Groei Testen om de polyglutamine toxiciteit in gist beoordelen

Summary

Dit manuscript beschrijft drie aanvullende protocollen voor de beoordeling van de toxiciteit van polyglutamine (polyQ)-uitbreiding van eiwitten in de gist

Abstract

Eiwit misfolding gaat gepaard met veel ziekten, in het bijzonder neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, en Huntington ^1. Ziekte van Huntington (HD) wordt veroorzaakt door de abnormale groei van een polyglutamine (polyQ) regio van het eiwit huntingtin. De polyQ-uitgebreide huntingtine eiwit bereikt een afwijkende conformatie (dat wil zeggen dat misfolds) en veroorzaakt cellulaire toxiciteit ^2. Minstens acht andere neurodegeneratieve ziekten worden veroorzaakt door polyQ-uitbreidingen, waaronder de spinocerebellaire ataxieën en Kennedy de ziekte van ^3.

Het modelorganisme gist heeft vergemakkelijkt belangrijke inzichten in de cellulaire en moleculaire basis van polyQ-toxiciteit, met inbegrip van het effect van de intra-en inter-moleculaire factoren van polyQ-toxiciteit, en de identificatie van cellulaire mechanismen die worden geremd in cellen die polyQ-expansie eiwitten ^3-8. Belangrijkly, werden vele aspecten van polyQ-toxiciteit die werden gevonden in gist gereproduceerd in andere experimentele systemen en tot op zekere hoogte in monsters van HD-patiënten, waaruit blijkt het belang van het gist-model voor de ontdekking van fundamentele mechanismen die ten grondslag liggen polyQ-toxiciteit.

Een directe en relatief eenvoudige manier om polyQ-toxiciteit te bepalen in gist is het meten van groeistoornissen van de gist-cellen die polyQ-expansie eiwitten. Dit manuscript beschrijft drie complementaire experimentele benaderingen van polyQ-toxiciteit vast te stellen in gist door het meten van de groei van gist-cellen die polyQ-expansie eiwitten. De eerste twee experimentele benaderingen volgen gistgroei op de borden, de derde benadering houdt toezicht op de groei van de vloeibare gist culturen met behulp van de BioscreenC instrument.

Bovendien, dit manuscript beschrijft experimentele moeilijkheden die zich kunnen voordoen bij het hanteren van gist polyQ modellen en schetst de strategieën die zullen helpen om of te vermijdenminimaliseren van deze problemen. De hier beschreven protocollen kunnen worden gebruikt om vast te stellen en genetische routes en kleine moleculen die polyQ toxiciteit moduleren karakteriseren. Bovendien kan de beschreven assays als sjablonen voor nauwkeurige analyse van de toxiciteit die door andere ziekte-gerelateerde gevouwen eiwitten in gist modellen.

Protocol

1. Expressie van Toxic polyQ-uitbreiding eiwitten in gist

Een systematische analyse heeft het de precieze aminozuursequentie van een polyQ-expansie eiwit dat moet toxiciteit bij gist ^7. Dit toxische polyQ-expansie eiwit bevat een amino-terminale FLAG-tag gevolgd door 17 aminozuren van de originele sequentie van het eiwit huntingtin een polyQ regio en een carboxy-terminale fusie met een fluorescent protein (GFP een of CFP, zie figuur 1 a). De expressie van eiwitten met polyQ uitbreidingen van 46 glutamines of meer (bijvoorbeeld 72 en 103 glutamines) produceert toxiciteit in gist uitgedrukt onder de controle van de induceerbare en relatief sterke promoter GAL1 ^{7, 9.}

Zoals eerder beschreven polyQ toxiciteit gist alleen zichtbaar in cellen die het eiwit Rnq1p voeren in de prion conformatie [RNQ +], bijvoorbeeld de giststam W303 ^9. De toxische polyQ-uitbreiding eiwit recapitulates centrale aspecten van polyQ-biologie in gist, zoals polyQ lengte-afhankelijke toxiciteit (zie hieronder) en aggregatie (figuur 1 b). Met name niet giftig polyQ-uitbreiding eiwitten niet onmiddellijk te doden gistcellen, ze eerder schaden of de aanhouding van de celcyclus en mobiele divisie, waardoor vertragen of het remmen van de groei van gist kolonies op platen of vloeibare culturen (onze niet-gepubliceerde gegevens).

2. Mogelijke problemen met gist-cellen die Toxic polyQ-expansie Eiwitten

Gist cellen die de anders giftige polyQ uitbreiding eiwitten kunnen geen enkele groei gebrek ^9. De aard van deze genetische onderdrukkers van polyQ toxiciteit lijkt niet gebaseerd op eenvoudige Mendeliaanse mutaties en kan dus optreden bij relatief hoge frequentie (onze gepubliceerde resultaten). We veronderstellen dat deze spontaan onderdrukkers worden veroorzaakt door het uitharden van onbekende prions die functioneren op dezelfde wijze [RNQ +] te bepalen polyQ toxicity.These spontane onderdrukkers van polyQ toxiciteit kan afbreuk doen aan de succesvolle uitkomst van een experiment dat tot doel heeft polyQ toxiciteit te karakteriseren of het identificeren en karakteriseren van modifiers polyQ toxiciteit.

Met het oog op het veelvuldig voorkomen van deze spontane onderdrukkers te vermijden, volg dan de voorzorgsmaatregelen hieronder geschetste maatregelen, die hebben bewezen zeer effectief te zijn:

1. Gebruik verse gist cellen voor toxiciteit experimenten. Bewaar geen gist voor langere tijd. Vaak halen verse gist kolonies van bevroren voorraden.
2. Vaak volgen de expressie en aggregatie van giftige polyQ-uitbreiding eiwitten met behulp van fluorescentie microscopie.
3. Houd de gistcellen in de media dat de expressie van de toxische polyQ toxiciteit te allen tijde (dus in selectieve media met glucose als enige koolstofbron) te onderdrukken voordat u begint met een toxiciteit metingen.
4. Gebruik ten minste drie onafhankelijke transformanten voor elke polyQ-toxiciteit experiment. </ Li>

3. Groei Assays

1. Voor elke experimentele conditie inoculeren een kolonie elk van drie onafhankelijke transformanten gist cellen die het giftige polyQ-expansie eiwit in 3 ml selectieve gist media met glucose als enige koolstofbron.
2. 'S nachts Incubeer deze culturen bij 30 ° C. Onder deze omstandigheden worden de cellen niet de uiting van de polyQ-uitbreiding eiwit, omdat de glucose in het medium verdringt hun expressie. Laat deze culturen overwoekeren, houden de OD ₆₀₀ (absorptie van het licht van 600 nm golflengte) van het 's nachts culturen onder 1.
3. We routinematig gebruik van drie verschillende tests om de groei gebreken van gist cellen die de giftige polyQ-expansie eiwit te bewaken:

3,1 Groei op platen

1. Verdun de nacht gistculturen (gegroeid met 220 toeren per minuut schudden) om een OD ₆₀₀ van 0,0005 (dwz een 1:1000 verdunning van een OD600 = 0,5 cultuur) in selectieve media ⁷ bevattende glucose.
2. Gespreid 50 ul (gevolg ca. 700 kolonies per plaat) van elke verdunde cultuur op een plaat (10 cm diameter) met selectief medium dat glucose als enige koolstofbron en een plaat met selectief medium met galactose als enige koolstofbron.
3. Incubeer de platen gedurende drie tot vier dagen bij 30 ° C. Na de incubatie, fotograferen van elke plaat en tellen van het aantal kolonies op de glucose en het aantal kolonies op de galactose platen. Onder ideale omstandigheden, moet er geen of slechts zeer weinig kolonies op de galactose plaat bij het gebruik van gist-cellen die een zeer giftig polyQ-expansie eiwit (103 octodecies, figuur 2a).

3,2 Spotting assays

Deze test is kwantitatief dan de beplating assay beschreven en dus licht zelfs kleine verschillen in polyQ toxiciteit hetzelfde experiment op dezelfde plaat.

1. Verdun de overnechts culturen gekweekt in medium met glucose een OD ₆₀₀ van 0,1.
2. Pipetteer 200 ul van deze verdunde culturen in steriele 96-wells platen en bereiden vijf vijfvoudige seriële verdunningen in steriel water en een multi-kanaal pipet.
3. Een frogger (ook wel spotter met 8 x 6 kunnen voor de overdracht van celsuspensies) overdragen van de celsuspensies op platen die selectieve media met glucose als enige koolstofbron en platen die selectieve media met galactose als enige koolstofbron.
4. Dat de platen drogen voordat ze incuberen bij 30 ° C gedurende drie tot vier dagen.
5. Na de incubatie, fotograferen van elke plaat (figuur 2b).

3.3. Monitoring polyQ toxiciteit in gist door de groei van vloeibare culturen

Dit protocol is de kwantitatieve (OD600 aantal) van de drie technieken beschreven en kunnen zelfs detecteren zeer kleine verschillen in polyQ toxiciteit. De genoemde ocCurrence van spontane onderdrukkers, maar kan mogelijk misleidende resultaten opleveren. I bevelen daarom combineren assay met ten minste een van de twee platen assays zoals hierboven beschreven. Wij stellen voor om de BioscreenC instrument te gebruiken voor deze experimenten. De BioscreenC is een instrument dat automatisch meet de optische dichtheid van gistculturen in 100-well platen, terwijl geïncubeerd bij bepaalde temperaturen met gedefinieerde agitatie. Andere methoden voor het kweken gistcellen en meten van de optische dichtheid kan eveneens.

1. Was de gistcellen van minimaal medium met glucose als enige koolstofbron driemaal in 3 ml steriel water.
2. Verdun de nacht culturen gekweekt in medium met galactose tot een OD ₆₀₀ van 0,1.
3. Vul elk putje van de 100-goed BioscreenC plaat met 300 ul van de gist culturen.
4. Open de Easy Bioscreen Experiment programma. Bepaal het aantal monsters dat u wilt controleren (inclusief spaties en middelgrote alleencontroles), stelt u de temperatuur tot 30 ° C, de lengte van de experimenten tot 3 dagen, de meetintervallen ingesteld op 15 minuten, stelt u de filter tot 600 nm / Brown, en stel het schudden mode tot 15 seconden voor elke meting op gemiddelde sterkte.
5. De BioscreenC instrument en de meegeleverde software zal produceren Excel-spreadsheets van elk gegevenspunt genomen tijdens het experiment.
6. Bereid groeicurven met Excel voor elk monster en vergelijken groei van verschillende monsters (figuur 2c). Een gedetailleerde beschrijving van de analyse van gegevens van BioscreenC experimenten is voorzien voor ^10.

4. Representatieve resultaten

Figuur 1. De gist polyQ model. a) Schematische weergave van de toxische polyQ-expansie eiwit. b) Fluorescentiemicroscopie met gist-cellen die een korte niet-toxische polyQuitbreiding van eiwit (25Q, linker paneel) en gist cellen die een lange, giftige polyQ-expansie eiwit (103 octodecies, rechter paneel).

Figuur 2. Representatieve resultaten van de groei assays van gistcellen expressie polyQ-expansie eiwitten. a) Plating assay. Ongeveer 700 gistcellen werden uitgespreid op platen en gedurende drie dagen bij 30 ° C. Het bovenste paneel toont een plaat met glucose medium, namelijk de expressie van de toxische polyQ-expansie eiwit (103 octodecies) niet geïnduceerd. Het onderste paneel toont een gist plaat met galactose-medium, dat wil zeggen de uitdrukking van de toxische polyQ-expansie eiwit wordt opgewekt. Merk op dat in het experiment hier geen spontane suppressor plaatsgevonden. B) signaleren assay. Vijf achtereenvolgende vijf-voudige verdunningen van gistcellen herbergen hetzij een niet-toxisch polyQ eiwit (25Q) of een toxische polyQ-expansie protein (103 octodecies) werden gespot op glucose platen dat de expressie van de eiwitten (linker paneel) of op galactose platen die hun expressie te induceren te onderdrukken. De platen werden vervolgens geïncubeerd gedurende drie dagen bij 30 ° C. c) BioscreenC experiment. De groei van kweken van gisten cellen die ofwel niet-giftige polyQ eiwit (25Q) of een toxische polyQ-expansie eiwit (103 octodecies) werden gecontroleerd door de BioscreenC instrument. De experimentele omstandigheden en de analyse van de BioscreenC experimenten beschreven in de tekst.

Discussion

Dit manuscript beschrijft drie complementaire experimentele benaderingen van polyQ-toxiciteit te meten in het modelorganisme gist op basis van verminderde groei van de gist-cellen die giftige polyQ-expansie eiwitten. Werk in gist heeft aangeboden diepgaande inzichten in de fundamentele cellulaire en moleculaire mechanismen van eiwitten verkeerd vouwen en de daaruit voortvloeiende toxiciteit, met inbegrip van het verkeerd vouwen en de toxiciteit van polyQ-expansie eiwitten ^9,11,12. Experimenten op basis van de protocollen hier gepresenteerde hebben al te identificeren en karakteriseren van genetische enhancers of onderdrukkers van polyQ toxiciteit, kleine molecule modifiers van polyQ toxiciteit, en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen polyQ toxiciteit ^5-8,13,14.

De gepresenteerde protocollen kunnen gemakkelijk worden aangepast aan andere factoren van polyQ toxiciteit, zoals verschillende groeiomstandigheden of genetische mutaties die ofwel te verminderen of verergeren polyQ toxiciteit te ontdekken. Bovendien is de weergegeven experimentele protocolkan gemakkelijk worden aangepast aan de toxiciteit van andere toxische gevouwen eiwitten in gist getest.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Frogger (6x8 pins)	V&P Scientific	VP 407 AH
BioscreenC	Growth Curves USA	5101370
100-well Honeycomb plates	Growth Curves USA	9602550