Summary
遵循多时间内相同的鼠标免疫反应的进展，淋巴结可以依次通过手术切除。在这里，我们描述了这种技术可以如何执行。
Abstract
在免疫学领域，了解进展对疫苗，感染或肿瘤的免疫反应，反应之后往往随着时间的推移。同样，淋巴细胞稳态的研究需要时间课程实验。这些研究是在相同的鼠标理想，以减少实验的变异，以及使用的老鼠数量。抽血时间课程实验允许的性能，但它只能提供约外周血淋巴细胞的信息，并提供数量有限的细胞1-4。由于通过人体循环和居住在淋巴结中的淋巴细胞有不同的特性，重要的是要检查这两个地方。淋巴结顺序切除手术提供了一个独特的机会，后续的免疫反应或免疫细胞膨胀，随着时间的推移相同的鼠标。此外，这种技术的产生，这是足够的PE 1-2X10 6个淋巴结细胞之间rform表型特征和/或功能分析。顺序淋巴结手术或淋巴结清扫已成功地应用于我们和其他国家5-11。在这里，我们描述如何可以通过一个小切口，在皮肤一个anesthetised鼠标删除臂丛和腹股沟淋巴结肿大。由于手术是肤浅的，并迅速完成，鼠标恢复速度非常快，愈合好，不会遇到过多的疼痛。每隔一天，有可能收获一个或两个淋巴结允许时间课程实验。因此，该技术是适合学习节点居住淋巴细胞淋巴结的特点，随着时间的推移。这种方法适用于各种实验设计，我们相信，许多实验室将受益于执行顺序淋巴结手术。
Protocol
1。手术前的准备工作
根据加拿大动物护理准则理事会处理小鼠。
- anesthetise小鼠注射氯胺酮/甲苯噻嗪（150/300毫克/千克，IP）或异氟醚吸入（2％，1L氧气）。如果可以，异氟醚应该使用，因为它允许为更好地控制麻醉时间和深度。此外，氧管理的同时，支持动物的生理功能。此外，异氟醚直接消除肺部，因此并不需要肝，肾代谢。
- 注入丁丙诺啡（0.05 - 0.1毫克/千克，SC）或另一种止痛药。
- 适用于鼠标的眼睛上的药膏，手术前，以避免眼睛干涩（如果使用异氟醚）。
- 确认鼠标是睡着了捏它的爪子，滚它的尾巴。如果鼠标没有反应，进行手术。
2。手术
- 鼠标放在其副作用。
- 本地化的地区，在那里你会执行incisioN，这取决于你想收获的法律公告。 （ 图1）。
- 洗必泰，或另一种消毒剂，适用于该地区。
- 请用锋利的剪刀（约5毫米），无论是在前肢背部或后肢腹部附近（ 图1）以上的微小切口。
- 删除松散的头发，用钳子切断。如果你愿意，你可以刮胡子鼠标，然后才作出的切口。但是，一个较长的过程，我们发现，这是没有必要以来，如下所示，它不会改善愈合，减少感染，这都是非常罕见的。
- 2钳拉伸切口才能看到的LN。切口可能达到10毫米。号法律公告出现灰褐色或暗比周围脂肪。
- 捏用一个镊子的LN上的筋膜（薄膜覆盖的脂肪和组织），轻轻拉，不破坏周围组织。
- 将第二个钳尽可能underneath的LN。第一镊子，打破筋膜和删除号法律公告。如果您已成功收获的LN，染色的血液应该出现在其中的LN以前所在的位置。需要注意的是等渗溶液中的LN汇。这个简单的测试，让您验证您已提取的一种法律公告，而不是脂肪组织。
- 确认没有毛发在伤口。
- 坚持2部分皮肤（皮肤内），装订剪辑，关闭切口。我们使用应用镊子一些米歇尔夹。安装1或2个片段，切口的大小而定。大多数情况下，剪辑时脱落的组织愈合。
3。术后护理
- 笼底部添加一些湿的食物，手术后容易使老鼠能养活。
- 手术后约6至8小时，检查，以确保他们没有经历过痛苦的小鼠。仔细观察他们的行为（姿势，步态，毛皮的外观与同类和相互作用）。如果小鼠的整体外观差，管理的丁丙诺啡第二剂量。由老鼠第二天应该恢复其正常的行为，否则，继续丁丙诺啡的管理。小鼠从未达到先前确定的，由动物保健理事会接受的终点。你可能想寻求咨询和帮助你照顾动物饲养箱技术员。
4。淋巴结处理
- 在实验室中，获得单细胞悬液，游离为您常用的程序的法律公告。我们LN和对磨砂幻灯片按常规获得1-2×10 6细胞每号法律公告。另外，我们准备RNA提取的LN。
- 细胞染色为你平时的协议。你应该获得预期的LN流式细胞仪配置文件。
5。代表结果
例如前部和侧散射带够很多经手术或从牺牲的鼠标（ 图2）从麻醉鼠标收获淋巴结。在现场淋巴细胞门的形象和细胞的百分比相同，表明法律公告手术是一个合适的技术，收获细胞。
图1。腹股沟和鼠标臂LN的本地化。 A.腹股沟号法律公告位于略高于后肢，稍往肚子。 B.臂丛LN是位于前腿后面。
LN的手术后得到图2。流量淋巴细胞流式细胞仪轮廓。前部和侧散射剖面显示从麻醉收获的淋巴结（一）经手术或从牺牲的鼠标（二）etized鼠标。淋巴结收获，分离和流式细胞仪分析。细胞在活的淋巴细胞门的百分比显示。
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Discussion
我们已经描述了LN的手术协议，它可以适用于许多实验系统。虽然非常有益的免疫反应或免疫细胞的平衡，这种技术具有一些限制。首先，只有四个LNS可以收获。二，免疫反应的研究必须是系统性的，或发生在腹股沟浅淋巴结或臂丛（皮肤排出）。最后，收获细胞数号法律公告搬迁的质量，技术的限制，这可能有助于实验变异时需要绝对细胞数的影响。然而，对靶细胞的百分比，对自己，可以提供相关和准确的信息，特别是当LN的大小并不各种实验条件各不相同。幸运的是，一旦技术以及掌握，LN的去除率提高质量，从而在每个LN的高度重复性的手机号码。我们相信，尽管这几年的局限性，法律公告手术提供了重要的优势，研究免疫反应的进展。首先，随着时间的推移的免疫反应，可以在一个特定的鼠标跟踪，减少实验的变异性以及使用的老鼠数量。二，如淋巴细胞稳态或免疫反应开始发生在LNS的事件，可直接影响。另一个主要优点是可以从比从延长细胞的特性，允许血液淋巴结恢复，更多的细胞。该技术也适用于其他用途，如转基因小鼠的基因分型或研究通过淋巴结，如B细胞，树突状细胞和巨噬细胞的其他细胞群体居住或贩运。
我们的实验室和其他已使用了好几年这项技术，我们从来没有观察7-9,12,13的免疫反应过程中的任何干扰免疫稳态5-7。休息野生型C57BL / 6小鼠的序列号法律公告手术没有影响的比例和数量的CD4 + 5-7起来>和CD8 + T细胞。此外，它也不会影响这些参数中残留的淋巴结。此外，在免疫反应过程中，浅表性LN的拆除并不影响T细胞的反应，也不产生记忆性T细胞8,9,12,13动力学。此外，方方T细胞的反应比较之后要么顺序号法律公告手术或处死小鼠没有表现出任何差异（未发表的结果和图2）在我们的手中。因此，序列号法律公告手术是合适的研究T细胞的动态平衡和响应。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢西尔维·为该协议的的关键的读数的勒萨热和的所有劳顾会委员。这项工作被受支持的由一个从的作者：卫生研究所（CIHR）的的加拿大研究院的的授出日期（澳门币-77545）。纳萨莉拉布雷克被由一个FRSQ的高级奖学金的的支持，，和MELISSA的Mathieu收到1 NSERC亚历山大·格雷厄姆·加拿大贝尔公司研究生奖学金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Graefe Fine Pattern Premium Forceps | Harvard Apparatus | 52-2144 | Strongly Curved, 10 cm (4 in), 0.8 mm tip |
| Michel Clip Applying and Removing Forceps | Harvard Apparatus | 52-3779 | 12.5 cm (5 in) |
| Michel Clip 100 | Harvard Apparatus | 52-3746 | 7.5-1.75 mm |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Merck & Co. | ||
| Vetalar (Ketamine hydrochloride) | Bioniche Animal Health | DIN: 01989529 | |
| Rompun (Xylazine) | Bayer AG | DIN: 02169592 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | DIN: 02032384 | |
| Hypotears eye ointment | Novartis AG | DIN: 02133288 | |
| Baxedin (Clorhexidine gluconate 2% in isopropyl alcohol 70%) | Omega Engineering, Inc. | L0000017 | DIN: 02251477 |
References
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