Summary
Att följa framskridandet av en immunrespons med tiden inom samma mus kan lymfkörtlar sekventiellt avlägsnas genom kirurgi. Här beskriver vi hur denna teknik kan utföras.
Abstract
Inom området för immunologi, att förstå progressionen av en immunrespons mot ett vaccin, en infektion eller en tumör, är svaret följs ofta över tiden. Likaså kräver studiet av lymfocyter homeostas försök tidsförlopp. Dessa studier inom samma mus är idealisk för att reducera den experimentella variationen liksom antalet använda möss. Blod tillbakadragande kan utföra experiment tidsförloppet för detta, men det ger endast information om cirkulerande lymfocyter och ger ett begränsat antal celler 1-4. Eftersom lymfocyter cirkulerar genom kroppen och är bosatt i lymfkörtlarna har olika egenskaper är det viktigt att undersöka båda platserna. Det sekventiella avlägsnandet av lymfkörtlar genom kirurgi ger en unik möjlighet att följa ett immunsvar eller immunceller expansion i samma mus över tiden. Vidare ger denna teknik mellan 1-2x10 6 celler per lymfkörtel som är tillräcklig för att perform Fenotypisk karakterisering och / eller funktionella analyser. Sekventiell lymfkörtel operation eller lymfkörtlar har framgångsrikt använts av oss och andra 5-11. Här beskriver vi hur brachialis och inguinala lymfknutor kan avlägsnas genom att ge ett litet snitt i huden på en anestesi mus. Eftersom operationen är ytlig och gjort snabbt återhämtar musen mycket snabbt läker bra och inte uppleva kraftigt smärta. Varannan dag, är det möjligt att skörda en eller två lymfkörtlar möjliggör experiment tidsförlopp. Denna teknik är därför lämplig att studera egenskaperna hos lymfkörtel-bor lymfocyter över tiden. Detta tillvägagångssätt är lämpligt för olika experimentella design och vi tror att många laboratorier skulle ha nytta av att utföra sekventiella operationer lymfkörtlar.
Protocol
1. Förberedelser Före operationen
Möss behandlades i enlighet med den kanadensiska rådet om riktlinjer Animal Care.
- Anesthetise möss genom injektion av ketamin / xylazin (150/300 mg / kg, ip) eller genom inhalation av isofluran (2%, 1 liter syre). Om sådana finns, bör isofluran användas som den möjliggör en bättre kontroll av anestesi tid och djup. Dessutom är syre administreras vid samma tidpunkt som uppbär de fysiologiska funktionerna hos djuret. Dessutom Isofluran direkt elimineras genom lungorna och därför inte kräver nedsatt lever-eller njursjukdom metabolism.
- Injicera buprenorfin (0,05 - 0,1 mg / kg, se) eller ett annat analgetikum.
- Applicera salva på mus ögonen före kirurgi för att undvika torra ögon (om isofluran används).
- Kontrollera att musen sover genom att nypa sin tass och rulla svansen. Om musen inte reagerar, gå vidare med operationen.
2. Operationen
- Sätt musen på sin sida.
- Lokalisera den region där du kommer att utföra en incision, beroende på LN oss för att hämta. (Figur 1).
- Applicera klorhexidin, eller annat desinfektionsmedel, till den regionen.
- Göra en liten incision med vass sax (ca 5 mm) antingen på baksidan av framben eller över den bakre tassen nära buken (figur 1).
- Ta bort de lösa håren du har klippt med pincett. Om du vill kan du raka musen innan snittet. Det förlänger den förfarandet och vi finner att det inte är nödvändigt eftersom, som visas här, inte förbättra läkningen eller minska infektion, som båda är mycket sällsynta.
- Sträck snittet med 2 pincett för att se LN. Snittet kan uppgå till 10 mm. LN visas gråaktiga eller mörkare än den omgivande fett.
- Nyp av fascia (den tunna membran som täcker fett och vävnad) på toppen av LN med en pincett och dra försiktigt utan att bryta den omgivande vävnaden.
- Placera den andra tången så långt som möjligt underneath LN. Med de första tång, bryta fascia och ta bort LN. Om du har lyckats skördat LN bör en fläck av blod visas vid den plats där LN fanns tidigare. Observera att LN sjunker i isoton lösning. Detta enkla test kan du bekräfta att du har extraherat en LN och inte fettvävnad.
- Verifiera att inga hår är i såret.
- Stänga snittet genom stickning av 2 delar av huden tillsammans (insidan av huden) och genom att stapla dem med en klämma. Vi använder några Michel Clip med gäller pincett. Installera en eller två klämmor beroende på storleken av snittet. Oftast klippen faller av när vävnaden läker.
3. Postoperativ vård
- Lägg till lite våtfoder till botten av buren så att mössen kan mata lätt efter operationen.
- Ca 6 till 8 timmar efter operationen, kontrollera mössen att säkerställa att de inte upplever smärta. Följ noggrant deras beteende (hållning, gång, isamspelet med kongen och utseende av päls). Om det totala utseendet hos mössen är dålig, administrera en andra dos av buprenorfin. Vid nästa dag möss bör återfå sin normala beteende i övrigt fortsätta administrering av buprenorfin. Mössen får aldrig nå ändpunkterna som tidigare fastställts och godkänts av ditt djur Care rådet. Du kanske vill söka råd och hjälp från din djurskötsel vivarium tekniker.
4. Lymfkörtel Hantering
- I laboratoriet, för att få en enda cell suspension, dissociera LN enligt din vanliga förfarandet. Vi trycker LN mot frostade bilder och rutinmässigt få 1-2 x 10 6 celler per LN. Alternativt, förbereder vi LN för RNA-extraktion.
- Färga cellerna enligt din vanliga protokoll. Du bör få förväntade LN-profiler flödescytometri.
5. Representativa resultat
Ett exempel på framåt-och sidospridning pstor visas för LNS skördas från en sövd mus med kirurgi eller från en offrad mus (figur 2). Profilen och de procenttal av celler i levande lymfocytgrinden är desamma som visar att LN kirurgi är en lämplig teknik för att skörda cellerna.
Figur 1. Ijumsk-och brakial LN lokalisering i mus. A. inguinal LN ligger precis ovanför baktass, något mot magen. B. brachialis LN ligger bakom framben.
Figur 2. Flödescytometri profil lymfocyter som erhållits efter LN kirurgi. Framåt-och sidospridning profiler visas för LNS skördats från en Anesthetized mus med kirurgi (A) eller från en offrad mus (B). LNS skördades, dissocierades och analyserades på en flödescytometer. Procenttal av celler i levande lymfocytgrinden visas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrivit ett protokoll för LN operation vilka kan gälla för många experimentella system. Även mycket användbara för att följa immunsvar eller immunceller homeostas, har denna teknik ett antal begränsningar. Först kan endast fyra LNS skördas. För det andra måste immunsvaret studeras vara systemisk eller förekommer i ytliga inguinal eller brakial (hud-dränerande) LNS. Slutligen är antalet skördade celler påverkas av kvaliteten på LN bort en teknisk begränsning som kan bidra till experimentell variation när det absoluta cellantalen behövs. Men andelen målceller, på egen hand kan ge relevant och korrekt information i synnerhet när LN storlek inte varierar mellan olika experimentella betingelser. Lyckligtvis, när den teknik är väl bemästras, kvaliteten hos LN avlägsnande förbättras, vilket möjliggör höggradigt reproducerbara cellantal i varje LN. Vi tror att trots dessa få begränsningar ger LN operation viktiga fördelar att studerafortskridandet av immunsvar. Först kan immunsvaret med tiden kan följas i en given mus, minskar experimentella variationen liksom antalet använda möss. För det andra kan händelser såsom lymfocyter homeostas eller immunsvar initiering sker i LNS direkt studeras. En annan stor fördel är att fler celler kan återvinnas från LNS än från blod möjliggöra utökad cell karakterisering. Denna teknik är även lämplig för andra ändamål såsom genotypning transgena möss eller studera andra cellpopulationer bor eller handel genom LNS såsom B-celler, dendritiska celler och makrofager.
Vårt laboratorium och andra har använt denna teknik i flera år och vi har aldrig märkt några störningar på loppet av immunsvaret 7-9,12,13 och immunförsvaret homeostas 5-7. Sekventiell LN kirurgi i vila vildtyp C57BL / 6 möss påverkade inte andelen och antalet CD4 + + T-celler 5-7. Dessutom är det inte heller påverka dessa parametrar i de resterande LNS. Vidare, under loppet av en immunrespons, har ytliga LN avlägsnande påverkar inte kinetiken för T-cellssvar eller generering av celler minnes-T-8,9,12,13. Dessutom, följt sida vid sida jämförelse av T-cell respons antingen genom sekventiell LN kirurgi eller offrad mus inte visade några skillnader i våra händer (opublicerade resultat och figur 2). Därför är sekventiell LN operation är lämplig för att studera T-cell homeostas och svar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Sylvie Lesage och alla medlemmar Lab för kritisk läsning av protokollet. Detta arbete stöds av ett bidrag (MOP-77.545) från den kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR). Nathalie Labrecque stöds av en FRSQ Senior stipendium och Melissa Mathieu mottagna en NSERC Alexander Graham Bell Kanada Graduate stipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Graefe Fine Pattern Premium Forceps | Harvard Apparatus | 52-2144 | Strongly Curved, 10 cm (4 in), 0.8 mm tip |
| Michel Clip Applying and Removing Forceps | Harvard Apparatus | 52-3779 | 12.5 cm (5 in) |
| Michel Clip 100 | Harvard Apparatus | 52-3746 | 7.5-1.75 mm |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Merck & Co. | ||
| Vetalar (Ketamine hydrochloride) | Bioniche Animal Health | DIN: 01989529 | |
| Rompun (Xylazine) | Bayer AG | DIN: 02169592 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | DIN: 02032384 | |
| Hypotears eye ointment | Novartis AG | DIN: 02133288 | |
| Baxedin (Clorhexidine gluconate 2% in isopropyl alcohol 70%) | Omega Engineering, Inc. | L0000017 | DIN: 02251477 |
References
- Zehn, D., Lee, S. Y., Bevan, M. J. Complete but curtailed T-cell response to very low-affinity antigen. Nature. 458, 211-214 (2009).
- Vezys, V. Memory CD8 T-cell compartment grows in size with immunological experience. Nature. 457, 196-199 (2009).
- Zhou, X. Differentiation and persistence of memory CD8(+) T cells depend on T cell factor 1. Immunity. 33, 229-240 (2010).
- Wirth, T. C., Badovinac, V. P., Zhao, L., Dailey, M. O., Harty, J. T. Differentiation of central memory CD8 T cells is independent of CD62L-mediated trafficking to lymph nodes. J. Immunol. 182, 6195-6206 (2009).
- Rooke, R., Waltzinger, C., Benoist, C., Mathis, D. Targeted complementation of MHC class II deficiency by intrathymic delivery of recombinant adenoviruses. Immunity. 7, 123-134 (1997).
- Witherden, D. Tetracycline-controllable selection of CD4(+) T cells: half-life and survival signals in the absence of major histocompatibility complex class II molecules. J. Exp. Med. 191, 355-364 (2000).
- Labrecque, N. How much TCR does a T cell need. Immunity. 15, 71-82 (2001).
- Leignadier, J., Labrecque, N. Epitope density influences CD8+ memory T cell differentiation. PLoS One. 5, e13740 (2010).
- Leignadier, J., Hardy, M. P., Cloutier, M., Rooney, J., Labrecque, N. Memory T-lymphocyte survival does not require T-cell receptor expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20440-20445 (2008).
- Obst, R., van Santen, H. M., Mathis, D., Benoist, C. Antigen persistence is required throughout the expansion phase of a CD4(+) T cell response. J. Exp. Med. 201, 1555-1565 (2005).
- Bassett, J. D. CD8+ T-cell expansion and maintenance after recombinant adenovirus immunization rely upon cooperation between hematopoietic and nonhematopoietic antigen-presenting cells. Blood. 117, 1146-1155 (2011).
- Lacombe, M. H., Hardy, M. P., Rooney, J., Labrecque, N. IL-7 receptor expression levels do not identify CD8+ memory T lymphocyte precursors following peptide immunization. J. Immunol. 175, 4400-4407 (2005).
- Leignadier, J., Rooney, J., Daudelin, J. F., Labrecque, N. Lowering TCR expression on naive CD8+ T cells does not affect memory T-cell differentiation. Immunol. Cell. Biol. 89, 322-325 (2011).
