Kvantitative og Automatiseret High-throughput genom-dækkende RNAi skærme i C. elegans</em

Summary

Vi beskriver en protokol med<em> C. elegans</em> Og RNAi fodring biblioteker, der tillader automatisk måling af flere parametre, såsom fluorescens, størrelse og opacitet af individuelle orme i en population. Vi giver et eksempel på et skærmbillede til at identificere gener involveret i anti-fungal medfødte immunitet<em> C. elegans</em>.

Abstract

RNA-interferens er en kraftfuld fremgangsmåde til at forstå genfunktion, især når den udføres ved en hel-genom skala og i en kvantitativ sammenhæng. I C. elegans kan genfunktion slås ned enkelt og effektivt ved tilførsel orme med bakterier, der udtrykker en dsRNA svarende til et specifikt gen ^1. Mens oprettelsen af biblioteker af RNAi kloner dækker det meste af C. elegans genomet ^2,3 åbnede vejen for ægte funktionelle genomiske studier (se for eksempel ^4-7), de fleste etablerede metoder er besværlige. Moy og kolleger har udviklet halvautomatiske protokoller, der letter genom-dækkende skærme ^8. Den tilgang er baseret på mikroskopisk billedbehandling og billedanalyse.

Her beskriver vi en alternativ protokol for en høj-throughput genom-wide screen, baseret på robothåndtering af bakteriel RNAi kloner, kvantitativ analyse ved hjælp af Copas Biosort (Union Biometrica (UBI)), og enintegreret software: MBioLIMS (Laboratory Information Management System fra Modul-Bio), en teknologi, der giver øget gennemløb for datahåndtering og prøve sporing. Fremgangsmåden tillader skærme, der skal udføres på fast medium-plader. Dette er især vigtigt for visse undersøgelser, såsom dem der vedrører værtspatogene interaktioner i C. elegans, eftersom visse mikrober ikke effektivt at inficere orme i flydende kultur.

Vi viser, hvordan fremgangsmåden kan anvendes til at kvantificere betydningen af gener i anti-fungal medfødte immunitet C. elegans. I dette tilfælde afhænger den fremgangsmåde til anvendelse af en transgen stamme, som bærer en epidermal infektion-inducerbare fluorescerende reporter-gen, med GFP under kontrol af promotoren for det antimikrobielle peptid genet NLP 29 og et rødt fluorescerende reporter, som udtrykkes konstitutivt i epidermis. Sidstnævnte tilvejebringer en intern kontrol for den funktionelle integritet af epidermisog uspecifik transgen lyddæmpende ^9. Når kontrol orme er inficeret af svampen, de fluorescerer grønt. Vælte ved RNAi et gen påkrævet til NLP 29 ekspression resulterer i formindsket fluorescens efter infektion. Dag, denne protokol tillader mere end 3000 RNAi kloner, der skal testes, og analyseres ugen, hvilket åbner mulighed for screening af hele genomet i mindre end 2 måneder.

Protocol

Den protokol, som beskrevet nedenfor er opdelt i trin på fem på hinanden følgende dage (fig. 1). Som bemærket, kan visse trin udføres på forskellige dage. Varigheden af ​​hvert trin, såvel som mængden af ​​materiale (f.eks orme, bakterier, medier) vil afhænge af antallet af plader med 96 brønde blev behandlet for hvert forsøg. Dag 1 1. Fremstilling af 96-brønds NGM RNAi plader Følgende protokol er tilpasset fra den standard fremgangsmåde til fremstilling af endeløse dyrkningsplader 10, som omfatter oplysninger om steriliseringsteknikker for de forskellige opløsninger. 10-12 96-brønds plader, fremstilling af 100 ml nematodevækst medier (NGM) i deioniseret H2O: 1,7 g bactoagar, 0,29 g NaCI, 0,25 g pepton, 100 pi cholesterol (5 mg / ml i EtOH). Autoklaven NGM (5 minutter ved 121 ° C i 100 ml, 30 min ved 121 ° C i 4 L) og lad den afkøle, indtil den er ved ca 50 ° C (kun afkøles enouh at holde). Det er vigtigt, at NGM forbliver varm nok, således at det ikke størkner. Tilsættes til 100 ml: 2,5 ml phosphatpuffer pH 6 (1M), 100 gl MgSO4 (1M), 100 gl CaCl2 (1 M), 400 uL IPTG (1 M), 100 gl ampicillin (100 mg / ml), 100 gl tetracyclin (12,5 mg / ml i EtOH). Fordel 75 pi NGM til hver brønd af en 96-brønds fladbundede plader. For at undgå størkning af mediet, det skal afgives hurtigt, er det bekvemt at anvende en repetitiv dispenser (f.eks Repeatman, Eppendorf). Være sikker på, at der ikke er nogen luftbobler til stede i brøndene. Lagre plader umiddelbart i et fugtigt kammer (f.eks Tupperware kasse med våde papirhåndklæder nederst) ved 4 ° C. Bemærk: plader kan fremstilles op til en uge i forvejen og opbevares ved 4 ° C, hvilket kan gøre organiseringen af ​​de efterfølgende trin lettere. 2. Automatiseret fremstilling af 96-DeepWell LB-plader <li> forberede og 1,5 ml LB indeholdende ampicillin 100μg/mL og tetracyclin 12,5 ug / ml til hver brønd i en 96-DeepWell plade, som har en maksimal kapacitet på 2 ml / brønd. Fordelingen er optimeret under anvendelse af en robot væskehåndteringssystem (f.eks TECAN), men kan også udføres manuelt, hvis nødvendigt. Tilsættes et dæksel til hver plade, og opbevar ved 4 ° C. For at spore hver 96-brønds plade, bør et unikt mærke eller stregkode tilsættes på dette tidspunkt eller derefter. Bemærk: plader kan fremstilles 2 til 3 dage i forvejen og opbevares ved 4 ° C, hvilket kan gøre organiseringen af ​​de efterfølgende trin lettere. 3. Dyrke RNAi bakterielle kloner på 96 DeepWell LB-plader (overnatskultur) For efterfølgende at lette håndtering, når de originale RNAi bibliotek kloner er i en 384-brønds format første omfordele klonerne i mærket eller stregkode standard 96-brønds plader indeholdende LB med 100 ug / ml amp og 12,5 ug / ml Tet suppleret med glycerol (10% slutkoncentration). Når de oprindelige 384-brøndsplader ikke kloner i alle brønde, som det er tilfældet for de mest almindeligt anvendte "Ahringer" bibliotek, er der flere muligheder for at organisere datter pladerne. Kloner kan igen fordelt således, at der ikke er tomme brønde i datterceller pladerne. Dette minimerer antallet af plader til screening. Ideelt imidlertid under replikation, bør nogle brønde på hver datter plade efterlades tomme, således at de efterfølgende kan fyldes med standard kontrol kloner (positive og negative), der fremmer tværgående plade sammenligninger. Disse 96-brønds datterceller Pladerne blev derefter anvendt til podning af 96-DeepWell LB-plader i en natten over (ON) kultur. Alle flydende håndteringstrin er bedst med en robot væskehåndteringssystem (f.eks Tecan), men kan udføres manuelt ved hjælp af for eksempel. En 96-pin replicator Hvis RNAi bibliotek kloner er allerede i en 96-brønds format gå til trin 3.5. <ol start = "2"> Inkubér 96-brønds RNAi datterceller pladerne ved 37 ° C med omrøring (200 rpm) i 14-15 timer. Kontroller, at bakterierne voksede korrekt og identificere kloner, der ikke vokser. Disse vil blive udelukket fra senere analyser. Ideelt er OD600 målt i hver brønd, men dette kan ske ved simpel inspektion. Lagre 96-brønds RNAi datterceller plader ved -80 ° C før brug. Optø 96-brønds plader indeholdende RNAi kloner ved stuetemperatur. Pladerne kan derefter opbevares ved 4 ° C indtil anvendelse. Fordel 3 uL af hver bakterielle klon fra en 96-brønds replikere plade til de 96 brønde i den tilsvarende mærkede / stregkodede 96 DeepWell LB-plade indeholdende 1,5 ml LB med 100 ug / ml amp og 12,5 ug / ml Tet. Bakterielle kloner til at kontrollere RNAi effektivitet, såsom et GFP (RNAi) klon i det foreliggende eksempel, og negative kontroller, kan inkorporeres manuelt i alle tilgængelige tomme brønd. Dæk 96-DeepWell psidste udkald med en klæbende film (f.eks AeraSeal cellulære kultur film fra Dutscher). Erstatte den anvendte 96-brønds replikat plade ved -80 ° C. De 96-DeepWell mærkede Pladerne inkuberes derefter ON ved 37 ° C med omrøring (200 rpm i 14-15 timer). Dag 2 4. Frø RNAI bakteriekloner på de 96 brønde NGM RNAi plader Dette trin bør ske om morgenen efter på kultur. Tage 96-brønds NGM plader fra 4 ° C og lade dem varme op og tørres i 5-15 minutter under en steril laminar strømning. Efterlad ikke pladerne for længe under kølerhjelmen (maks. 30 min), som ellers NGM efterfølgende kan knække. Tilsættes en passende etiket / stregkode til hver plade. Hent den 96-DeepWell ON kultur plader fra 37 ° C. Optag positionerne af eventuelle tomme brønde (en tom brønd er helt gennemsigtig); disse vil blive udelukket fra efterfølgende analyser. Centrifugeres 96-DeepWell plader 5 min ved 4000 rpm. Spidsen af ​​supernatanten ved at dreje pladen kraftigt op og ned og tør kanterne af pladen hurtigt på en papirserviet. Da kulturerne er af rekombinante bakterier, supernatanten skal behandles i overensstemmelse med gældende regler autoklaveret). Resuspender den bakterielle pellet i den tilbageværende væske (ca. 50 uL) ved hvirvelbehandling, ideelt ved hjælp af en dedikeret omrører (f.eks Tecan), således at hver plade modtager nøjagtigt den samme behandling. Det er muligt at måle OD600 for hver brønd for at standardisere nøjagtigt det bakterielle inokulum til det efterfølgende trin, men dette er ikke nødvendig, og vi har ikke udfører en sådan kontrol. Overfør 5 pi af de resuspenderede bakterierne på de 96 brønde NGM plader under anvendelse af en 8 eller 12-kanals Multi-pipette. Vær forsigtig med ikke at røre eller trænge ind i NGM. Dette trin udføres manuelt, men kan optimeres ved anvendelse af en robot, såsom Liquidator96 (Rainin), der tilladerFordelingen af ​​96 RNAi kloner i én arbejdsgang. Lade bakterierne tørre under en steril laminar strømning, kontrol regelmæssigt for at undgå NGM bliver for tør. Dette trin tager ca 2 timer. Inkubér 96-brønds RNAi-NGM plader ved 37 ° C på et fugtigt kammer. 5. Fremstilling af en synkroniseret population af orme Til dette trin, bruger vi transgene orme bærer reportergenet (r) af interesse (f.eks en infektion-inducerbar p NLP-29 :: GFP konstruktion, og som en intern kontrol, konstruere en konstitutiv p samar-12 :: dsRed transgen) . På grund af den observerede nedgang i transgen ekspression med tiden, tø vi friske batcher af orme hver 6. uge. Vi kultur orme i mindst 2 generationer før brug, og sikre, at de orme aldrig har sultet før analysen. Hvis dag 2 i protokollen er tirsdag, udarbejder vi orme på fredag ​​ved at placere 30 unge voksne orme på en 9 cm NGM plade spredes med OP50 bakterierved 20 ° C, de vil være klar til at blegemiddel tirsdag (se tabel 1). Bleach orme efter standard-protokollen 10. Lod udklækkes i M9 ved 25 ° C ON under omrøring for at få en synkroniseret population af L1 larver. Dag 3 6. Fordel ormene på de 96-såvel RNAi-NGM plader til fodring og RNAi Dette trin bør ske om morgenen. L1 fase synkroniserede orme er fordelt på hver 96-brønds bakterielle klon for fodring og RNAi. Hente 96-brønds RNAi-NGM plader fra 37 ° C og henstår ved stuetemperatur for at køle ned. Hent de blegede orme fra 25 ° C. Estimere antallet af orme pr 2 uL og juster med M9 at have omkring 100-120 orme pr 2 pi (omkring en enkelt dråbe). Fordel manuelt 2 pl L1-trins orme i hver brønd ved hjælp af en gentagen dispenser. Kontroller hver brønd for orm (du bør se orme svømme i væske). Lad pladerne tørre under en steril laminar strømning (maksimalt 1 time). Kontroller pladerne regelmæssigt, ormene skal kravle og ikke svømme. Vær forsigtig, må NGM ikke tørre for meget, ellers vil det sprække. Placere pladerne ved 25 ° C i et fugtigt kammer. 7. Afprøve Drechmeria coniospora sporerne for effektiv infektion Dette trin er specifik for den foreliggende skærmen. Den består i at teste forskellige partier af sporer til at vælge højt infektiøse dem. Derfor bør det ske så tæt som muligt før dag 4, dagen for infektion. Det er nødvendigt at forberede tilstrækkelig L3-L4 orme i forvejen for disse tests (tabel 1). De detaljerede metoder kræves til D. coniospora kultur er blevet beskrevet andetsteds 11. <ol> Indsamle sporer fra en prøve af hver fungal kultur i et lille volumen M9. Placer en dråbe af hver sporesuspensionen på en 35 mm NGM plade tilsået med OP50, og lad det tørre. Tilsættes 30-40 L3-L4 orme bærer reporter genet af interesse (f.eks p nlp-29 :: GFP). Anbring de inficerede pladerne ved 25 ° C ON. Næste dag, se ormene for GFP induktion og vælge det parti, svamp, der giver den klareste, bredeste og mest homogene induktion af grøn fluorescens. Dag 4 8. Inficere RNAi udsat orme med D. coniospora sporer Dette trin udføres 30 timer efter RNAi fodring når orme har nået L3-L4 fase. Bestemme mængden af ​​sporer at bruge til at distribuere 4 pi per brønd. Saml frisk D. coniospora sporer fra den valgte batch med M9 buffer. Anvendelse 8-10 ml M9 til en 9 cm plade af sporer. <li> Fordel 4 pi af sporer i hver brønd med en repetitiv dispenser. Kontroller hver brønd for sporer (du kan se orme svømme i væske). Lad pladerne tørre under en steril laminar strømning (~ 1 time). Kontroller pladerne jævnligt, indtil de orme begynder at kravle. Vær forsigtig, må NGM ikke tørre for meget, ellers vil det sprække. Anbring de inficerede pladerne ved 25 ° C i et fugtigt kammer. Dag 5 9. Observation og opbevaring af pladerne før automatiseret kvantitativ analyse Dette trin starter 18 timer efter infektion og er udført i løbet af dagen 5. Orme forventes at være unge voksne begynder at lægge æg. Under dette trin fænotype bedømt visuelt: enten orme fluorescerer grønt, som svarer til en normal situation efter infektion, eller til induktion af GFP ændres i en given brønd, hvilket betyder, at de tavse gener ændrer reaktion på infektion. <li> hurtigt observere pladerne under fluorescens dissektionsmikroskop. Hvis pladerne vise en god almen GFP induktion derefter gå videre til næste trin, ellers vente til om eftermiddagen for en bedre induktion, så længe der stadig er mad tilbage til ormene. Visuelt scorer hver plade, og bemærk alle godt med en markant fænotype (f.eks ikke udtryk for GFP). Ved at kontrollere for de opnåede resultater med de kontrolsystemer RNAi kloner, der eventuelt er blevet tilsat, giver denne første foreløbige analyse en indikation af, om forsøget har været en succes. Ved anvendelse af en 8 eller 12-kanals pipette Multi overførsel ormene med 100 pi NaCl 50 mM, Triton 0,05%, til en ny tilsvarende mærket / stregkodede 96-brønds rundbundet plade. Fryse pladerne ved -80 ° C indtil analyse. På dagen for analysen tø pladerne ved stuetemperatur og videre til den automatiserede analyse under anvendelse af Copas Biosort. Sorteringsenheden analyserer en enkelt plade i 22 minutter. Pladerne bør ikke værehenstod ved stuetemperatur i mere end en time før analysen, og de kan ikke nedfryses igen. Oplysningerne fra den Copas Biosort transskriberes til en Excel-fil for overfladisk kontrol af oplysningernes kvalitet. De rå data med forskellige parametre målt ved Copas Biosort (optisk densitet (ekstinktion), aksiale længde (time of flight), fluorescens-emissioner, samtidigt ved tre forskellige detektorer) lagres derefter i en dedikeret LIMS pakke (MBio LIMS, Modul- Bio) for efterfølgende detaljerede kvantitative analyser. 10. Repræsentative resultater Ved hjælp af mængden af ​​orme og bakterier er givet ovenfor, ved afslutningen af ​​eksperimentet, i de fleste brønde, skal dyrene har alle udviklet til voksen, og der bør stadig være mad tilbage i alle brønde. Under disse betingelser, bør de fleste brønde også indeholde æg. Der bør være et tilstrækkeligt antal voksne i hver brønd, så Biosort data opnås feller mindst 50 individuelle orme. På den anden side, hvis den RNAi er effektivt vil et stort antal af RNAI kloner fremkalder en synlig fænotype. For eksempel kan orme være ukoordineret, eller mere åbenlyst, steril, eller arresteret i deres udvikling. Dette skulle ske ofte, så der almindeligvis mindst én brønd per 96-brønds plade indeholder orme med en tydelig RNAi fænotype. Når fænotypen af interesse er ekspressionen af et GFP reporter gen, brønde med en GFP (RNAi) klon tilvejebringe en robust kontrol (fig. 2). Andre fænotyper, såsom en ændring af størrelse kan let måles med Biosort (fig. 3A). Vi bemærkede, at ormene kunne migrere til tilstødende brønde med meget lav frekvens (<1%, BS, upublicerede resultater), når fødevaren i en brønd blev opbrugt. Vælte funktionen af de forskellige klasser af gener kan påvirke transgener ekspression i C. elegans. Nogle er ikke specifikt kræves for transgener udtryk 12. Andre, såsomsom vævs-specifikke transkriptionsfaktorer, den epidermale GATA faktor ELT-3 13, for eksempel vil være påkrævet i bestemte delmængder af celler. Dette er en af grundene til optagelsen af en ikke-relateret og konstitutiv epidermale celler transgen reporter konstruktion (p Col-12 :: dsRed) i den stamme, der anvendes til den gældende protokol. Dette tillader sådanne gener kan skelnes fra dem, der specifikt er involveret i genregulatorisk proces under undersøgelse (fig. 3B og C). Dette transgen udtrykkes i alle larvestadier. Hvis et assay involverer påvisning af genekspression i embryoer en anden kontrol-reportergen ville være påkrævet. En af nyskabelserne i denne protokol er brugen af ​​fryse plader til at udskyde deres analyse. Frysning tillader pladerne, der skal opbevares i op til to uger uden væsentligt at ændre resultatet. Selv de absolutte værdier af målte fluorescens kan ændres, deres relative forhold forbliver ens (fig. 4). På OThendes hånd, RNAi er i sig selv en variabel eksperimentel procedure 14. For at opnå pålidelige resultater og eliminere de mange potentielle falske positiver, RNAi skærme skal replikeres, mindst én gang. Hvis forsøgene med held udføres, bør der være en rimelig korrelation mellem resultaterne fra en plade testet på forskellige dage. Især bør de gener, der har en stærk virkning kunne klart identificeres, selvom den præcise kvantitative virkning ikke er identisk mellem duplikatplader (fig. 5). Figur 1. Samlet ordning for et typisk eksperiment. Figur 2. Kontrol RNAi anvendelse af en klon målretning GFP-ekspression. Transgene orme expressing konstitutivt ap kol-12 :: dsRed reporteren og en inducerbar p NLP 29 :: GFP reporter på fast medium i en 96-brønds plade visualiseret under anvendelse af en GFP dissektionsmikroskop med et filtersæt, som tillader samtidig overvågning af rød og grøn fluorescens. Orme blev udsat for kontrol (øvre panel) eller en GFP RNAi klon (nederste paneler) i 48 timer. Panelerne til venstre er inficerede orme, dem på de rigtige orme 18 timer efter infektion med D. coniospora. Målestokken er 1 mm. Figur 3. Kvantitativ analyse af en 96-brønds plade. Den Copas Biosort genererer numeriske data for hver orm analyseret. Graferne viser gennemsnitlige og standardafvigelse for flyvetid (TOF; A), som svarer til størrelsen af orme 15, rød fluorescens (B) og forholdet (X100) af grøn fluorescens TOF (C) af transgen WOrms udtrykker konstitutivt ca kol-12 :: dsRed reporteren og en inducerbar p NLP 29 :: GFP reporter, som var blevet dyrket på fast medium i en 96-brønds plade med forskellige RNAi kloner i 48 timer, 18 timer efter infektion med D. coniospora. Visse kloner, som den fremhævet med pilen i (A), fremkalder vækstdefekter ogleller påvirke ekspressionen af p kol-12 :: dsRed. Andre, specielt påvirker GFP udtryk, som fremhævet af pilen i (C). Denne særlige klon rettet genet nsy 1, som tidligere vist sig at være vigtig for reguleringen af NLP 29 13. Grøn, rød fluorescens og TOF er målt i arbitrære, men konstant enheder. Figur 4. CompArison af data opnået med levende og frosne prøver fra samme eksperiment. Plader af L4 orme bærer p NLP-29 :: GFP og p Col-12 :: dsRed transgener blev enten inficeret med D. coniospora eller ej. Efter 18 timer blev hver plade groft inddeles i to; halvdel blev analyseret øjeblikkeligt og halv frosset ved -80 ° C i 24 timer, før optøning og analyse. Værdierne for gennemsnitlig TOF (størrelse af orme), EXT (optisk densitet) og grøn og rød fluorescens blev beregnet for hver prøve. Grafen viser forholdet mellem den gennemsnitlige for inficerede divideret med ikke-inficerede prøver for de frosne og levende prøver (n = 7638 og 5096, og 8634 og 3850 orme, henholdsvis). Figur 5. Sammenlignende analyse af dubletter 96-brønds plader. Den normaliserede fluorescens ratio (middelfluorescens forholdet (her, 100 * grøn / TOF) for hver brønd divideret medDen trimmede (25. til 75. percentil) betyder for hver plade) for hver brønd i to analyser af en repræsentativ 96-brønds plade. Materiale Eksperimentel Tidslinje IPTG: ~ 1,4 ml Ampicillin: ~ 5 ml Tetracyclin: ~ 5 ml LB: 5 L 96-brønds flade plader: 30 til NGM 96-huls runde plader: 30 til frysning (analyse) 96-DeepWell plader: 30 for på kultur kultur film: 30 Tips kasse: 30 for bakterier såning 9 cm OP50 plader: ~ 17 Worms: 1 frisk optøet cyrovial per måned Sporer: ~ 2 plader NaCl 50 mM + Triton 0,05%: ~ 300 ml Torsdag Klargør NGM RNAi 96-brønds plader (~ 1H + autoklaven) Fredag Fremstilling af de 96-DeepWell LB-plader (~ 4H) Forbered orme (14 plader med 30 unge voksne orm ved 20 ° C + 1 plade ved 25 ° C) Mandag Overførsel orme fra pladen ved 25 ° C på ny plade Distribuere bakterier i LB-plader (~ 7H) På kultur kl 18:00 Tirsdag Fordel bakterier på NGM plader i morgen (~ 3h+ ~~~HEAD=NNS 2h tørring) Bleach orme fra plader ved 20 ° C Onsdag Fordel orme på 10 am (~ 1 time + ~~~HEAD=NNS 1h tørring) Test sporer med orme fra pladen ved 25 ° C Torsdag Infect orme ved 3:00 (~ 1 time + ~~~HEAD=NNS 1h tørring) Fredag Overførsel nye 96-brønds plader + fryse (~ 2 timer) Tabel 1. Eksempel på en cyklus eksperiment med 30 plader. Her præsenteres materialet er nødvendig for en en-cyklus eksperiment 30 plader og en tidsplan for et eksperiment fra trin 1 til trin 12 organiseret på 9 dage. Nematodevækst medier (NGM), 100 ml: 0.3 g NaCl 0,25 g Bactopepton 2 g Bactoagar 100 pi 5 mg / ml cholesterol i EtOH Tilsættes deioniseret vand til 100 ml Autoklav i 5 minutter ved 121 ° C og lad afkøle, hvorefter der tilsættes: 100 pi 1 M MgSO4 100 pi 1 M CaCl2 2,5 ml 1 M KPO 4 pH 6,0 NGM til RNAi behandling i 96-brønds plade, 100 ml: 0,29 g NaCl 0,25 g Bactopepton 1,7 g Bactoagar 100 pi 5 mg / ml cholesterol i EtOH Tilføj de ioniseret vand til 100 ml Autoklav i 5 minutter ved 121 ° C og lad afkøle, hvorefter der tilsættes: 100 pi 1 M MgSO4 100 pi 1 M CaCl2 2,5 ml 1 M KPO 4 pH 6,0 400 uL 1 M IPTG 100 pi 100 mg / ml ampicillin 100 pi 12,5 mg / ml tetracyklin Blegeopløsning, 5mL: 2,5 mL H2O 2,3 ml Blegemiddel 0,2 ml NaOH 50% NaOH 50%, 100 ml: 50 g NaOH Tilsættes deioniseret vand til 100 ml NaCl 50 mM, Triton 0,05%, 400 ml: 4 ml NaCl 5 M 1 ml Triton 20% Tilsættes deioniseret vand til 400 ml TEP "> Triton 20%, 10 ml: 2 ml Triton X-100 8 ml deioniseret vand M9-puffer, 1L 6 g Na2HPO 4 (MW: 178) 3 g KH 2PO 4 (MW: 136) 5 g NaCl Tilsættes deioniseret vand til 1 L Autoklaver Tilsæt 1 ml magnesiumsulfat 4 1 M Luria Broth (LB), 1L: 10 g bactotrypton 20 g gærekstrakt 10 g NaCl Tilsættes deioniseret vand til 1 L Autoklaver 1 M MgSO4, 300 ml: 73,95 g MgSO4 Tilsættes deioniseret vand til 300 ml Autoklave og opbevares ved stuetemperatur 5 mg / ml cholesterol, 200 ml: 1 g cholesterol Tilsæt 100% EtOH til 200 ml Filtrer steriliseres og opbevares ved stuetemperatur 1 M CaCl2, 500 ml: 27.75 g CaCl2 Tilsættes deioniseret vand til 500 ml Filtrer steriliseres og opbevares ved stuetemperatur 1 M KPO 4 pH 6,0, 4 L: 517 g KH 2PO 4 (MW: 136) 207 g K 2 HPO 4 (MW: 174) Tilsættes deioniseret vand til 4 L 100 mg / ml ampicillin (Amp), 10 ml: 1 g ampicillin Tilsættes deioniseret vand til 10 ml Opbevar ved -20 ° C 1 M Isopropyl β-D-thiogalactopyranosid (IPTG), 10 ml: 2,38 g IPTG Tilsættes deioniseret vand til 10 ml Opbevar ved -20 ° C 12,5 mg / ml tetracyklin, 100 ml 1,25 g tetracyclin Tilsæt 100% EtOH til 100 ml Tabel 2. Solutions.

Discussion

<p class="jove_content"> Den nuværende protokol giver mulighed for i stor skala RNAi screening i<em> C. elegans</em> På faste medier ved hjælp af niveauet af ekspression af en fluorescerende reporter gen som en udlæsning. Det er blevet optimeret med automatiserede værktøjer til at lette high-throughput assays, som muliggør nem og hurtig håndtering af et stort antal prøver i en effektiv, pålidelig og reproducerbar måde. Andre fremgangsmåder er blevet beskrevet som ikke er afhængige så stærkt på automatiseret væskeprøven håndtering⁸.</p><p class="jove_content"> Et centralt organisatoriske aspekt protokollen har været udviklingen af ​​en robust metode til at prøve sporing ved at tilpasse den kommercielle MBioLIMS software til RNAi skærmen procedure i samarbejde med virksomheden ModulBio. På hvert trin i proceduren, er plader nu identificeret ved stregkoder genereres i lims. Som lims også registrerer identiteten af ​​klonerne i hver brønd på hver plade, der går fra brønd til putative gen er enkel. Og ud over dette, så lims links til samfundet databasen WormBase, direkte adgang til molekylære og funktionelle data om en given gen. Det lims letter også analyser skal udføres på pladen eller endda kromosom og hel-genom niveau. For disse analyser, bliver lagret på en måde, der er fuldt kompatible med tidligere beskrevne værktøjer såsom COPAmulti¹⁶.</p><p class="jove_content"> Et kritisk eksperimentelt punkt i fremgangsmåden er justering af mængden af ​​fødevarer i forhold til det antal orme. For mange assays, er det vigtigt, at ormene ikke sulte ved afslutningen af ​​forsøget, men det er også vigtigt ikke at have for meget mad ved starten. Vi har observeret, at en høj densitet af føde nedsætter fluorescens induktion i protokollen med orme bærer p<em> NLP-29</em> :: GFP reporter. Dette kan afspejle en formindsket infektion effektivitet ved orme dyrkes for meget bakterier (BS, upublicerede resultater). Samtidig er dyrkningsbetingelserne for RNAi bakterier også vigtigt, eftersom dette bestemmer, om dsRNA fremstilles på et optimalt niveau. Nogle protokoller for stor skala RNAi kræver dyrkning af RNAi kloner på agarplader inden podning flydende kulturer⁸. Vi opnåede robust gendæmpning udelade dette trin. Vi valgte til at dyrke et overskud af hver kultur for at sikre ensartede resultater. Protokollen beskrevet i virkeligheden indeholder tilstrækkeligt materiale til at udføre 2 eller 3 skærme parallelt. Af hensyn til at opnå de mest robuste resultater favorisere vi imidlertid, ledende skærm in duplo under anvendelse uafhængige kulturer orme RNAi bakterier og svampesporer.</p><p class="jove_content"> Anden kritisk trin er relateret til anvendelse af medium, der hverken er for fugtig eller for tør. Hvis pladerne ikke er tør nok, er det RNAi bakterier ikke tørrer korrekt og orme vil svømme under assayet. Dette kan give problemer. For eksempel er orme ikke effektivt inficeres af<em> D. coniospora</em> I flydende (C. Couillault, upublicerede resultater). På den anden side tørre plader. Osmolariteten af ​​dyrkningsmediet forøges Dette har direkte indvirkning på orm fysiologi¹⁷, Herunder induktion af visse antimikrobielle peptid gener, såsom<em> NLP 29</em>¹⁸. Volumen anvendes til at dispensere orme og sporer er kritisk for at tillade effektiv og hurtig tørring. Hvis mere end 10 pi væske tilsættes til friske plader, kan brøndene tage mange timer for at tørre. Dette kan betyde, at det er vanskeligt at anvende robot metoder til at tilføje orme til pladerne. For eksempel er hver snekke dispenseres ved Biosort i omkring 1 pi af væske. Vi har i øjeblikket distribuere orme manuelt som også giver os mulighed for at overvinde den tendens orme i opløsning på sediment.</p><p class="jove_content"> Vi har tidligere beskrevet en justering af Biosort som lader en 96-brønds plade, der skal analyseres i 36 minutter¹⁹. Maskinens producent UBI tilbyder nu en ændring af Biosort at falde yderligere analysen tid. Med "FastReFlex", er prøverne direkte ført gennem flowcellen for analyse, at omgå boble-fælde filter. Dette resulterer i en signifikant reduktion i den tid til datafangst, en hel plade kan analyseres i 22 min tillade omkring 20 plader, der skal behandles, per dag. Hvis pladerne ikke er frosset, men ville der være en 8 timers interval mellem de første og sidste dem. Grund af den relativt korte varighed af forsøget, med infektionen varighed kun 18 timer, vil det indføre en uacceptabel variabel over pladerne. Ikke alene fryse plader før analyse løse dette problem, men det er også vigtigt i forbindelse med high-throughput analyser, som med den nuværende protokol og standard væske-håndtering robotter, kan 2 personer nemt behandle op til 50 plader om ugen. I øjeblikket har vi rutinemæssigt skærmen 30 plader om ugen, hvilket giver en hel-genom-skærmskal udføres én gang i mindre end 2 måneder.</p><p class="jove_content"> Et interessant træk ved denne protokol er den kendsgerning, at den anvender fast agar, således assays, der ikke kan udføres i flydende kultur. Da ormen fysiologi forskellig afhængig af dyrkningsbetingelserne^20,21, Der er i stand til at udføre assays på fast medium kan også supplere sædvanlige væske-baserede skærme. For visse fænotyper (f.eks bevægelse), kan analysen gennemføres direkte med 96 brønde faste mediumplader. For det aktuelle skærmbillede kan imidlertid som Biosort ikke prøven fra faste mediumplader, der orme først overført til væsken før frysning. På den anden side tillader Copas Biosort en multiparametric kvantitativ analyse i overensstemmelse med målingen af ​​mange forskellige fænotyper. Det er sandsynligt, at for en given skærm ikke alle de målte parametre er det primære udlæsning. Ikke desto mindre kan disse målinger være nyttige til adskillige grunde. De tillader en at bestemme, om assayet løb korrekt. For eksempel kan man kontrollere antallet og størrelsen af ​​orme i hver brønd. Kun hvis en RNAi klon skal blokere for vækst eller reproduktion bør der være en afvigelse fra de forventede værdier. Brøndene med mindre end 20 orme eller / og dyr 30% mindre (TOF) sammenlignet med en standarddard kontrol med ingen virkning på vækst (<em> F.eks GFP (RNAi</em>)), Kan udelukkes fra de efterfølgende analyser. Funktionen af ​​disse kloner kan løses ved hjælp af en alternativ protokol, hvori ormene udsættes for RNAI bakterier efter deres udvikling er langt fremskreden¹⁵. De forskellige parametre kan også anvendes til at forfine kandidat-gen (HIT) selektion for eksempel at begrænse hits kun dem, der påvirker grøn fluorescens, men ikke rød. Den nøjagtige fremgangsmåde til udvælgelse af hits vil afhænge af typen af ​​skærmen og den nøjagtige udlæsning. I betragtning af kompleksiteten af ​​de data, genereret fra en kvantitativ genom-bredformat, kan samarbejde med en statistiker være påkrævet.</p><p class="jove_content"> Protokollen beskriver vi let kan tilpasses andre typer af assays. For eksempel ved infektionen trin<em> D. coniospora</em> Kan erstattes af enhver anden patogen stand til at inficere på faste medier. Dette er potentielt anvendelig som vi har fundet, at mange af de virulensfaktorer vigtige for Serratia marcescens infektion i flydende kultur ikke spiller en rolle under infektion på fast medium (E. Pradel, personlig kommunikation). Protokollen er også fuldt kompatibelt med test af kemikalier forbindelser^22-24, Eller at identificere forbindelser med bioaktivitet under anvendelse af forskellige biblioteker af bakterier²⁵, Så bør finde en generel anvendelighed i<em> C. elegans</em> Forskningsverdenen.</p

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
BactoAgar	BD Diagnostic Systems	214010
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
BactoPeptone	BD Diagnostic Systems	211677
CaCl2	Any supplier
AeraSeal adhesive film	Dutscher	760214
Isopropyl β-d-Thiogalactopyranoside (IPTG)	Thermo Scientific	AB-0481
K2HPO4	Any supplier
KH2PO4	Any supplier
MgSO4	Any supplier
NaCl	Any supplier
Na2HPO4	Any supplier
NaOH	Any supplier
96 deep well plate	Thermo Scientific	AB-0932
96 well flat plate	FALCON	353072
96 well round plate	FALCON	353077
Tetracycline	Sigma-Aldrich	T8032
Triton X-100	Any supplier
TECAN robot	TECAN
Liquidator96TM	RAININ
COPAS Biosort	Union Biometrica
LIMS	Modul-Bio