Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Nicel ve Otomatik Yüksek throughput Genom çapında RNAi Ekranlar C. elegans doi: 10.3791/3448 Published: February 27, 2012

Summary

Biz kullanarak bir protokol tarif

Abstract

RNA etkileşimi bir bütün-genom ölçekte ve kantitatif bir bağlamda yürütülen, özellikle gen fonksiyonlarını anlamak için güçlü bir yöntemdir. C. elegans, gen fonksiyonu belirli bir gen 1 tekabül eden bir dsRNA ifade bakterilerle solucan besleyerek basit ve etkin nakavt olabilir. RNAi klonların kütüphaneleri oluşturulması C. çoğunu kapsayan iken elegans genom 2,3 gerçek fonksiyonel genomik çalışmalar (örneğin 4-7) bakın yolunu açtı, en köklü zahmetli yöntemler vardır. Moy ve arkadaşları genom ekranlar 8 kolaylaştırmak yarı otomatik protokolleri geliştirmiştir. Yaklaşımı mikroskopik görüntüleme ve görüntü analizine dayanmaktadır.

Burada alternatif bir bakteriyel RNAi klonlar, Copas Biosort (Union Biometrica (UBI)) kullanılarak kantitatif analiz robotlu taşıma dayalı yüksek verimlilik genom ekran için protokol, ve bir tarifentegre yazılım: MBioLIMS (Modül-Bio Laboratuar Bilgi Yönetim Sistemi) veri yönetimi ve örnek izleme için yüksek verim sağlayan bir teknoloji. Metodu ekranları katı orta plaka üzerinde gerçekleştirilen izin verir. Bu, C. kişilere hitap etmeni-konak ilişkilerinin gibi bazı çalışmalar için özellikle önemlidir elegans, belirli mikroplar verimli sıvı kültüründe solucanlar enfekte etmez yana.

Bu yöntem, C ile anti-fungal doğuştan gelen bağışıklık genlerin önemi ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir elegans. Bu durumda, bir yaklaşım içinde yapısal olarak ifade edilir antimikrobiyal peptit geni nlp 29 promoter ve kırmızı bir flüoresan raportör kontrolü altında GFP ile bir enfeksiyona epidermal-indüklenebilen flüoresan raportör genini taşıyan bir transjenik suşunun kullanımına dayanır epidermis. İkincisi epidermisin işlevsel bütünlüğü için bir iç kontrol sağlarve nonspesifik transgen 9 susturmak. Kontrolü solucanlar mantar tarafından enfekte olduğunda, onlar yeşil floresan. RNAi enfeksiyon sonrası azalan floresans nlp 29 ifade sonuçlar için gerekli olan bir gen tarafından aşağı vurma. Şu anda, bu protokol daha 3000 RNAi klonlar az 2 ay içinde toplam genomunu eleme olasılığını açılması, haftada test edildi ve analiz edilmesini sağlar.

Protocol

Aşağıda tarif edilen protokol ardışık beş gün (Şekil 1) üzerine adımları ayrılmıştır. Belirtildiği gibi, belirli bir adım farklı günde yapılabilir. Her adım, yanı sıra malzemenin miktar gerekli süre (örn. solucanlar, bakteriler, ortam) deneyi başına muamele 96 oyuklu plakalar sayısına bağlı olacaktır.

1. Gün

1. 96-kuyucuklu plaklar NGM RNAi hazırlanması

Aşağıdaki protokol muhtelif çözeltileri için sterilizasyon teknikleri ayrıntıları içerir solucanı kültür plakaları 10 yapmak için standart bir yöntem, uyarlanmıştır.

  1. 1.7 g BactoAgar, 0.29 g NaCl, 0.25 g pepton, 100 uL kolesterol (EtOH içinde 5 mg / mL): 10-12 96-kuyucuklu plaklar için deiyonize H2O in nematodu büyüme ortamı 100 mL (NGM) hazırlanır.
  2. Otoklav NGM (121 az 5 dakika ° C'de 100 ml için; 121 30 dakika 4 ° L C) yaklaşık 50 ° C (sadece serin eno gelene kadar alıp soğumasını bekleyin) tutmak için ugh. Bu NGM katılaşmaya etmemesi için yeterince sıcak kalmasını önemlidir.
  3. 100 mL için ekleme: 2.5 mL fosfat tampon maddesi PH6 (1 M), 100 uL MgSO 4 (1 M), 100 uL CaCl2 (1 M), 400 uL IPTG (1 M), 100 uL Ampisilin (100 mg / mL), 100 uL Tetrasiklin (EtOH içinde 12.5 mg / mL).
  4. 96 çukurlu bir düz alt levhanın her oyuğa NGM 75 uL dağıtın. Orta katılaşma önlemek için, hızla reçete edilmesi gerekmektedir; bunu tekrarlayan bir dağıtıcı (örneğin Repeatman, Eppendorf) kullanmak daha uygun olur. Kuyu mevcut hava kabarcıkları vardır emin olun.
  5. 4 ° C de nemli bir odacık (örn. altındaki ıslak kağıt havlu ile bir Tupperware kutusu) hemen plakaları depolamak

Not: plakaları önceden bir hafta kadar hazırlanan ve 4 saklanabilir ° C; bu sonraki adımları organizasyonu daha kolay yapabilirsiniz.

2. 96-derin kuyucuklu plak LB otomatikleştirilmiş hazırlanması

  1. 4 ° C de her plaka ve saklamak için bir kapak ekle Her 96-kuyulu plakalı izlemek üzere, benzersiz bir etiket veya barkod bu aşamada ya da daha sonra ilave edilmelidir.

Not: plakaları önceden 2 ila 3 gün hazırlanan ve 4 saklanabilir ° C; bu sonraki adımları organizasyonu daha kolay yapabilirsiniz.

3. 96-derin kuyucuklu LB levhalar (gece kültür) olarak RNAi bakteriyel klonları Grow

  1. Orijinal RNAi kütüphanesi klonlar etiketli ya da standart çubuğu-kodlanmış 96-kuyucuklu 100 ug / mL Amp sahip LB ihtiva eden plakalar ve 12.5 ug / mL 'T içinde bir 384 kuyucuklu biçiminde, birinci dağıtma klonlar olup işleme müteakip kolaylığı için,ve gliserol (% 10 nihai konsantrasyon) ile desteklenmiştir. Orijinal 384-iyi plakaları tüm kuyularda klonlar olmadığında, gibi en sık kullanılan "Ahringer" kütüphane için olduğu gibi, kızı plakalar düzenlemek için çeşitli seçenekler vardır. Klonlar kızı plakaları hiç boş kuyu vardır, böylece yeniden dağıtılabilir. Bu ekrana plakaların sayısını en aza indirir. İdeal olarak, ancak, çoğaltma sırasında, her kızı plaka üzerinde birkaç tane kuyu bu sonradan boyunca plakalı karşılaştırmaları kolaylaştırmak standart kontrol klon (pozitif ve negatif) ile doldurulabilir, böylece boş bırakılmalıdır. Bunlar, 96-kuyucuklu plaklar kız daha sonra, bir gece (ON) kültürü için tohum 96-derin kuyucuklu plaklar LB için kullanılır.

Her sıvı idare adımları iyi bir sıvı robotik işleme sistemi (örneğin Tecan) ile yapılabilir, ancak kullanılarak elle yapılabilir, örneğin, bir 96-pin çoklayıcıyı. RNAi kütüphane klonlar 96-iyi biçimde iseniz 3.5 adıma geçin.

    37 at 96-kuyucuklu RNAi kız inkübe ° C'de 14-15 saat boyunca karıştırma (200 rpm) ile.
  1. Bakteri doğru büyüdü doğrulayın ve büyümeye vermedi klonları tanımlamak. Bunlar daha sonra analiz dışında tutulacaktır. İdeal olarak, OD 600, her sıra ile ölçülür, ancak bu basit bir inceleme ile yapılabilir.
  2. ° C'de kullanımdan önce -80 azından 96-kuyucuklu plaklar RNAi kız depolamak.
  3. Oda sıcaklığında RNAi klonlar içeren 96 kuyucuklu plaklar çözünmesi. Sonra plakalar ° C, kullanılıncaya kadar 4 tutulabilir.
  4. 100 ug / mL Amp sahip LB 1,5 mL içeren buna uygun olarak etiketlenmiş / barkodlu 96-derin kuyucuklu LB plakanın 96 kuyucuklu ve 12.5 ug / mL Tet için bir 96-kuyulu plakalı çoğaltmak her bakteriyel klonunun 3 uL dağıtın. RNAi gibi, mevcut örnekte, bir gfp (RNAi) klon olarak etkinliği, ve negatif kontroller, kontrol etmek için bakteriyel klonlar mevcut herhangi bir boş iyi elle dahil edilebilir.
  5. 96-derin kuyucuklu p Kapakyapışkan bir film (Dutscher örneğin AeraSeal hücresel kültürü filmi) ile lates. -80 De kullanılan 96-kuyulu plakalı kopyalayan ° C. yerini
  6. 96-derin kuyucuklu plaklar etiketli daha sonra 37 üzerinde inkübe edilir ° C'de karıştırılarak (14-15 saat boyunca 200 rpm).

2. Gün

4. 96-kuyucuklu NGM RNAi plakaları üzerine tohumu RNAi bakteriyel klonları

Bu adımda ON kültürü takiben sabah yapılmalıdır.

  1. 4 96-NGM plakaları Take ° C ve onları steril bir laminer akış kabini altında 5-15 dakika kadar ısıtın ve kurumaya bırakın. Aksi NGM sonradan çatlayabilir gibi, çok uzun kaput (maksimum 30 dakika) altında plakaları bırakmayın. Her plaka için uygun etiket / barkod ekleyin.
  2. 37 ° C kültüre plakaları ON 96-derin kuyucuklu Al Herhangi bir boş kuyular (boş bir zamanda tamamen şeffaf olan) pozisyonlarını kaydedin; Bu müteakip analizler dışında tutulacaktır.
  3. 96 Santrifüj-Derin kuyucuklu plakalar 4000 rpm'de 5 dk.
  4. Keskin bir şekilde baş aşağı plaka dönüm ve bir kağıt havlu üzerine hızla plakanın kenarlarına kuru ile süpernatantı kapalı İpucu. Kültürlerin rekombinant bakteri olduğu için, süpernatant yerel düzenlemelere (örneğin otoklavlanmış) uygun olarak tedavi edilmesi gerekir.
  5. Ideal olarak her bir plaka tam olarak aynı arıtma alır, böylece ayrı bir karıştırıcı (örn. Tecan) kullanılarak, vorteks ile artık sıvı (yaklaşık 50 uL) içindeki bakteriyel pelletini. O sonraki adım için kesin bakteriyel inokulum standardize etmek, her iyi OD 600 ölçmek mümkündür, ama bu vazgeçilmez değildir ve biz böyle bir onay yapmazlar.
  6. Bir 8 veya 12-kanal Çok-pipet kullanılarak 96-kuyucuklu NGM plakaları üzerine yeniden süspanse bakteri 5 uL transfer edin. NGM dokunmayın veya nüfuz için dikkatli olun. Bu adımda elle gerçekleştirilir, fakat böyle Liquidator96 (Rainin) gibi bir robot kullanılarak optimize edilebilir izin verenbir adımda 96 RNAi klonlar dağıtılması.
  7. NGM çok kuru olma önlemek için düzenli kontrol, steril bir laminer akış kabini altında bakteri kurumasını bekleyin. Bu adım, yaklaşık 2 saat sürer.
  8. Nemli odasında ON 37 ° C'de 96-RNAi-NGM inkübe edin.

5.. Solucanlar senkronize bir nüfus hazırlayın

Bu adım için, biz ilgi raportör gen (ler) (bir enfeksiyon-indüklenebilir p nlp-29 :: GFP yapı ve örneğin, bir iç kontrol olarak, kurucu bir p col-12 :: DsRed transgen inşa) taşıyan transgenik solucanlar kullanın . Çünkü zaman transgen ifade azalma gözlendiğini, biz solucanlar her 6 haftada taze toplu çözülme. Biz kültür kullanımdan önce en az 2 nesiller için solucanlar ve solucanlar tahlilinden önce açlıktan hiç emin olun. Protokolün 2 Salı günü ise, biz OP50 bakteri ile bulaşan bir 9 cm NGM plaka üzerine 30 genç erişkin solucanlar yerleştirerek Cuma günü solucanlar hazırlamak20 ° C de Salı günü (bkz. Tablo 1) üzerinde çamaşır suyu hazır olacak.

  1. Standart protokol 10 takip Bleach solucanlar.
  2. Yumurta L1 larvaların senkronize bir nüfusa almak için ajitasyon ile AÇIK 25 ° C'de M9 yumurtadan çıkarlar edelim.

3. Gün

6. Besleme ve RNAi için 96-iyi RNAi-NGM tabaklarda solucanlar dağıtın

Bu adımda sabah yapılmalıdır. L1-aşamalı senkronize solucan besleme ve RNAi her 96-bakteriyel klon üzerine dağıtılır.

  1. 37 ° C den 96-kuyucuklu plaklar RNAi-NGM almak ve soğutmak için oda sıcaklığında bırakırlar.
  2. 25 ° C arası ağartılmış solucanlar almak 2 uL başına solucan sayısını tahmin ve 2 uL başına yaklaşık 100-120 solucanları (kabaca tek bir damla) sahip M9 ile ayarlayın.
  3. Elle tekrarlayan bir dağıtıcı kullanarak her iyi L1 aşamalı solucanlar 2 uL dağıtın. Solucanlar (Eğer sıvı içinde yüzme solucanlar görmelisiniz) her iyi kontrol edin.
  4. Steril bir laminer akış kabini (maksimum 1 saat) altında plakaları kurumasını bekleyin. Düzenli plakaları kontrol edin; solucanlar sürünen ve yüzme edilmemelidir. Dikkatli olun, NGM çok kuru olmamalıdır, aksi takdirde çatlar.
  5. Nemli bir odada 25 ° C'de plakaları yerleştirin.

7. Etkili enfeksiyon için Drechmeria coniospora sporlar Test

Bu aşama, mevcut ekran için spesifik değildir. Oldukça infektif olanları seçmek için sporlar farklı toplu test oluşur. Bu nedenle günde 4, enfeksiyon gününden önce mümkün olduğunca yakın yapılmalıdır. Bu testler (Tablo 1) için önceden yeterli L3-L4 solucanlar hazırlamak için gereklidir. D. için gerekli yöntemleri ayrıntılı coniospora kültürü başka 11 tarif edilmiştir.

<ol>
  • M9 küçük bir hacim içinde her mantar kültürü bir örneklem üzerinden sporlar toplayın.
  • OP50 ile tohumlanan 35 mm NGM plaka üzerinde her spor süspansiyonu bir damla yerleştirin ve kurumaya bırakın.
  • Ilgi muhabiri geni taşıyan 30-40 L3-L4 solucanları (örneğin p nlp-29 :: GFP) ekleyin.
  • 25 ° C 'de enfekte plakaları yerleştirin.
  • Ertesi gün, GFP indüksiyonu için solucanlar kontrol ve yeşil floresan parlak, en geniş ve en homojen indüksiyon veren mantar toplu seçin.
  • 4. Gün

    8. D. ile RNAi maruz kalan solucanları Infect coniospora sporlar

    Bu adım 30 saat RNAi solucanlar L3-L4 sahne ulaştığınızda beslenmesinden sonra yapılır.

    1. Başına iyi 4 uL dağıtmak için kullanmak sporların hacmi belirleyin.
    2. Taze D. toplayın M9 tamponu ile seçilen parti coniospora sporlar. Sporlar biri 9 cm plaka için M9 8-10 mL kullanın.
    3. <li> tekrarlayan bir dağıtıcı ile her kuyuya sporların 4 uL dağıtın. Sporlar (Eğer sıvı içinde solucanlar yüzme görebilirsiniz) için her iyi kontrol edin.
    4. Steril bir laminer akış kabini (~ 1 saat) altında plakaları kurumasını bekleyin. Solucanlar sürünen başlamak kadar düzenli plakaları kontrol edin. Dikkatli olun, NGM çok kuru olmamalıdır, aksi takdirde çatlar.
    5. Nemli bir odasında 25 enfekte plakaları ° C yerleştirin.

    5. Gün

    9. Otomatik kantitatif analiz önce plakaların Gözlem ve depolama

    Bu adımda enfeksiyondan sonra 18 saat sonra başlar ve günde 5 sırasında gerçekleştirilir. Worms yumurtlamak için başlayan genç erişkinlerde olması bekleniyor. Bu basamak sırasında fenotip görsel skor belirlenir: ya solucanlar normal bir durum enfeksiyona tekabül yeşil floresan veya GFP indüksiyonu yani, belirli bir zamanda değiştirilmiş olduğu susturuldu geni değişiklikler enfeksiyona tepkisi.

      <li> Hızla floresan mikroskop altında tabak gözlemlemek. Plakalar iyi bir genel GFP indüksiyon göstermesi durumunda daha sonra bir sonraki adıma geçin, aksi sürece solucanlar için sol gıda hala var gibi, daha iyi bir indüksiyon için öğleden sonraya kadar bekleyin.
    1. Görme, her plaka puan ve belirgin bir fenotip (GFP ekspresyonu gibi) ile herhangi bir iyi not edin. Eklenmiş olabilecek herhangi bir kontrol RNAi klonları ile elde edilen sonuçların kontrol ederek, bu ilk ön analiz denemesi başarılı olup olmadığını bir göstergesidir.
    2. Için, 50 mM NaCl-Triton 0.05% 100 uL ile 8 veya 12 kanallı Çok Pipet transferi solucanlar kullanarak yeni bir buna etiketli / 96-Yuvarlak tabanlı plaka barkodlu. -80, Tabaklar Freeze ° C analizi kadar.
    3. Analiz gününde, oda sıcaklığında, plakalar çözünmesi ve Copas Biosort kullanılarak otomatik analizi ile devam edin. Sıralayıcı 22 dakika içinde tek bir plaka analiz eder. Plakalar olmamalıdıranalizden önce bir saat daha oda sıcaklığında bırakılır, ve yine dondurulabilir edilemez.
    4. Copas Biosort elde edilen bilgiler veri kalitesi üstünkörü doğrulanması için bir Excel dosyasına kopyalanır. Copas Biosort (üç farklı dedektörler tarafından eş zamanlı optik yoğunluk (yok), aksiyel uzunluk (uçuş süresi), floresans emisyon) ile ölçülen farklı parametrelerle ham veriler daha sonra özel bir LIMS paketi (MBio LIMS, saklanır Modul- daha sonraki ayrıntılı kantitatif analiz için Bio).

    10. Temsilcisi Sonuçlar

    Çoğu kuyu, deney sonunda, yukarıda verilen solucan ve bakterilerin miktarda kullanarak, tüm hayvanlara yetişkinliğe geliştirdi olmalıdır ve hala tüm kuyular kalan bazı gıda olmalıdır. Bu koşullar altında, en fazla kuyu ayrıca yumurta içermelidir. Bu nedenle de Biosort verileri f elde edildiği her yetişkin yeterli sayıda olmalıdırya da en azından 50 bireysel solucanlar. RNAi etkin ise, diğer yandan, RNAi klonlar, çok sayıda görünür bir fenotip sebep olur. Örneğin, solucanlar koordine edilmemiş ya da daha çok açıktır ki, steril, veya gelişimlerini yakalanan olabilir. Bu, genellikle de 96-kuyulu plakalı başına en az bir açık bir RNAi fenotipe sahip solucanlar içerir, böylece sık ortaya. Ilgi fenotipi bir GFP raportör gen ifadesi olduğunda, bir gfp (RNAi) klon kuyu güçlü bir kontrol (Şekil 2) sağlar. Böyle boyutlu bir değişikliğe gibi diğer fenotip, kolaylıkla Biosort (Şekil 3A) ile ölçülebilir. Biz iyi gıda tükendi ne zaman solucanlar çok düşük frekans (<% 1, BS, yayınlanmamış sonuçlar) bitişik kuyu göç gözlemlenmiştir.

    Genlerin farklı sınıflar işlevi aşağı vurma C. transgenlerin ifade etkileyebilir elegans. Bazıları non-spesifik transgenlerin ifadesi 12 için gereklidir. Diğerleri, örneğindokuya özel transkripsiyon faktörleri gibi, örneğin epidermal GATA faktörü ELT-3 13, hücrelerin, özellikle alt gerekli olacaktır. Bu, geçerli protokol için kullanılan gerilim olmayan bir ilgili ve kurucu epidermal hücre transgen muhabiri yapı (p col-12 :: DsRed) dahil nedenlerinden biridir. Bu tür gen spesifik olarak üzerinde çalışılan genin düzenleyici proses (Şekil 3B ve C) yer ayırt edilmesini sağlar. Bu transgen tüm larva aşamalarında ifade edilir. Bir deneyde embriyolarında tespit gen ekspresyonu içeriyorsa, farklı bir denetim raportör gen gerekli olacaktır.

    Bu protokolün yeniliklerden biri kendi analizini erteleme donma plakaların kullanılmasıdır. Donma plakaları ölçüde sonuçlar değiştirmeden iki hafta için kadar muhafaza edilmesini sağlar. Ölçülen floresans mutlak değerleri değiştirilebilir olmasına rağmen, bunların nispi oranları (Şekil 4) 'e benzer kalır. Ot Açıkelini, RNAi bir içsel değişken deneysel prosedür 14'tür. Sağlam sonuçlar elde etmek ve birçok potansiyel yanlış pozitif ortadan kaldırmak için, RNAi ekranları en az bir kez, çoğaltılması gerekmektedir. Deneyler başarılı bir şekilde yürütülür ise, farklı günde bir test plakası elde edilen sonuçlar arasında makul bir korelasyon vardır olmalıdır. Özellikle güçlü bir etkiye sahip genler bunların kesin kantitatif etkisi çift plaka (Şek. 5) ile özdeş olmasa da, açık bir şekilde tanımlanabilir olmalıdır.

    Şekil 1..
    Şekil 1. Tipik bir deney için genel şeması.

    Şekil 2.
    Şekil 2. Kontrol RNAi GFP hedefleyen bir klon kullanarak. Transgenik solucanlar expressing Konstitütif ap col-12 :: DsRed muhabiri ve indüklenebilir p nlp 29 :: 96-iyi plaka katı ortam üzerinde GFP muhabiri kırmızı ve yeşil floresan eşzamanlı gözlem izin veren bir filtre seti ile mikroskop diseksiyon bir GFP ile görüntülendi. Solucanlar kontrol (üst panel) ya da 48 saat süre ile, bir GFP RNAi clone (alt paneller) maruz bırakılmıştır. Soldaki panelleri 18 saat D. ile enfeksiyondan sonra bulaşmamış solucanlar, sağ solucanlar üzerinde olanlardır coniospora. Ölçek çubuğu 1 mm'dir.

    Şekil 3.
    Şekil 3. Bir 96-kuyulu plakanın nicel. Copas Biosort analiz edilen her bir solucan için sayısal veri oluşturur. Solucanlar 15, kırmızı floresans (B) ve transgenik wo TOF yeşil floresans oranı (X100) (C) boyutu karşılık; grafikler uçuş süresi için ortalama ve standart sapma (A TOF) göstermekrms yapısal olarak ifade ap col-12 :: DsRed muhabiri ve indüklenebilir p nlp 29 :: 18 saat D. ile enfeksiyondan sonra 48 saat için farklı RNAi klonları ile 96-plaka katı ortamında kültüre edilmiş GFP muhabiri, coniospora. Gibi (A), provoke büyüme bozukluklar ve / ya da p-col 12 :: DsRed ifadesi etkiler de ok ile vurgulanmış olarak belirli bir klon. (C) de ok ile öne gibi diğerleri, özel olarak, GFP tanımı etkilemez. Bu özel klonu daha önce nlp 29 13 düzenlenmesi için önemli olduğu gösterilmiştir gen nsy 1 hedefliyor. Yeşil, kırmızı floresans ve TOF keyfi ancak sabit birimi ile ölçülür.

    Şekil 4.
    Şekil 4. Zorunluaynı deneyi canlı ve dondurulmuş numuneler ile elde edilen verilerin Arison. P nlp-29 :: GFP ve p col-12 :: DsRed transgenlerin taşıyan L4 solucanlar levhalar ya D. ile enfekte edildi coniospora veya olmasın. 18 saat sonra, her plaka kabaca 2 ayrılır; yarısı hemen analiz ve çözme ve analiz önce yarım, 24 saat için -80 ° C'de donduruldu. Ortalama TOF (solucan boyutu), EXT (optik yoğunluk) ve Yeşil ve Kırmızı floresan değerleri her bir örnek için hesaplandı. Grafik için ortalama oranını gösteren enfekte olmayan numuneler bölünmesiyle bulaşmış, dondurulmuş ve canlı örnekler için (n = 7638 ve 5096, ve 8634 ve 3850 solucanlar).

    Şekil 5.
    Şekil 5. Çoğaltılmış 96-kuyucuklu plaklar karşılaştırmalı analizi. Normalize floresans oranı (ortalama floresan oranı (Burada, her biri 100 iyi bölünmesiyle için * yeşil / TOF)temsilcisi 96-plaka yinelenen analizler her iyi (25 th 75. persentil) her plaka için ortalama) kesilmiş.

    Malzeme Deneysel Timeline
    • IPTG: ~ 1.4 mL
    • Ampisilin: ~ 5 ml
    • Tetrasiklin: ~ 5 ml
    • LB: 5 L
    • 96-kuyucuklu plaklar düz: 30 NGM için
    • 96-yuvarlak levhalar: 30 dondurma (analiz)
    • 96-derin kuyucuklu plakalar: 30 kültür ON
    • kültürü film: 30
    • İpuçları kutusu: 30 bakteri ekim için
    • 9 cm OP50 plakalar: ~ 17
    • Worms: 1 taze cyrovial çözülmüş aylık
    • Sporlar: ~ 2 tabak
    • 50 mM NaCl +% 0.05 Triton: ~ 300 mL
    Perşembe
    1. NGM RNAi 96-levhalar (~ 1h + otoklav) hazırlayın
    Cuma
    1. 96-derin kuyucuklu LB levhalar (~ 4h) hazırlayın
    2. Solucanlar hazırlayın (20 30 genç erişkin solucanlar ile 14 plaka, 25 ° C + 1 tabak ° C)
    Pazartesi
    1. Yeni plaka üzerine 25 ° C'de plakadan solucanlar Transfer
    2. LB plakaları bakteri dağıtın (~ 7h)
    3. Saat 6'da kültür ÜZERİNE
    Salı
    1. Sabah NGM plakalar üzerinde bakteri Dağıt (~ 3h+ ~ 2s kurutma)
    2. 20 ° C'de plakalardan Bleach solucanlar
    Çarşamba
    1. 10 am (~ ~ 1h 1h + kurutma) de solucanlar dağıtın
    2. 25 plaka solucanlar Test sporlar ° C
    Perşembe
    1. 3 pm (~ ~ 1h 1h + kurutma) de solucanlar Infect
    Cuma
    1. 96-plaka + freeze (~ 2 saat) Yeni Transfer

    Tablo 1. 30 plakaları ile tek döngüsü Deney Örneği.

    Burada 9 gün düzenlenen 12 adım adım 1'den bir deney için 30 plaka bir döngüsü deney ve bir zaman çizelgesi için gerekli malzeme sunulmaktadır.

    Nematodu büyüme ortamı (NGM), 100 mL:

    0.3 g NaCl
    0.25 g BactoPeptone
    2 g BactoAgar
    100 uL EtOH içinde 5 mg / mL Kolesterol
    100 ml deiyonize su ilave edilir
    121 az 5 dakika Otoklav ° C ve ekleyin, sonra soğumaya bırakın:
    100 uL 1 M MgSO 4
    100 uL 1 M CaCI2
    2,5 mL 1 M KPO 4 pH 6.0

    96-kuyulu plakalı, 100 mL RNAi tedavisi için NGM:

    0.29 g NaCl
    0.25 g BactoPeptone
    1.7 g BactoAgar
    100 uL EtOH içinde 5 mg / mL Kolesterol
    De ekle iyonize su ile 100 mL
    121 az 5 dakika Otoklav ° C ve ekleyin, sonra soğumaya bırakın:
    100 uL 1 M MgSO 4
    100 uL 1 M CaCI2
    2,5 mL 1 M KPO 4 pH 6.0
    400 uL 1 M IPTG
    100 uL 100 mg / ml ampisilin
    100 uL 12.5 mg / mL Tetrasiklin

    Çamaşır suyu, 5ml:

    2.5 ml H2O
    2,3 mL Bleach
    0,2 mL% 50 NaOH

    NaOH 50%, 100 mL:

    50 g NaOH
    100 ml deiyonize su ilave edilir

    50 mM NaCl-Triton 0.05%, 400 mL:

    4 mL NaCl 5 M
    1 mL Triton% 20
    400 ml deiyonize su ilave edilir

    TEP ">% 20 Triton, 10 mL:

    2 mL Triton X-100
    8 ml deiyonize su

    M9 tampon, 1L

    6 g Na 2 HPO 4 (MW: 178)
    3 g KH 2 PO 4 (MW: 136)
    5 g NaCl
    1 L saf su ekleyin
    Otoklavlayın
    1 ml MgSO 4 1 M ekle

    Luria Broth (LB), 1L:

    10 g BactoTryptone
    20 gr Maya özü
    10 g NaCl
    1 L saf su ekleyin
    Otoklavlayın

    1 M MgSO 4, 300 mL:

    73.95 g MgSO 4
    300 ml deiyonize su ilave edilir
    Oda sıcaklığında, otoklav ve deposu

    5 mg / mL Kolesterol, 200 mL:

    1 g Kolesterol
    200 mL% 100 EtOH ekleme
    Sterilize filtreleme ve oda sıcaklığında saklayın

    1 M CaCI2, 500 mL:

    27.75 g CaCI2
    500 ml deiyonize su ilave edilir
    Sterilize filtreleme ve oda sıcaklığında saklayın

    1 M KPO 4 pH 6.0, 4 L:

    517 g KH 2 PO 4 (MW: 136)
    207 g K 2 HPO 4 (MW: 174)
    4 L deiyonize su ekleyin

    100 mg / ml ampisilin (Amp), 10 mL:

    1 g ampisilin
    10 ml deiyonize su ilave edilir
    -20 ° C'de deposunda

    1 M İzopropil β-D-Thiogalactopyranoside (IPTG), 10 mL:

    2.38 g IPTG
    10 ml deiyonize su ilave edilir
    -20 ° C'de deposunda

    12.5 mg / mL tetrasiklin, 100 mL

    1.25 g Tetrasiklin
    100 mL% 100 EtOH ekleme

    Tablo 2. Çözümler.

    Discussion

    Disclosures

    Ewbank laboratuar Birliği Biometrica ve Modül-Bio ile işbirliği yapmaktadır.

    Acknowledgments

    Biz onların katkıları D. Braendle, CL Kurz ve F. Montanana-Sanchis teşekkür ederim. Bu proje ANR ve Conseil Bölgesel PACA ve İNSERM ve CNRS gelen kurumsal finansman hibe ile desteklenmiştir.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BactoAgar BD Biosciences 214010
    Ampicillin Sigma-Aldrich A9518
    BactoPeptone BD Biosciences 211677
    CaCl2 Any Supplier
    AeraSeal adhesive film Dutscher 760214
    Isopropyl β-d-Thiogalactopyranoside (IPTG) Thermo Fisher Scientific, Inc. AB-0481
    K2HPO4 Any Supplier
    KH2PO4 Any Supplier
    MgSO4 Any Supplier
    NaCl Any Supplier
    Na2HPO4 Any Supplier
    NaOH Any Supplier
    96 deep well plate Thermo Fisher Scientific, Inc. AB-0932
    96 well flat plate Falcon BD 353072
    96 well round plate Falcon BD 353077
    Tetracycline Sigma-Aldrich T8032
    Triton X-100 Any Supplier
    TECAN robot Tecan Group Ltd.
    Liquidator96TM Rainin
    COPAS Biosort Union Biometrica
    LIMS Modul-Bio

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854-854 (1998).
    2. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, 313-321 (2003).
    3. Rual, J. F. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).
    4. Lee, S. S. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat. Genet. 33, 40-48 (2003).
    5. Hamilton, B. A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans. Genes Dev. 19, 1544-1555 (2005).
    6. Frand, A. R., Russel, S., Ruvkun, G. Functional genomic analysis of C. elegans molting. PLoS Biol. 3, e312-e312 (2005).
    7. Parry, D. H., Xu, J., Ruvkun, G. A whole-genome RNAi Screen for C. elegans miRNA pathway genes. Curr. Biol. 17, 2013-2022 (2007).
    8. O'Rourke, E. J., Conery, A. L., Moy, T. I. Whole-animal high-throughput screens: the C elegans model. Methods Mol. Biol. 486, 57-75 (2009).
    9. Pujol, N. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).
    10. Stiernagle, T. The C. elegans Research Community. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1551-8507 (2006).
    11. Powell, J. R., Ausubel, F. M. Models of Caenorhabditis elegans Infection by Bacterial and Fungal Pathogens. Methods Mol Biol. Ewbank, J., Vivier, E. 415, Humana Press. 403-427 (2008).
    12. Cardoso, C. XNP-1/ATR-X acts with RB, HP1 and the NuRD complex during larval development in C. elegans. Dev. Biol. 278, 49-59 (2005).
    13. Pujol, N. Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides. PLoS Pathog. 4, e1000105-e1000105 (2008).
    14. Simmer, F. Genome-Wide RNAi of C. elegans Using the Hypersensitive rrf-3 Strain Reveals Novel Gene Functions. PLoS Biol. 1, e12-e12 (2003).
    15. Couillault, C. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nat Immunol. 5, 488-494 (2004).
    16. Morton, E., Lamitina, T. A suite of MATLAB-based computational tools for automated analysis of COPAS Biosort data. Biotechniques. 48, xxv-xxx (2010).
    17. Rohlfing, A. K., Miteva, Y., Hannenhalli, S., Lamitina, T. Genetic and physiological activation of osmosensitive gene expression mimics transcriptional signatures of pathogen infection in C. elegans. PLoS One. 5, e9010-e9010 (2010).
    18. Lee, K. Z., Kniazeva, M., Han, M., Pujol, N., Ewbank, J. J. The fatty acid synthase fasn-1 acts upstream of WNK and Ste20/GCK-VI kinases to modulate antimicrobial peptide expression in C. elegans epidermis. Virulence. 1, 113-122 (2010).
    19. Duverger, Y. A semi-automated high-throughput approach to the generation of transposon insertion mutants in the nematode Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 35, e11-e11 (2007).
    20. Pierce-Shimomura, J. T. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20982-20987 (2008).
    21. Ruzanov, P., Riddle, D. L. Deep SAGE analysis of the Caenorhabditis elegans transcriptome. Nucleic Acids Res. 38, 3252-3262 (2010).
    22. Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Infection in a dish: high-throughput analyses of bacterial pathogenesis. Curr. Opin. Microbiol. 10, 10-16 (2007).
    23. Okoli, I. Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay. PLoS One. 4, e7025-e7025 (2009).
    24. Moy, T. I. Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 10414-10419 (2006).
    25. Ballestriero, F., Thomas, T., Burke, C., Egan, S., Kjelleberg, S. Identification of compounds with bioactivity against the nematode Caenorhabditis elegans by a screen based on the functional genomics of the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicata D2. Appl. Environ. Microbiol. 76, 5710-5717 (2010).
    Nicel ve Otomatik Yüksek throughput Genom çapında RNAi Ekranlar<em> C. elegans</em
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3448, doi:10.3791/3448 (2012).More

    Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3448, doi:10.3791/3448 (2012).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video
    Waiting X
    simple hit counter