 8,9,12,13. Кроме того, бок о бок сравнение Т-клеточного ответа следует либо последовательный хирургии Л.Н. или пожертвовать мыши не показали различий в наших руках (неопубликованные результаты и рисунок 2). Таким образом, последовательные операции Л.Н. подходит для изучения T гомеостаз клетки и ответ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим Сильви Лесаж и все лаборатории членов критического чтения протокола. Эта работа была поддержана грантом (СС-77 545) из Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR). Натали Labrecque поддерживается FRSQ старший стипендии и Мелисса Матье получил NSERC Александр Грэхем Белл Канада высшей стипендии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Graefe Fine Pattern Premium Forceps | Harvard Apparatus | 52-2144 | Strongly Curved, 10 cm (4 in), 0.8 mm tip |
| Michel Clip Applying and Removing Forceps | Harvard Apparatus | 52-3779 | 12.5 cm (5 in) |
| Michel Clip 100 | Harvard Apparatus | 52-3746 | 7.5-1.75 mm |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Merck & Co. | ||
| Vetalar (Ketamine hydrochloride) | Bioniche Animal Health | DIN: 01989529 | |
| Rompun (Xylazine) | Bayer AG | DIN: 02169592 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | DIN: 02032384 | |
| Hypotears eye ointment | Novartis AG | DIN: 02133288 | |
| Baxedin (Clorhexidine gluconate 2% in isopropyl alcohol 70%) | Omega Engineering, Inc. | L0000017 | DIN: 02251477 |
References
- Zehn, D., Lee, S. Y., Bevan, M. J. Complete but curtailed T-cell response to very low-affinity antigen. Nature. 458, 211-214 (2009).
- Vezys, V. Memory CD8 T-cell compartment grows in size with immunological experience. Nature. 457, 196-199 (2009).
- Zhou, X. Differentiation and persistence of memory CD8(+) T cells depend on T cell factor 1. Immunity. 33, 229-240 (2010).
- Wirth, T. C., Badovinac, V. P., Zhao, L., Dailey, M. O., Harty, J. T. Differentiation of central memory CD8 T cells is independent of CD62L-mediated trafficking to lymph nodes. J. Immunol. 182, 6195-6206 (2009).
- Rooke, R., Waltzinger, C., Benoist, C., Mathis, D. Targeted complementation of MHC class II deficiency by intrathymic delivery of recombinant adenoviruses. Immunity. 7, 123-134 (1997).
- Witherden, D. Tetracycline-controllable selection of CD4(+) T cells: half-life and survival signals in the absence of major histocompatibility complex class II molecules. J. Exp. Med. 191, 355-364 (2000).
- Labrecque, N. How much TCR does a T cell need. Immunity. 15, 71-82 (2001).
- Leignadier, J., Labrecque, N. Epitope density influences CD8+ memory T cell differentiation. PLoS One. 5, e13740 (2010).
- Leignadier, J., Hardy, M. P., Cloutier, M., Rooney, J., Labrecque, N. Memory T-lymphocyte survival does not require T-cell receptor expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20440-20445 (2008).
- Obst, R., van Santen, H. M., Mathis, D., Benoist, C. Antigen persistence is required throughout the expansion phase of a CD4(+) T cell response. J. Exp. Med. 201, 1555-1565 (2005).
- Bassett, J. D. CD8+ T-cell expansion and maintenance after recombinant adenovirus immunization rely upon cooperation between hematopoietic and nonhematopoietic antigen-presenting cells. Blood. 117, 1146-1155 (2011).
- Lacombe, M. H., Hardy, M. P., Rooney, J., Labrecque, N. IL-7 receptor expression levels do not identify CD8+ memory T lymphocyte precursors following peptide immunization. J. Immunol. 175, 4400-4407 (2005).
- Leignadier, J., Rooney, J., Daudelin, J. F., Labrecque, N. Lowering TCR expression on naive CD8+ T cells does not affect memory T-cell differentiation. Immunol. Cell. Biol. 89, 322-325 (2011).
