Summary
At følge progressionen af en immunreaktion over tid i samme mus, kan lymfeknuder sekventielt fjernes ved kirurgi. Her beskriver vi, hvordan denne teknik kan udføres.
Abstract
Inden for immunologi, til at forstå progressionen af en immunrespons mod en vaccine, en infektion eller en tumor, bliver respons ofte fulgt over tid. Tilsvarende studiet af lymfocyt homeostase kræver tidsforloebet eksperimenter. Udførelse af disse forsøg inden for den samme mus er ideel til at reducere den eksperimentelle variation samt antallet af anvendte mus. Blod tilbagetrækning tillader udførelse af tidsforløbet eksperimenter, men kun giver oplysning om cirkulerende lymfocytter og tilvejebringer et begrænset antal celler 1-4. Siden lymfocytter cirkulerer gennem kroppen og er bosat i lymfeknuderne har forskellige egenskaber, er det vigtigt at undersøge begge steder. Sekventiel fjernelse af lymfeknuder ved operation tilvejebringer en unik mulighed for at følge en immunreaktion eller immun-celleekspansion in samme mus over tid. Desuden er denne teknik giver mellem 1-2x10 6 celler pr lymfeknude, der er tilstrækkelig til at perform fænotypisk karakterisering og / eller funktionelle assays. Sekventiel lymfeknude operation eller lymphadenectomy held har været anvendt af os og andre 5-11. Her beskriver vi, hvordan brachial og inguinale lymfeknuder kan fjernes ved at gøre en lille indsnit i huden på en bedøvet mus. Da operationen er overfladisk og gjort hurtigt, musen genvinder meget hurtigt, heler godt, og ikke oplever store smerter. Hver anden dag, er det muligt at høste en eller to lymfeknuder muliggør tidsforløbet eksperimenter. Denne teknik er således egnet til at studere egenskaber lymfeknude-bosiddende lymfocytter over tid. Denne fremgangsmåde er egnet til forskellige eksperimentelle designs, og vi mener, at mange laboratorier vil have gavn af at udføre sekventielle lymfeknude operationer.
Protocol
1. Forberedelse før operationen
Mus blev behandlet i overensstemmelse med den canadiske Rådet om Animal Care retningslinjer.
- Anesthetise mus ved injektion af ketamin / xylazin (150/300 mg / kg, ip) eller ved inhalation af isofluran (2%, 1L oxygen). Hvis det er muligt, bør isofluran kan anvendes, da det giver mulighed for en bedre kontrol af anæstesi tid og dybde. Desuden er oxygen administreres på samme tidspunkt, som understøtter de fysiologiske funktioner af dyret. Desuden er isofluran direkte elimineres ved lungerne og således ikke kræver lever-eller nyre metabolisme.
- Injicere buprenorphin (0,05 - 0,1 mg / kg, sc) eller et andet analgetikum.
- Anvend salve på musen øjne før operation for at undgå øjet tørhed (hvis isofluran anvendes).
- Kontroller, at musen er i søvn ved at knibe sin pote og rullende halen. Hvis musen ikke reagerer, skal du fortsætte med operationen.
2. Operationen
- Satte musen på sin side.
- Lokalisere den region, hvor du vil udføre en incision, afhængigt af LN du ønsker at høste. (Figur 1).
- Anvendes chlorhexidin, eller et andet desinfektionsmiddel, at denne region.
- Lave et lille snit med en skarp saks (ca. 5 mm) enten på bagsiden af forben eller over bagpoten nær maven (figur 1).
- Fjern de løse hår, du har skåret med pincet. Hvis du foretrækker, kan du barbere musen før snittet. Imidlertid forlænger proceduren og vi tror, at det ikke er nødvendigt, eftersom, som det er vist her, betyder det ikke bedre heling eller formindskelse infektion, som begge er meget sjældne.
- Strække incision med 2 pincet for at se LN. Snittet kan nå op på 10 mm. LN vises grålig eller mørkere end det omgivende fedt.
- Knibe fascia (den tynde membran, der dækker fedt og væv) oven på LN med en pincet og trække let uden at bryde det omgivende væv.
- Anbring det andet tangen så vidt muligt underneath LN. Med de første pincet, bryde fascia og fjern LN. Hvis du med succes har høstet LN, bør en plet af blod vises på det sted, hvor LN tidligere var placeret. Bemærk, at LN synker i isotonisk opløsning. Denne enkle test giver dig mulighed for at validere, at du har pakket en LN og ikke fedtvæv.
- Kontrollere, at der ikke hår er i såret.
- Lukke snittet ved stikning af 2 dele af huden sammen (indersiden af huden), og ved hæftning dem med en klemme. Vi anvender nogle Michel klip med de gældende pincet. Installere en eller to clips afhængigt af størrelsen af snittet. Oftest clipsene falde af, når vævet heler.
3. Postoperative pleje
- Tilføje nogle vådfoder til bunden af buret så mus kan føde let efter operationen.
- Omkring 6 til 8 timer efter operationen, kontrollere de mus, således at de ikke oplever smerte. Omhyggeligt observere deres adfærd (kropsholdning, gang, isamspil med congener og udseende af pels). Hvis helhedsindtrykket af mus er dårlig, administrere en anden dosis af buprenorphin. Ved den næste dag musene skal genvinde deres normale adfærd ellers fortsætte administrationen af buprenorphin. Musene bør aldrig nå endpoints tidligere fastlagt og accepteret af din Animal Care Rådet. Du vil måske søge råd og hjælp fra din pasning af dyr vivarium tekniker.
4. Lymfeknude Håndtering
- I laboratoriet, for at opnå en enkelt celle suspension adskille LN som pr din sædvanlige procedure. Vi trykker LN mod frostede dias og rutinemæssigt få 1-2 x 10 6 celler pr LN. Alternativt kan vi forberede LN for RNA-ekstraktion.
- Farv cellerne som pr din sædvanlige protokol. Du skal opnå forventede LN flowcytometri profiler.
5. Repræsentative resultater
Et eksempel på frem-og sidespredning pparti er vist for LN høstet fra en bedøvet mus ved kirurgi eller fra en aflivet mus (figur 2). Profil og de procentdele af celler i levende lymfocytporten er de samme som viser, at LN kirurgi er en egnet teknik til høst cellerne.
Figur 1. Inguinale og brachial LN lokalisering i mus. A. lyskelymfeknuder LN er placeret lige over bagpote, let mod bugen. B. brachialis LN er placeret bag forben.
Figur 2. Flowcytometri profil af lymfocytter opnået efter LN kirurgi. Forreste og sidespredning profiler er vist i LN høstet fra en Anesthetized mus ved kirurgi (A) eller fra en aflivet mus (B). LN blev indhøstet, dissocieret og analyseret på et flowcytometer. Procentdele af celler i levende lymfocytporten er vist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet en protokol LN kirurgi, som kan anvendes til mange eksperimentelle systemer. Selv meget nyttigt at følge immunresponser eller immuncelle homeostase, denne teknik har nogle begrænsninger. For det første kan kun fire LN blive høstet. For det andet skal immunsystemet undersøgt respons være systemisk eller forekommer i de overfladiske ingvinale eller brachiale (hud-drænende) LN. Endelig er antallet af høstede celler påvirkes af kvaliteten af LN fjernelse, en teknisk begrænsning som kan bidrage til eksperimentel variabilitet absolutte celleantal er nødvendige. Men procentdelen af målceller, på egen hånd, giver kan relevant og præcis information, især når LN størrelse ikke varierer på tværs af forskellige eksperimentelle betingelser. Heldigvis når teknikken er godt styr på kvaliteten af LN fjernelse forbedrer, hvilket muliggør meget reproducerbare celleantal i hver LN. Vi mener, at på trods af disse få begrænsninger, LN kirurgi giver store fordele at studereprogressionen af immunresponser. For det første kan immunreaktionen over tid spores i en given mus faldende eksperimentelle variation samt antallet af anvendte mus. Sekund, kan begivenheder såsom lymfocyt homeostase eller immunrespons indledning forekommer i LN direkte undersøgt. En anden stor fordel er, at flere celler kan udvindes fra LN end fra blod muliggør forlænget celle karakterisering. Denne teknik er også egnet til andre formål, såsom genotype transgene mus eller studere andre cellepopulationer bosiddende eller handelen via LN såsom B-celler, dendritiske celler og makrofager.
Vores laboratorium og andre har brugt denne teknik i flere år, og vi har aldrig observeret nogen interferens på forløbet af immunresponset 7-9,12,13 og immune homeostase 5-7. Sekventiel LN kirurgi i hvilende vildtype C57BL / 6 mus ikke påvirker den procentdel og antallet af CD4 + + T-celler 5-7. Desuden er det heller ikke påvirke disse parametre i de resterende LN. Endvidere under en immunreaktion, blev overfladisk LN fjernelse ikke påvirke kinetikken for T-celle respons eller frembringelsen af hukommelses-T-celler 8,9,12,13. Endvidere side ved side sammenligning af T celle respons efterfulgt af enten sekventiel LN kirurgi eller aflives mus viste ikke nogen forskel i vores hænder, upublicerede resultater og figur 2). Derfor sekventiel LN kirurgi er egnet til at studere T-celle homeostase og respons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker Sylvie Lesage og alle lab medlemmer til kritisk læsning af protokollen. Dette arbejde blev støttet af en bevilling (MOP-77.545) fra den canadiske Institutes of Health Research (CIHR). Nathalie Labrecque understøttes af en FRSQ Senior Scholarship og Melissa Mathieu modtog en NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Graefe Fine Pattern Premium Forceps | Harvard Apparatus | 52-2144 | Strongly Curved, 10 cm (4 in), 0.8 mm tip |
| Michel Clip Applying and Removing Forceps | Harvard Apparatus | 52-3779 | 12.5 cm (5 in) |
| Michel Clip 100 | Harvard Apparatus | 52-3746 | 7.5-1.75 mm |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Merck & Co. | ||
| Vetalar (Ketamine hydrochloride) | Bioniche Animal Health | DIN: 01989529 | |
| Rompun (Xylazine) | Bayer AG | DIN: 02169592 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | DIN: 02032384 | |
| Hypotears eye ointment | Novartis AG | DIN: 02133288 | |
| Baxedin (Clorhexidine gluconate 2% in isopropyl alcohol 70%) | Omega Engineering, Inc. | L0000017 | DIN: 02251477 |
References
- Zehn, D., Lee, S. Y., Bevan, M. J. Complete but curtailed T-cell response to very low-affinity antigen. Nature. 458, 211-214 (2009).
- Vezys, V. Memory CD8 T-cell compartment grows in size with immunological experience. Nature. 457, 196-199 (2009).
- Zhou, X. Differentiation and persistence of memory CD8(+) T cells depend on T cell factor 1. Immunity. 33, 229-240 (2010).
- Wirth, T. C., Badovinac, V. P., Zhao, L., Dailey, M. O., Harty, J. T. Differentiation of central memory CD8 T cells is independent of CD62L-mediated trafficking to lymph nodes. J. Immunol. 182, 6195-6206 (2009).
- Rooke, R., Waltzinger, C., Benoist, C., Mathis, D. Targeted complementation of MHC class II deficiency by intrathymic delivery of recombinant adenoviruses. Immunity. 7, 123-134 (1997).
- Witherden, D. Tetracycline-controllable selection of CD4(+) T cells: half-life and survival signals in the absence of major histocompatibility complex class II molecules. J. Exp. Med. 191, 355-364 (2000).
- Labrecque, N. How much TCR does a T cell need. Immunity. 15, 71-82 (2001).
- Leignadier, J., Labrecque, N. Epitope density influences CD8+ memory T cell differentiation. PLoS One. 5, e13740 (2010).
- Leignadier, J., Hardy, M. P., Cloutier, M., Rooney, J., Labrecque, N. Memory T-lymphocyte survival does not require T-cell receptor expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20440-20445 (2008).
- Obst, R., van Santen, H. M., Mathis, D., Benoist, C. Antigen persistence is required throughout the expansion phase of a CD4(+) T cell response. J. Exp. Med. 201, 1555-1565 (2005).
- Bassett, J. D. CD8+ T-cell expansion and maintenance after recombinant adenovirus immunization rely upon cooperation between hematopoietic and nonhematopoietic antigen-presenting cells. Blood. 117, 1146-1155 (2011).
- Lacombe, M. H., Hardy, M. P., Rooney, J., Labrecque, N. IL-7 receptor expression levels do not identify CD8+ memory T lymphocyte precursors following peptide immunization. J. Immunol. 175, 4400-4407 (2005).
- Leignadier, J., Rooney, J., Daudelin, J. F., Labrecque, N. Lowering TCR expression on naive CD8+ T cells does not affect memory T-cell differentiation. Immunol. Cell. Biol. 89, 322-325 (2011).
