पार्किंसंस रोग में neuropeptides की MALDI इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री

Summary

Dopamine प्रतिस्थापन एल DOPA का उपयोग pharmacotherapy के सबसे अधिक इस्तेमाल किया है पार्किंसंस रोग के लक्षण इलाज है, लेकिन है अनैच्छिक असामान्य आंदोलनों, करार दिया अपगति सहित साइड इफेक्ट के साथ

Protocol

प्रोटोकॉल के MALDI कई चूहा मस्तिष्क वर्गों, आमतौर पर 20-30 वर्गों से आईएमएस डेटा का सांख्यिकीय विश्लेषण के प्रयोजन के लिए निकाला जाता है, और पाँच अलग अलग चरणों के ऊतक तैयारी शामिल होते हैं, मैट्रिक्स आवेदन, MALDI-TOF एमएस विश्लेषण, डेटा मूल्यांकन, और neuropeptide पहचान. उल्लिखित प्रक्रियाओं और अधिक नीचे विस्तृत में वर्णित है:

1. ऊतक तैयारी

इस प्रक्रिया में संबंधित ऊतकों के नमूनों के संग्रह के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आईएमएस विश्लेषण के लिए सेक्शनिंग ऊतक भी शामिल है. प्रोटीन और पेप्टाइड विश्लेषण में एक विशेष उद्देश्य के proteolytic गिरावट से बचने के है. इसलिए यह के ऊतक विच्छेदन के दौरान तेज और मेहनती काम करने के लिए आवश्यक है.

1. के शिरच्छेद द्वारा चूहों (आमतौर पर 250-300 ग्राम) बलिदान, पोस्टमार्टम <पाउडर सूखी बर्फ पर 30 और फ्रीज की एक अधिकतम समय के भीतर चूहा मस्तिष्क ° -80 सी फ्रीजर करने के लिए स्थानांतरित करने से पहले हटा दें. तेजी से तरल नाइट्रोजन का उपयोग ठंडमस्तिष्क के ऊतकों है जो नकारात्मक मैट्रिक्स क्रिस्टलीकरण को प्रभावित करेगा में microtears के जोखिम को बढ़ाने के लिए और इस तरह एमएस गुणवत्ता को कम (छवि 2 डी). पूरे दिमाग एमएस संकेत गुणवत्ता की हानि के बिना सेक्शनिंग से पहले कई वर्षों के लिए भंडारित किया जा सकता है.
2. Cryostat 12 माइक्रोन स्लाइस और प्रवाहकीय MALDI गिलास स्लाइड पर पिघलना माउंट ऊतक वर्गों (ईण्डीयुम टिन ऑक्साइड लेपित स्लाइड, Bruker Daltonics) से MALDI या लक्ष्य (छवि 2A सी) के लिए सूक्ष्म तक्षणी पर जमे हुए ऊतक कटौती.
3. -80 में सूखी वैक्यूम के अंतर्गत 15 मिनट और दुकान स्लाइड के लिए वर्गों डिग्री सेल्सियस तक आगे का उपयोग. ऊतक वर्गों प्रोटोकॉल के बाद कम से कम संभव समय के भीतर विश्लेषण किया जाना चाहिए, भले ही -80 में संग्रहीत डिग्री सेल्सियस हम पाते हैं कि एमएस संकेत गुणवत्ता काफ़ी भंडारण में एक वर्ष के बाद कम हो जाएगा. आदेश में प्रोटीन और पेप्टाइड्स के ऑक्सीकरण को कम करने के लिए, भंडारण कंटेनर में हवा एक आभ्यांतरिक गैस (जैसे argon या नाइट्रोजन) के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है.

2. मैट्रिक्स आवेदन

मैट्रिक्स आवेदनकदम स्पेक्ट्रम की गुणवत्ता पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है और कई तरह के ऊतक के रूप में अच्छी तरह के रूप में ब्याज की analyte के आधार पर मानकों के अनुकूलन की आवश्यकता है. इन कारकों के रूप में मैट्रिक्स की तरह, मैट्रिक्स एकाग्रता, पीएच, ऊतक धोने और जैविक संशोधक के रूप में अच्छी तरह के रूप में जमा की मात्रा, पार्श्व और ¹⁰ बयानों के संकल्प संख्या (छवि 2 डी) सहित वाद्य सेटिंग्स रासायनिक पैरामीटर शामिल हैं. बड़े पैमाने पर प्रयोग के लिए, यह काफी महत्व की है में विचरण को कम करने के लिए, सभी वर्गों को एक दिन के भीतर लागू करने मैट्रिक्स और उदाहरण के द्वारा एक ही ऑपरेटर के लिए. हालांकि वहाँ कई रणनीतियों रहे हैं के रूप में उच्च बनाने की क्रिया या स्प्रे, छोटे मैट्रिक्स बूंदों के arrays की स्वचालित बयान, द्वारा आकार में 100-150 picoliter के बारे में, छोटे प्रोटीन और neuropeptides के विश्लेषण के लिए विभिन्न ऊतकों में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया मैट्रिक्स समाधान लागू मस्तिष्क वर्गों ^{9, 10,11, 12, 13} सहित.

1. डीफ्रोस्ट 1 ज के लिए एक dessicator में वर्गोंहमारे.
2. यकीन है कि एक ऑपरेटर से दूसरे व्यक्ति द्वारा प्रयोग अंधा है. पुनः लेबल सभी नमूनों.
3. 70% इथेनॉल (EtOH, कमरे के तापमान पर, आर टी) में वर्गों 1x और 10 सेकंड के लिए धो दो बार में 95% EtOH 10 सेकंड के लिए (आर टी). बड़े प्रयोगों के लिए, सभी कांच के लिए धोने प्रदर्शन एक साथ स्लाइड क्रम में भिन्नता को कम से कम एक क्युवेट का उपयोग.
4. सूखी 10 मिनट dessicator में वर्गों.
5. एक खुर्दबीन के नीचे ऊतक वर्गों का मूल्यांकन करने और ऊतक विरूपण, microtears, और छोटे दरारें कि MALDI एमएस गुणवत्ता ख़राब जाएगा (छवि 2 डी) के लिए जांच.
6. ताजा मैट्रिक्स 50% मेथनॉल, 10% 150mm अमोनियम एसीटेट (Amac) और 0.3% पानी में trifluoroacetic एसिड (TFA) में 50 मिलीग्राम / एमएल DHB मिलकर समाधान तैयार.
7. मैट्रिक्स आवेदन असतत छोटी बूंद बयान से एक आयताकार पैटर्न (चिप, Shimadzu) के एक रासायनिक inkjet प्रिंटर का उपयोग किया जाता है. पहला कदम neuropeptide विश्लेषण सहित लिए मैट्रिक्स आवेदन की प्रयोगात्मक मापदंडों का अनुकूलनपास प्रति बूंदों की एनजी संख्या, गुजरता की संख्या. इस प्रयोग के कई अलग अलग आवेदन के मानकों के साथ मैट्रिक्स arrays ही ऊतक खंड पर, लागू करने, जबकि यह सुनिश्चित करें कि प्रत्येक सरणी महासंयोजिका, प्रांतस्था, और striatum के रूप में इसी तरह मस्तिष्क क्षेत्रों को कवर है बनाने के द्वारा किया जाता है. वही प्रयोग के लिए किया जा हर बार पैरामीटर बदल रहे हैं, जिसमें अलग मस्तिष्क संरचना, विभिन्न विशिष्ट analytes लक्ष्यीकरण matrices के, और अगर अलग मैट्रिक्स सॉल्वैंट्स विशेष analytes की निकासी के लिए जरूरत है.
8. ऊतक अनुभाग के साथ गिलास स्लाइड धारक स्कैन और धारक संरेखित करें. मैट्रिक्स के आवेदन लिए ऊतक खंड पर आपके सरणी और परिभाषित स्थानिक संकल्प यानी स्थान निर्दिष्ट दूरी हाजिर. मैट्रिक्स रासायनिक inkjet प्रिंटर पर अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग कर लागू करें. इस प्रयोग के लिए हम निम्न मुद्रण मापदंडों के साथ पेप्टाइड इमेजिंग के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का प्रयोग किया: 10 बूँदें (100 PL ड्रॉप /), 10 आवेदन गुजरता है और एक जगह घ हाजिर300 माइक्रोन की istance.
9. स्कैन अंतिम मैट्रिक्स वर्गों देखा और पंजीकरण के लिए तस्वीर बचाने के लिए MALDI डाटा अधिग्रहण (3.4 कदम) के लिए पहले.
10. वर्गों तहत निर्वात dessicator में आगे का उपयोग तक स्टोर.

3. MALDI एमएस डाटा अधिग्रहण और प्रसंस्करण

एमएस विश्लेषण की neuropeptides की उड़ान साधन (Ultraflex द्वितीय, Bruker Daltonics, जर्मनी) प्रतिक्षेपक मोड में परिचालन के एक MALDI समय के पर किया जाता है, हर एक मैट्रिक्स स्थान से ¹⁴ सॉफ्टवेयर अधिग्रहण सहायता डेटा का उपयोग कर. इसलिए सही स्थानिक शिक्षण आवश्यक है. यह जरूरी है कि MALDI अनुकूलन, अधिग्रहण, और विशेष रूप से लक्ष्य पंजीकरण प्रयोगों कि अधिमानतः प्रयोगात्मक समूहों के लिए अंधा किया जाना चाहिए एक ही ऑपरेटर के द्वारा प्रदर्शन कर रहे हैं. कई गिलास स्लाइड के साथ एक बड़े पैमाने पर प्रयोग में, MALDI प्रयोगों के एक ऑपरेटर द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है जबकि एक अन्य व्यक्ति रासायनिक inkjet प्रिंटर काम कर रहा है.

1. मास स्पेक्ट्रोमीटर में कांच स्लाइड लोड.
2. MALDI अधिग्रहण एक कम आणविक भार मानक अंशांकन मिश्रण (Bruker Daltonics) पद्धति का उपयोग करके की अंशांकन की जाँच करें.
3. अधिग्रहण मापदंडों ऑप्टिमाइज़.
   1. आदेश में एमएस संकेत अनुकूलन करने के लिए और पड़ोसी मैट्रिक्स जमा से मैट्रिक्स ablating से बचने, और ऊतक पर इष्टतम ध्यान केंद्रित लेजर का आकार निर्धारित किया जाना चाहिए.
   2. लेजर ऊर्जा से संभव के रूप में कई मैट्रिक्स जमा के रूप में आधार रेखा को ऊपर उठाने के बिना अधिकतम एमएस गुणवत्ता सुनिश्चित शिखर संकल्प या डिटेक्टर saturating कम करने के लिए सेट कर दिया जाता है.
   3. मैट्रिक्स स्थान प्रति शॉट्स की अधिकतम संख्या का आकलन तक केवल शोर का पता चला है, अक्सर 1000-2000 शॉट्स. कि शॉट्स और संचित किया जाना चाहिए एक स्थान के भीतर लेजर स्थिति से पहले प्राप्त शॉट्स की संख्या में परिवर्तन होना चाहिए की संख्या का अनुमान है. आदेश में प्रत्येक मैट्रिक्स स्थान नमूना के लिए समान रूप से, हम 25 शॉट चरणों में 600 शॉट जमा, 24 कदम की कुल संख्या के लिए एक भाग का उपयोगआंदोलन के डोम प्रत्येक मैट्रिक्स बयान से, पैटर्न.
4. पंजीकरण MALDI चरण के मोटर निर्देशांक FlexImaging के का उपयोग कर (v.2.0) ¹⁰ देखा वर्गों के स्कैन और बैच मोड में AutoXexuteBatchRunner.exe सॉफ्टवेयर के द्वारा डाटा अधिग्रहण प्रदर्शन.
5. आधारभूत घटाव (उत्तल पतवार V3), चौरसाई और बाहरी अंशांकन (वैकल्पिक), एक आस्की फाइल (* dat, *. Txt या *. Csv प्रारूप) के रूप में निर्यात के बाद के माध्यम से प्रत्येक एकल स्पेक्ट्रा की प्रक्रिया ^15.

4. डेटा मूल्यांकन

अंतिम डेटा मूल्यांकन शिखर जानकारी, सांख्यिकीय विश्लेषण के बाद ही ध्यान केंद्रित द्वारा डेटा पोस्ट प्रोसेसिंग और डेटा की कमी शामिल है.

1. एक प्रारंभिक कदम के रूप में, MALDI आईएमएस वर्गों overnormalization प्रभाव के लिए मूल्यांकन किया गया है. यह आसानी से डेटा दृश्य उपकरणों के रूप में (Bruker Daltonics) FlexImaging या BioMap (नोवार्टिस) के रोजगार से प्राप्त किया जा सकता है. एक प्रारंभिक कदम के रूप में कुल आयन छवियों के ईवा हैंकुल आयन वर्तमान सामान्य (घरेलू) से पहले luated, विभिन्न प्रमुख पेप्टाइड चोटियों के एकल आयन वितरण के छवियों के मैनुअल निरीक्षण के द्वारा पीछा किया. विशेषता शिखर तीव्रता वितरण के लिए देखो और अगर वे ऊतक की विशेषताएं (हर्जाना) से जुड़े हुए हैं, गुणवत्ता या सामान्य प्रभाव (3 छवि) खोलना.
2. Histological सुविधाओं के अनुसार हितों के क्षेत्रों (जैसे striatum) चित्रित करना और आस्की फाइल प्रारूप में इसी स्पेक्ट्रा निर्यात. अधिमानतः, स्पेक्ट्रा की कुल आयन वर्तमान (घरेलू) के लिए सामान्य इस स्तर पर किया जा सकता है.
3. मूल के रूप में इस तरह के डेटा को संभालने सॉफ्टवेयर (v.8.1, Originlab), (MathWorks, Natick, MA, संयुक्त राज्य अमेरिका) MATLAB या ¹⁶ आर में आस्की फाइल आयात. पीक पता लगाने के शिखर ढूँढने सॉफ्टवेयर में शामिल उपकरण का उपयोग किया जा सकता है उत्पत्ति या Matlab में mspeaks "के" शिखर विश्लेषण "उदाहरण के लिए. सभी स्पेक्ट्रा से एक ही टैब सीमांकित पाठ फ़ाइल के रूप में peaklists निर्यात.
4. क्रम में पता चला पेप्टाइड के लिए बिन सीमाओं का निर्धारण करने के लिएचोटियों, binning विश्लेषण उपयुक्त सॉफ्टवेयर उपकरण (जैसे ¹⁷ pbin) का उपयोग किया जाता है या घर में MATLAB या आर के लिए यहाँ स्क्रिप्ट लिखा एकल पाठ सभी शिखर युक्त फ़ाइल डेटा उठाया सॉफ्टवेयर में लोड और शिखर सीमा निर्धारण के लिए पैरामीटर निर्दिष्ट कर रहे हैं कितनी बार एक चोटी स्पेक्ट्रा में उपस्थित होने के क्रम में प्रयोग के लिए प्रासंगिक होना चाहिए के रूप में. उदाहरण के लिए, प्रयोग पशुओं के 2 समूहों, प्रत्येक समूह में 5 पशुओं, और 100 स्पेक्ट्रा प्रत्येक और ब्याज की पशु क्षेत्र से एकत्र कर रहे हैं शामिल हैं. माने एक चोटी संभावित दिलचस्प है, अगर यह कम से कम एक समूह (3/5) में और उन जानवरों के स्पेक्ट्रा (3x50 = 150 स्पेक्ट्रा) के कम से कम आधा में पशुओं के बहुमत में मौजूद है, यह एक कुल प्रतिशत दे देंगे 150 कुल 1000 स्पेक्ट्रा (2x5x100) के सकारात्मक स्पेक्ट्रा के लिए 15% की. Pbin उपकरण का उपयोग करना है, इस कदम एक एकल binrange सभी बिन डेटा प्राप्त से निर्धारित चौड़ाई वाली फ़ाइल पैदावार. आदेश में कहा कि बिन सीमाओं को सत्यापित करने के लिएउचित हैं, यह आसान है उत्पत्ति में डिब्बे मूल स्पेक्ट्रा के निशान के साथ एक साथ कल्पना.
5. पीक क्षेत्र एकीकरण विचरण है कि सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है कम कर सकते हैं. हम अनुसंधान के लिए एक घर में लिखित स्क्रिप्ट का उपयोग शिखर चरण 4 में निर्धारित सीमाओं के बीच वक्र के अंतर्गत क्षैत्र को परिकलित. एकीकृत शिखर क्षेत्रों में एमएस एक्सेल (v.2007) और सांख्यिकीय विश्लेषण में सैम उपकरण का उपयोग कर ¹⁸ प्रदर्शन गैर पैरामीट्रिक unpaired परीक्षण के माध्यम से आयात कर रहे हैं.

5. पेप्टाइड पहचान

आदेश में जैविक प्रासंगिकता समाप्त अनुक्रम मनाया पेप्टाइड पहचान का सत्यापन आवश्यक है. सबसे सही तरीका अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस / एमएस) के माध्यम से पेप्टाइड विखंडन का उपयोग ऊतक बंद सीधे सच निर्धारण ऊपर से नीचे में शामिल हैं, हालांकि उच्च पेप्टाइड सांद्रता ^12,13 विश्लेषण के इस प्रकार के लिए आवश्यक हैं. कम प्रचुर मात्रा में पेप्टाइड्स या Clos साथ कई पेप्टाइड्सउन्हें z / मूल्यों (± 0.5%), ऊतक पर विश्लेषण और बिगड़ा बंद ऊतक एक peptidomic रणनीति का उपयोग करते हुए विश्लेषण का उपयोग किया जाता है कि निष्कर्षण, जुदाई, और एमएस अंतर्जात neuropeptides की पहचान आधारित शामिल हैं. यहाँ प्रस्तुत प्रयोग के लिए, केंद्रीय opioid पेप्टाइड का पता लगाने, जो एक विशेष चुनौती है क्योंकि इन पेप्टाइड्स काफी कम हैं स्पेक्ट्रा में अन्य neuropeptides के साथ तुलना में प्रचुर मात्रा पर ध्यान केंद्रित किया गया था. इसके अलावा, इन पेप्टाइड्स बल्कि ध्रुवीय कर रहे हैं जो उन्हें अपेक्षाकृत हाइड्रोफिलिक और मुश्किल आम पेप्टाइड निष्कर्षण और जुदाई तकनीक के साथ बनाए रखने बनाता है .. इसलिए हम मानक पेप्टाइड ^9,19 पहचान आधारित LC-MS/MS साथ संयोजन में ऊतक निष्कर्षण और opioid पेप्टाइड prefractionation के लिए पहले की रिपोर्ट प्रोटोकॉल लागू होता है.

1. ब्याज का लक्ष्य संरचनाओं (पूंछवाला putamen, सीपीयू नाभिक accumbens, एनएसी) के राज्याभिषेक वर्गों लीजिए. एक cryostat सूक्ष्म में जमे हुए चूहा मस्तिष्क माउंट और आसपास के मस्तिष्क सामग्री को हटाने (भ्रष्टाचारTex, पट, एक स्केलपेल के साथ महासंयोजिका). विच्छेदित एनएसी और CPU और एनएसी और अलग गिलास स्लाइड पर वर्गों के CPU भागों माउंट पिघलना, वर्गों (30 = पता 50 माइक्रोन) ले लीजिए.
2. 100 μL 5% ACN/0.1% TFA जोड़ने, दो मिनट के लिए सेते हैं ऊतक बंद पेप्टाइड्स निकालें और Eppendorf कम प्रोटीन बंधन ट्यूबों में एकत्र. इस कदम को दो बार दोहराएँ.
3. मजबूत कटियन विनिमय क्रोमैटोग्राफी वृद्धि ईओण ¹⁹ शक्ति में stepwise क्षालन (n = 4) का उपयोग कर के माध्यम पेप्टाइड prefractionation द्वारा प्रदर्शन करते हैं. नीचे एक speedvac concentrator का उपयोग कर के तहत निर्वात नमूने सूखी.
4. Nanoflow C18 उलट चरण तरल क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से (1100, टेक्नोलॉजीज, सांता क्लारा, CA) electrospray अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS/MS) को interfaced द्वारा पेप्टाइड भिन्न विश्लेषण. एमएस प्रयोगों पर प्रदर्शन किया गया एक संकर रैखिक / iontrap के फूरियर परिवरतित आयन साइक्लोट्रॉन प्रतिध्वनि (FTICR) के के साधन LTQ एफटी 7 ट, थर्मो वैज्ञानिक, वॉल्थम, एमए, पेप्टाइड fulscan स्पेक्ट्रा (मीटर z / 150-2000) 5 सबसे तीव्र iontrap के पेप्टाइड चोटियों में टक्कर प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) ⁹ के माध्यम से के बाद विखंडन के बाद उच्च सामूहिक संकल्प (100000) पर FTICR विश्लेषक के साथ हासिल किया गया.
5. पेप्टाइड अनुक्रम पहचान डेटाबेस मिलान के द्वारा किया जाता है और डे Novo की अनुक्रमण विश्लेषण से पूरित किया जा सकता है. डेटाबेस खोज के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध खोज इंजन (शुभंकर XTandem, या प्रोटीन पूर्वेक्षक) के ²⁰ कार्यरत हैं. खोजों आम तौर पर जाना जाता है या भविष्यवाणी neuropeptides और neuropeptide में अग्रदूत ²¹ प्रोटीन के दृश्यों के दृश्यों से युक्त डेटाबेस के खिलाफ प्रदर्शन कर रहे हैं.

6. प्रतिनिधि परिणाम

Striatal ऊतक वर्गों की MALDI इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री के रूप में यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल 1000 से अधिक चोटियों के लगभग 300 monoisotopic आणविक प्रजातियों (औसत स्पेक्ट्रा दिखाया इसी का पता लगाने के परिणामस्वरूप के अनुसार तैयारछवि में. ) 1. प्रमुख आणविक आयन चोटियों के लिए डेटा दृश्य फ्लेक्स इमेजिंग सॉफ्टवेयर का प्रयोग कर प्राप्त किया गया था और विशेषता शिखर तीव्रता वितरण कि संरचनात्मक विशेषताएं (Fig.3) के साथ लाइन में अच्छी तरह से कर रहे हैं दिखाया. MALDI आईएमएस की एक और विशेषता इसकी सापेक्ष अच्छा reproducibility के है. इस प्रयोग में, सभी का पता चला आणविक प्रजातियों की चरम तीव्रता के लिए विचरण के समग्र गुणांक 30% थी, लेकिन कई चोटियों बहुत कम भिन्नता और उपचार समूहों के भीतर उच्च reproducibility छवि (4) का प्रदर्शन किया. हित के चार अलग अलग क्षेत्रों दोनों lesioned और अक्षुण्ण striata के dorsolateral और dorsomedial हिस्सा सहित के सापेक्ष शिखर तीव्रता डेटा सांख्यिकीय विश्लेषण के अधीन थे. क्रम में कई एक साथ तुलना के लिए समायोजित करने के लिए, सांख्यिकीय विश्लेषण nonparametric परीक्षण सैम ¹⁸ उपकरण का उपयोग कर के माध्यम से किया गया था. सबसे प्रमुख परिवर्तन dopamine का किसी तंत्रिका को काटकर निकाल देना अथवा तंत्रिका पूर्ति में रुकावट पैदा करना, Parkinsonian striatum dorsolateral भाग में पाया गया. यहाँ सी dynorphin बी और अल्फा neoendorphin पर (Fig.5) के, अलग उपचार समूहों के बीच में gnificant परिवर्तन दो dynorphin पेप्टाइड्स के लिए मनाया गया. विस्तार में, 50-60% द्वारा दोनों dynorphin शिखर तीव्रता के रिश्तेदार वृद्धि उच्च dyskinetic पशुओं में कम dyskinetic जानवरों और घाव नियंत्रण (की तुलना में मनाया गया पी <0.05, एफ (2, 15) = 12.8 DynB, एफ = 5.7 aNeo; चित्र 5)

चित्रा 1 औसत एमएस striatum के दो निकट से संबंधित क्षेत्रों से प्राप्त निशान, पूंछवाला putamen (सीपीयू) और नाभिक accumbens (एनएसी). दोनों क्षेत्रों के कुछ आणविक प्रजातियों के साथ एक क्षेत्र में विशिष्ट व्यक्त अलग एमएस प्रोफाइल के प्रदर्शित करते हैं, या अलग शिखर तीव्रता के स्तर पर (डालने मी / z 2028). प्रत्येक चोटी के स्थानिक वितरण पैटर्न विशेष इमेजिंग सॉफ्टवेयर (नीचे पैनल) का उपयोग करते हुए कल्पना किया जा सकता है.

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चित्रा 2 (ए) मस्तिष्क एक cryostat एम्बेडिंग मीडिया (ओटीसी; तीर) का उपयोग चक पर मुहिम शुरू की है., ध्यान रखा जाता है कि ओटीसी ओटीसी कारण आयन पेप्टाइड्स के दमन के बाद से sectioned मस्तिष्क के क्षेत्र को दूषित नहीं करता है. (बी, सी) पतली वर्गों (≈ 12 माइक्रोन मोटाई) MALDI संगत गिलास स्लाइड पर पिघलना घुड़सवार और एक कुछ सेकंड के लिए सूखे फ्रीज क्षति से बचने के रूप में सी. Microtears (डी) में देखा जाता है मुश्किल हो सकता है के लिए नग्न आंखों के लिए पता लगाने सकता है , लेकिन MALDI मैट्रिक्स crystallization के ख़राब और MALDI एमएस संकेत काटना. वही cresyl बैंगनी दाग ​​अनुभाग microtears और दरारें (नीचे सही सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़) से पता चलता है.

चित्रा 3. डेटा मूल्यांकन में पहला कदम जन (ऐ) विश्लेषण रेंज भर में कई अलग अलग चोटियों कल्पना है. यहाँ, 9 चूहों से striatal वर्गों MALDI एमएस के साथ imaged थे. मैं औसत कुल का विज़ुअलाइज़ेशनवर्तमान पर विशिष्ट उच्च या कम आयन तीव्रता (तीर) के क्षेत्रों में प्रकट होगा. इन क्षेत्रों में खत्म हो या सामान्य के तहत प्रभाव बिगाड़ना और डेटा विश्लेषण का समझौता परिणाम से प्रभावित किया जा सकता है. आम तौर पर कम संकेत करने वाली शोर के साथ शिखर पीक वितरण के गरीब शारीरिक परिभाषा वर्गों से पता चलता है, वर्गों 3 और 9 उदाहरण के लिए, मैं के माध्यम से चोटियों एफ

चित्रा 4. उपचार समूहों के बीच एमएस reproducibility के औसत एमएस का पता लगाने और प्रत्येक मान मी / z (आवेषण, m / z 722 और 1749) के लिए मानक त्रुटि की गणना के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. अच्छा reproducibility के वैध सांख्यिकीय विश्लेषण सुनिश्चित करता है.

5 चित्रा. Dynorphin बी और अल्फा neoendorphin शिखर तीव्रता काफी 6 OHDA में बढ़ रहे हैं- Lesioned, Parkinsonian, उच्च dyskinetic जानवरों की striatum (एच.डी., तीर) (LD) कम dyskinetic और घाव नियंत्रण समूह (नियंत्रण रेखा) की तुलना में. पेप्टाइड शिखर तीव्रता औसत बरकरार पक्ष के गुना परिवर्तन ± SEM (पक्ष / बरकरार घाव) के रूप में व्यक्त की है. * पी <0.05, cx प्रांतस्था, सीसी महासंयोजिका. स्केल बार 5 मिमी.

Discussion

वहाँ, neuropeptides के अध्ययन में MALDI इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री रोजगार के कई फायदे हैं. एमएस डेटा की एक निष्पक्ष विश्लेषण है कि केवल विशिष्ट मस्तिष्क नाभिक प्रकट कर सकते हैं, या के रूप में यहाँ प्रस्तुत है जहां केवल striatum की dorsolateral भाग एक निश्चित pathophysiological हालत के साथ जुड़ा हुआ है परिणामों में. स्थानिक जानकारी बनाए रखने के द्वारा यह तो संभव है हित के क्षेत्रों को फिर से परिभाषित करने के लिए उच्च संवेदनशीलता और पूरे मस्तिष्क वर्गों के विश्लेषण या पेप्टाइड अर्क पर परंपरागत peptidomics के अध्ययन का उपयोग के साथ तुलना में कम परिवर्तनशीलता के साथ सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन. इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है एहसास MALDI आईएमएस आसानी से पहले से अज्ञात बाद translational संशोधनों का पता लगा सकते हैं, लेकिन संरचनात्मक विश्लेषण सही एमिनो एसिड की स्थिति है कि संशोधित कर रहे हैं निर्धारित करने का पालन करना चाहिए.

MALDI आईएमएस डेटा visualizing में आम नुकसान बीएल से एक रेखीय ऑप्टिकल पैमाने पर अधिकतम चोटी तीव्रता के मानचित्रण शामिलack प्रयोगात्मक श्रृंखला में प्रत्येक और हर खंड (चित्रा 3) के बजाय एक आम पूर्ण पैमाने पर करने के लिए सभी वर्गों के मानचित्रण जहां 100% सभी वर्गों के अधिकतम चोटी तीव्रता, के लिए रंग (100%) के लिए (0%) (चित्रा 5) . उत्तरार्द्ध विधि समूह डेटा और उपचार समूहों के बीच मतभेद के दृश्य की तुलना की अनुमति देता है.

MALDI आईएमएस विश्लेषण में एक प्रमुख बाधा विशिष्ट जन चोटियों के लिए पेप्टाइड्स के काम है. ऊतक पर अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री कभी कभी संभव है, लेकिन अक्सर काफी ^13,14 मुश्किल साबित होता है. हम पाते हैं कि एक और अधिक परंपरागत दृष्टिकोण मजबूत कटियन विनिमय क्रोमैटोग्राफी, उलट चरण LC-MS/MS द्वारा पीछा किया पर एक प्रारंभिक विभाजन सहित सफलतापूर्वक अनुक्रम कई neuropeptides की और विशेष रूप से opioid पेप्टाइड्स के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह अभी भी अच्छी गुणवत्ता स्पेक्ट्रा एमएस / एमएस है कि किसी भी डेटाबेस शुभंकर के रूप में सामान्य खोज इंजन का उपयोग प्रविष्टियों मेल नहीं खाते प्राप्त करने के लिए असामान्य नहीं है. इन मामलों में हाथ से नोवो अनुक्रमण onl हैy के विकल्प. शिखर पहचान के अंतिम सबूत उपयुक्त पीटकर माउस से ऊतक वर्गों की MALDI आईएमएस द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन यह हमेशा उपलब्ध है या संभव नहीं है. एक विकल्प के पश्चिमी immunoblotting या immunohistochemistry द्वारा उदाहरण के लिए एक बिलकुल अलग विधि द्वारा परिणाम मान्य है. इस बार एंटीबॉडी और काम का एक महत्वपूर्ण राशि नए एंटीबॉडी मान्य करने की परवरिश शामिल कर सकते हैं.

सामान्य इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत रणनीति बड़े पैमाने पर neuropeptide MALDI आईएमएस सहित कई वर्गों और प्रयोगात्मक शर्तों के प्रयोगों के लिए अनुकूलित है. प्रोटोकॉल opioid पेप्टाइड्स के लिए विशेष रूप से अनुकूलित किया गया और भविष्य के अध्ययन में बड़ा असर पड़ेगा, के रूप में दर्द अंतर्निहित तंत्र और दवाओं की लत के अंतर्जात प्रतिक्रिया सहित अनुसंधान के विविध क्षेत्रों में कार्यरत हैं.