Summary
Este manuscrito descreve três protocolos complementares para avaliar a toxicidade de poliglutaminas (poliQ)-expansão proteínas na levedura
Abstract
Misfolding proteína está associada com várias doenças humanas, doenças neurodegenerativas particularmente, tais como a doença de Alzheimer, doença de Parkinson e doença de Huntington 1. Doença de Huntington (DH) é causada pela expansão anormal de uma região poliglutaminas (poliQ) dentro do huntingtina proteína. O poliQ-expandida proteína huntingtina atinge uma conformação aberrante (ie misfolds) e provoca toxicidade celular 2. Pelo menos oito outras doenças neurodegenerativas são causadas por poliQ de expansões, incluindo o AEC e doença de Kennedy 3.
A levedura organismo modelo facilitou insights significativos para a base celular e molecular de poliQ toxicidade, incluindo o impacto de fatores intra e inter-molecular de poliQ-toxicidade, bem como a identificação de caminhos celulares que são deficientes em células expressando poliQ expansão proteínas 3-8. Importantely, muitos aspectos poliQ-toxicidade que foram encontrados em levedura foram reproduzidas em outros sistemas experimentais e em certa medida em amostras de pacientes de HD, demonstrando assim a significância do modelo de levedura para a descoberta de mecanismos básicos subjacentes poliQ-toxicidade.
Uma forma direta e relativamente simples para determinar poliQ toxicidade em levedura é medir defeitos de crescimento de células de levedura que expressam poliQ expansão de proteínas. Este manuscrito descreve três complementares abordagens experimentais para determinar a toxicidade poliQ-em levedura através da medição do crescimento de células de levedura que expressam poliQ-expansão proteínas. As duas primeiras abordagens experimentais controlar o crescimento de leveduras em placas, a terceira abordagem monitora o crescimento de culturas de leveduras líquidos utilizando o instrumento BioscreenC.
Além disso, este manuscrito descreve dificuldades experimentais que podem ocorrer ao manusear modelos poliQ levedura e traça estratégias que ajudarão a evitar ouminimizar estas dificuldades. Os protocolos aqui descritos podem ser utilizados para identificar e caracterizar as vias genéticos e pequenas moléculas que modulam poliQ-toxicidade. Além disso, os ensaios descritos podem servir como modelos para análises precisas da toxicidade causada por outras doenças associadas a proteínas deformadas em modelos de levedura.
Protocol
1. Expressão de Tóxicos poliQ expansão de Proteínas em Leishmania
Uma análise sistemática estabeleceu a sequência de ácido preciso amino de uma proteína poliQ-expansão que é necessário para produzir a toxicidade em levedura 7. Esta proteína poliQ expansão-tóxico contém um amino-terminal FLAG-tag seguido por 17 aminoácidos a partir da sequência original da proteína huntingtina, uma região poliQ, e uma fusão carboxi-terminal para uma proteína fluorescente (GFP quer ou PCP, ver Figura 1 um). A expressão de proteínas com expansões poliQ de 46 glutaminas ou mais (por exemplo 72 e 103 glutamines) produz toxicidade em levedura quando expresso sob o controlo do induzível e relativo promotor GAL1 forte 7, 9.
Como descrito anteriormente, poliQ toxicidade em levedura é apenas aparente em células que transportam o Rnq1p proteína na sua conformação prião, [RNQ +], por exemplo, a estirpe de levedura W303 9. A r proteína tóxica poliQ-expansãoecapitulates aspectos centrais de poliQ biologia-em leveduras, tais como toxicidade poliQ comprimento-dependente (ver abaixo) e agregação (Figura 1 b). Notavelmente, tóxicos poliQ expansão de proteínas não matar células de levedura imediatamente, pois eles sim prejudicar ou prender o ciclo celular e devision célula, assim, retardar ou inibir o crescimento de colônias de leveduras em placas ou culturas líquidos (os nossos dados não publicados).
2. Possíveis problemas com células de levedura Expressando tóxicos poliQ expansão de Proteínas
As células de levedura que expressam as proteínas de expansão de outra forma tóxicos poliQ pode não apresentar qualquer defeito de crescimento 9. A natureza genética destes supressores de poliQ-toxicidade não parece ser com base em simples mutações Mendelian e, portanto, pode ocorrer com frequência relativamente elevada (nossos resultados não publicados). Especula-se que estes supressores espontâneas são causados pela cura de priões não identificados que funcionam de forma semelhante ao [RNQ +] na determinação toxicity.Thes poliQde e supressores espontâneos de toxicidade poliQ pode comprometer o êxito de qualquer experimento que tem por objetivo caracterizar a toxicidade poliQ ou para identificar e caracterizar modificadores de toxicidade poliQ.
A fim de evitar a ocorrência frequente destes supressores espontâneos, siga as medidas de precaução descritas abaixo, que provaram ser muito eficazes:
- Use células de levedura fresca para experimentos de toxicidade. Não armazenar levedura, por períodos de tempo prolongados. Freqüentemente recuperar colônias de leveduras frescas provenientes das existências de congelados.
- Frequentemente monitorizar a expressão e agregação de tóxicos poliQ-expansão proteínas por microscopia de fluorescência.
- Manter as células de levedura em meios que reprimem a expressão da toxicidade poliQ tóxico em todos os momentos (isto é, em meios selectivos, contendo glucose como única fonte de carbono) antes de iniciar quaisquer medições de toxicidade.
- Use pelo menos três transformantes independentes para cada experimento poliQ toxicidade. </ Li>
3. Ensaios de crescimento
- Para cada condição experimental, inocular um colónia de cada a partir de três transformantes independentes de células de levedura ancorando o proteína poliQ expansão-tóxico em 3 ml de meio de levedura selectivos com glucose como única fonte de carbono.
- Incubar estas culturas durante a noite a 30 ° C. Sob estas condições, as células não estão expressando a proteína poliQ-expansão, porque a glucose no meio reprime a sua expressão. Não deixe que estes overgrow culturas; manter o OD 600 (absorção de luz de comprimento de onda de 600 nm) das culturas noturnas abaixo de 1.
- Rotineiramente usar três ensaios diferentes para monitorar os defeitos de crescimento de células de levedura que expressam a proteína poliQ expansão-tóxico:
3,1 Crescimento em placas
- Diluir as culturas de leveduras durante a noite (cultivadas com 220 agitação rpm) para uma DO600 de 0,0005 (isto é, uma diluição de 1:1000 de um OD600 = 0,5 cultura) em selectiva media 7 contendo glucose.
- Uniformemente distribuído 50 uL (resultando em CA. 700 colónias por placa) de cada cultura diluídos em um prato (10 cm de diâmetro) com meio selectivo contendo glucose como única fonte de carbono e uma placa com meio selectivo contendo galactose como única fonte de carbono.
- Incubar as placas durante três a quatro dias a 30 ° C. Após a incubação, tirar fotografias de cada placa e contar o número de colónias no glicose e do número de colónias nas placas de galactose. Sob condições ideais, não deve haver nenhum ou apenas muito poucas colónias sobre a placa de galactose ao utilizar células de levedura que expressa uma proteína altamente tóxico poliQ expansão-(103.oQ, a Figura 2a).
3.2 ensaios Spotting
Este ensaio é mais quantitativa do que o ensaio de plaqueamento descrito acima e pode, assim, revelam mesmo diferenças subtis na toxicidade poliQ com a mesma experiência na mesma placa.
- Dilui-se a overnculturas ireito crescidas em meio com glicose a uma OD 600 de 0,1.
- Pipetar 200 destas culturas diluídas em estéreis placas de 96 poços e preparar cinco diluições em série de cinco vezes em água estéril, utilizando uma pipeta multi-canal.
- Usando um frogger, (também chamado um removedor, com 8 x 6 pinos para a transferência de suspensões de células) transferir as suspensões de células em placas contendo meio selectivo com glucose como única fonte de carbono e placas contendo meio selectivo com galactose como única fonte de carbono.
- Permitir que as placas a secar antes de incubando-as a 30 ° C durante três a quatro dias.
- Após a incubação, tirar fotografias de cada placa (Figura 2b).
3,3. Monitorização poliQ toxicidade em levedura por crescimento de culturas líquidas
Este protocolo é o mais quantitativa (OD600 números) dos três ensaios descritos aqui e pode até mesmo detectar diferenças muito subtis na toxicidade poliQ. O referido ocrência de supressores espontâneos, no entanto, pode potencialmente produzir resultados enganosos. Por conseguinte, combinando recomendam neste ensaio, com pelo menos um dos dois ensaios de revestimento descritas acima. Propomos a utilização do instrumento BioscreenC para estas experiências. O BioscreenC é um instrumento que mede automaticamente a densidade óptica de culturas de leveduras em 100 poços enquanto incubadas a temperaturas definidos, com agitação definido. Outros métodos para o crescimento de células de levedura e medindo a sua densidade óptica pode também aplicar.
- Lave as células de levedura a partir de meio mínimo contendo glucose como única fonte de carbono três vezes em 3 ml de água estéril.
- Diluir as culturas durante a noite cultivadas em meio com galactose a uma OD 600 de 0,1.
- Encher cada poço da placa 100-BioscreenC bem com 300 uL das culturas de leveduras.
- Abra o programa Experimento Fácil Bioscreen. Determinar o número de amostras que você deseja monitorar (incluindo espaços em branco e meio-somentecontroles), definir a temperatura a 30 ° C, definir a duração dos experimentos 3 dias, definir os intervalos de medição de 15 minutos, definir o filtro para 600 nm / Brown, e definir o modo de agitação para 15 segundos antes de cada medição de força média.
- O instrumento BioscreenC eo software anexo irá produzir planilhas do Excel de cada ponto de dados obtidos durante o experimento.
- Preparar curvas de crescimento com o Excel para cada amostra e comparar o crescimento de amostras diferentes (Figura 2c). Uma descrição detalhada da análise dos dados produzidos por experiências BioscreenC foi fornecida antes de 10.
4. Os resultados representativos
Figura 1. A levedura modelo poliQ. a) representação esquemática do poliQ expansão-b proteína tóxica.) A microscopia de fluorescência mostrando células de levedura que expressam um curto, não-tóxico poliQcélulas de proteína de expansão (25Q, painel da esquerda) e levedura que expressa um longo, a proteína poliQ expansão tóxico (painel, 103.oQ direita).
Figura 2. Os resultados representativos de ensaios de crescimento de células de levedura que expressam poliQ de expansão-proteínas. a) ensaio de plaqueamento. Aproximadamente 700 células de levedura foram espalhadas em placas e incubadas durante três dias a 30 ° C. O painel superior mostra uma placa de meio contendo glucose, ou seja, a expressão da proteína poliQ expansão tóxico (103.oQ) não é induzida. O painel inferior mostra uma placa de levedura contendo o meio de galactose, ou seja, a expressão da proteína poliQ expansão-tóxico é induzida. Note-se que na experiência mostrada aqui, nenhum supressor espontânea ocorreu. B) Spotting ensaio. Cinco série de cinco diluições de células de levedura ou abrigando um não-tóxico proteína poliQ (25Q) ou um tóxico poliQ-expansão protein (103.oQ) foram manchados em placas de glicose que reprimem a expressão das proteínas (painel da esquerda) ou em placas de galactose, que induzem a sua expressão. As placas foram então incubadas durante três dias a 30 ° C. c) experimento BioscreenC. O crescimento de culturas de células de levedura que expressam, quer uma proteína não-tóxico poliQ (25Q) ou uma proteína poliQ expansão tóxico (103.oQ) foram monitorizados pela instrumento BioscreenC. As condições experimentais e da análise dos experimentos BioscreenC são descritos no texto principal.
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Discussion
Este manuscrito descreve três abordagens complementares experimentais para medir poliQ toxicidade no organismo levedura modelo baseado na redução do crescimento de células de levedura que expressam tóxicos poliQ expansão de proteínas. Trabalho em levedura ofereceu profundos insights sobre os mecanismos básicos celulares e moleculares da misfolding proteína e sua toxicidade que se seguiu, incluindo o misfolding e toxicidade de poliQ expansão de proteínas 9,11,12. Experimentos baseados em protocolos aqui apresentados já ajudou a identificar e caracterizar potenciadores genéticos ou supressores de toxicidade poliQ, modificadores de moléculas pequenas de toxicidade poliQ e mecanismos celulares subjacentes poliQ toxicidade 5-8,13,14.
Os protocolos apresentados podem ser facilmente adaptados para explorar outros modificadores de poliQ toxicidade, tais como diferentes condições de crescimento ou mutações genéticas que reduzir ou exacerbar toxicidade poliQ. Além disso, o protocolo experimental apresentoupode ser facilmente ajustado para testar a toxicidade de outras proteínas deformadas tóxicos em levedura.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Trabalho em laboratório Duennwald é suportado por concessões da Federação Americana para Pesquisas sobre o Envelhecimento (AFAR), a Fundação doença hereditária (HDF) e da Fundação William Wood.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Frogger (6x8 pins) | V&P Scientific | VP 407 AH | |
| BioscreenC | Growth Curves USA | 5101370 | |
| 100-well Honeycomb plates | Growth Curves USA | 9602550 |
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