Summary
Her beskriver vi en fremgangsmåde til direkte at visualisere microregional vævshypoxi i mus cortex
Abstract
Hjernens evne til at fungere ved høje niveauer af metabolisk behov afhænger kontinuerlig oxygentilførsel ved blodgennemstrømning og væv oxygendiffusion. Her præsenterer vi en visualiseret eksperimenterende og metodisk protokollen til direkte at visualisere microregional vævshypoxi og at udlede perivaskulære ilt gradienter i musen cortex. Det er baseret på den ikke-lineære forhold mellem nicotinamid-adenin-dinucleotid (NADH) endogene fluorescensintensitet og oxygenpartialtryk i det væv, hvor observeret væv NADH fluorescens brat stiger på væv iltindholdet under 10 mmHg 1. Vi bruger to-foton excitation ved 740 nm, hvilket giver mulighed for samtidig excitation af iboende NADH væv fluorescens og blodplasma i kontrast til Texas-Red dextran. Fordelene ved denne fremgangsmåde i forhold til eksisterende fremgangsmåder omfatter følgende: den udnytter en iboende væv signal og kan udføres ved anvendelse af standard to-foton in vivo imaldrende udstyr, det giver mulighed for kontinuerlig overvågning i hele synsfeltet med en dybde opløsning på ~ 50 um. Vi viser, at hjernevæv områder længst væk fra cerebrale blodkar svarer til sårbare skelsættende områder, som er den første til at blive funktionelt hypoxisk efter et fald i vaskulær iltforsyning. Denne metode giver en til billede microregional cortical iltning og er derfor anvendelig til at undersøge rollen af utilstrækkelig eller begrænset væv iltforsyning i neurovaskulære sygdomme og slagtilfælde.
Protocol
1. Klargøring af dyret for billedbehandling
Bemærk: Vi bruger voksne C57BL mus. Forskellige transgene stammer kan anvendes afhængigt af problemstilling. Mikrovaskulære operationer og pulsoximetri lettes i mus med hvid pels (f.eks FVB stamme).
- Forbered operationsstedet på bænken. Alle kirurgiske instrumenter skal autoklaveres eller desinficeres med 70% ethanol.
- Indsætte en rektal probe og kontinuerligt at måle dyrets krop temperatur under hele proceduren
- Bedøve mus først benyttede 5% isofluran. I 15-30 s, når dyret bevæger sig ikke placere den på en varmepude (37 ° C), og anvende en ansigtsmaske til kontinuerlig levering af luft, som indeholder 1,3-1,5% isofluran). Sørg for, at dyret ikke reagerer på en smerte stimulus (fx hale knivspids).
- Brug kunstige tåre gel til at dække musens øjne, for at undgå udsættelse for tør luft.
- Ved hjælp af en elektrisk barbermaskine, fjerne hår from hovedet og fra begge lår. Anvend hår remover (f.eks Nair) til låret i 2 min, og derefter tørre det omhyggeligt for at fjerne den resterende hår. Dette lår vil blive anvendt til oximetri.
- Desinficere hovedbunden anvendelse af en 10% povidon-iod-opløsning og 70% ethanol.
2. Forberedelse det åbne kraniet kranie vindue
- Start 5 mm caudalt til kraniet, gør et snit i hovedbunden med en saks, og gå en centimeter. Flyt hud til siderne for at eksponere kraniet.
- At fjerne membranerne på toppen af kraniet anvendelse 10% ferrichloridopløsning til toppen af kraniet. Tør overskydende opløsning, og skrab membranerne væk med 45 ° vinkel # 5 pincet. Det er vigtigt at forberede stedet omhyggeligt for at sikre, at hovedet pladen kan være sikkert fastgjort til kraniet (trin # 4-6).
- Ved hjælp af en dissektion mikroskop området af interesse at identificere. Bemærk, at de kraniale suturerne bør undgås, fordi kraniet cen bryde uforudsigeligt langs disse linjer.
- Et tyndt lag med hurtig lim (f.eks Locktite 454) omkring kanterne af vinduet af toppladen (figur 1). Placer toppladen på en sådan måde, at området af interesse er eksponeret i vinduet. Et let tryk på hovedet pladen. Anvende en lille mængde af dentalcement at polymerisere limen hurtigt. Hold i 10 sekunder, mens limen polymerisering.
- Anvende en lille mængde af hurtig lim til kanten af vinduet til at tætne toppladen og kraniet. Skru hovedet pladen til dyret indehaveren under dissektion omfang.
- Brug af Microtorque II boret sat ved 6000 omdrejninger i minuttet og en IRF 005 borehoved, fjerne alle ekstra lim fra kraniet og fra hovedet pladen. Enhver resterende lim på toppladen skal fjernes, da det ellers vil interferere med binding af glasdække.
- Indstillet boret ved 1000 rpm, og begynde at bore kraniet ved at foretage en cirkel i toppladen vinduet diameter ~ 5 mmeter. Brug lyse fejende bevægelser, som hvis du tegner med en meget blød blyant. Standse boringen hver 20-30 sekunder til fjernelse af knogleaffald støv ved hjælp af komprimeret luft.
Bemærk: Formen af åbningen i hovedet pladen giver yderligere adgang til boret (til venstre-og højrehåndede kirurg), hvilket gør det lettere at skabe en cirkulær kraniel vindue. Desuden giver de to ulige formede huller den nødvendige plads til at indsætte en Clark-elektrode eller glas-elektrode i hjernevæv under kraniale vinduet yderligere polarografiske eller elektrofysiologiske målinger. - Som boringen skrider frem, er en hule dannet omkring den intakte kraniet i midten. Vær omhyggelig med ikke at stikke igennem den fortyndede kraniet, men at gøre denne hule af ensartet tykkelse. Vær ekstra forsigtig omkring store blodkar, de bør ikke bringes i fare, og, om muligt, ikke engang rørt.
- Anvende en "ben" af pincetter # 3 for at løfte ("svirp off") knoglen i midten af vinduet. Påfør en dråbe artificIAL cerebrospinalvæske (aCSF) på vinduet.
- Tør aCSF forsigtigt ved hjælp af et hjørne af blødt væv papir (f.eks Kimwipe). Sædvanligvis dura er beskadiget i en eller flere steder langs kanten af vinduet. Start på et af disse steder, forsigtigt løfte og derefter fjerne dura fra hjernen overfladen, med 45 ° vinkel pincet # 5. Ved valg af det sted, som til at begynde at fjerne dura, undgår de tilstødende områder store blodkar. Hvis der opstår blødning, anvende en dråbe aCSF og vente i 2-3 minutter for mindre blødning at stoppe.
- Forberede 0,07% lavt-smeltende agarose opløst i aCSF) bringes den smeltede agarose til kropstemperatur. Tør over aCSF fra overfladen af hjernen. Hæld agarose i vinduet, og tildækkes med en glasplade. Tryk glasset forsigtigt for at foretage en kontakt mellem glasset og toppladen, og vent 10-20 sek, indtil agarosen er fast.
- Fjern overskydende agarose fra glasset dækslet med en pincet og blødt væv papir.
- Put en lilleMængden af hurtig lim omkring glasset at lime glasset til toppladen. Anvende en lille mængde af dentalcement at størkne limen (figur 1).
3. Intravenøs injektion og blodets iltning overvågning
Bemærk: Vi rutinemæssigt anvendes den femorale vene til intravenøs anvendelse af Texas rødt stedet halevenen. Dette skyldes femoralvenen injektioner giver sikker og reproducerbar bolusinjektioner af farvestoffet.
- Dreje dyret delvis over for at blotlægge det indre af venstre lår. Anvende tape for at sikre at dyret i denne position.
- Anvendelse antiseptisk krat, og derefter 100% ethanol til huden.
- Lav et snit langs den mediale lår fra knæet til symfysen. Separate blødt væv ved stump dissektion ved hjælp af en pincet # 5.
- Fylde 1 ml sprøjte med 130 ul Texas Red (2,5 mg / ml). Påsæt en ny nål (gauge 30), og bøje det forsigtigt ved 30 °, holder facet op. Fyld nålen with Texas Red-opløsning.
- Under dissektion mikroskop kanylen i den femorale vene og injicere 100 pi af Texas Red. Tag nålen af og let tryk på venen med gaze for at stoppe blødningen.
- Lukke huden med 4-0 suturer.
- For løbende overvågning af blod SpO 2 (for at sikre tilstrækkelig blodets iltning) placerer oximeterprobe på højre lår (hvorfra håret tidligere blev fjernet).
4. To-foton billeddannelse
Bemærk: Vi bruger et Olympus Fluoview1000 multiphoton imaging system (opretstående) med et Spectra-Physics Maitai HP DeepSee femtosekund Ti: Sa-laser som en excitationskilde. For billedbehandling, bruger vi × 10 NA 0,45 (Zeiss C-Apochromat), eller × 25 NA 1,05 (Olympus XLPlan N) vand-nedsænkning mål. Vi tager billeder på 12-bit dybde med en opløsning på 512 × 512 pixels med en pixel opholdstid på 2 mikrosekunder. Den NADH og Texas-Red-dextran er samtidig glade ved 740 nm, og fluorescence er adskilt fra det exciterende lys med et dikroisk spejl / nær-IR-blokerende filter kombination (FF665-DI01, FF01-680/SP, Semrock, Rochester, NY, USA) opdelt i to kanaler ved hjælp af et dichroisk spejl (505DCXRU, kulørthed , Rockingham, VT, USA), og båndpasfiltreres (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36). Laser effekt måles efter målet var 10-20 mW for billeddannelse i lag I og 20-50 mW for billeddannelse i lag II.
- Overføre kirurgisk forberedt mus til mikroskopbordet. Tag et indledende billede af kranie vinduet websted ved hjælp af lys feltbelysning på 4x forstørrelse til at bruge den som reference kort til registrering med højere forstørrelse to-foton angiografi.
- Zoom ind på området af interesse bruger × 10 forstørrelse. Vælge et område af interesse i corticale lag I eller II (op til 150 um under pial overflade). Hvis højere forstørrelse ønskes, anvendes × 25 objektiv
- Recordstart tidsserien (FiguAd 2). Vi anbefaler anvendelse af en gennemsnitlig 3-5 rammer at øge kvaliteten af billedet.
- Inducere hypoxæmi ved tilsætning af 50% N2 til den luft, dyret vejrtrækning. Dette vil bringe O2 niveauet til 10%. Kontrollere hypoxæmi ved overvågning oximeter data.
- Fortsætte til at registrere den tid serie gennem hypoxæmi (for eksempel til 30 sekunder), og efter normal O2 niveau er genoprettet.
- Indsamle data til beregning af den ilt distributionen ved at registrere, måle og kvantificere området for hypoxi og iltet væv cylindre omkring blodkarrene.
5. Databehandling
- Bestemme Krogh vævet cylinderens radius R. Dette kan gøres manuelt (fig. 3) ved måling af afstanden mellem midten af blodkarret og den grænse, hvor høj NADH fluorescens detekteres.
- Alternativt kan du bruge den beregningsmæssige investigator-uafhængig semi-automatiseret bestemmelse af vævet cylinder radius R og centrale blood fartøj r, der er blevet beskrevet tidligere 1 i supplerende form, og sammenfattes i diskussionen i denne protokol.
- Bestem området hypoxi bruge open-access billede analyse software, f.eks ImageJ. For at gøre dette, bruger NADH signal, definerer en tærskel, der afgrænser det høje NADH intensitet område, og derefter måle området med forhøjet NADH væv fluorescens.
6. Repræsentative resultater
Figur 2 viser en video af NADH / angiografi billeder under forbigående hypoxæmi (til PDF-version af denne figur, har valgt stillbilleder blevet brugt). Den inspirerede oxygen-koncentrationen blev sænket fra 21% til 10% i en periode på 3 min. Dette niveau af eksperimentelt induceret hypoxæmi er tilstrækkelig til at inducere kraftig hypoksi i hjernebarken. Hypoxi førte til en stigning i NADH fluorescens, først i de områder, der var længst væk fra den arterielle blodforsyning. Bemærk den skarpe NADH vævetgrænser, som repræsenterer observerbare væv grænser oxygendiffusion fra den korticale mikrocirkulationen. Billedet i figur 3 viser geometrien af oxygendiffusion grænser omgivende cerebrale kar. Er det muligt at udlede Krogh cylinder diametre fra disse grænser, som beskrevet tidligere 1.
Figur 1 (a) mus med kraniel vindue fremstillet til billeddannelse. (B) Mål på hovedet plade.
Figur 2. Endogen NADH grøn fluorescens visualiseret med to-foton billeddannelse gennem kraniale vinduet cirka 50 um under pial overfladen. Blodkar er visualiseret med Texas Red dextran. Oxygen i inhaleret luft blev reduceret til 10% i 3 minutter, og derefter restaureret for 21%. Målestok: 50 um.
<img alt = "Figur 3" src = "/ files/ftp_upload/3466/3466fig3.jpg" />
Figur 3. Geometri af NADH fluorescens grænser. Gul beskrivelse viser grænsen for funktionel hypoksi, blå cirkler viser beregnede oxygeneret (Krogh) cylindre. Blå linier viser cylinder radier; tal viser radier i mikrometer.
Discussion
Høj rumlig opløsning information om oxygendiffusion er vigtigt at forstå, hvordan blodgennemstrømning i hjernen reguleres for at tilvejebringe oxygen til hjerneceller, og opfylde metaboliske behov. Traditionelle polarografiske ilt målinger ved hjælp af Clark-stil glaselektroderne er meget invasive og har lav rumlig opløsning 2-3 og signifikant (anden række) responstid. Hidtil eneste ikke-invasiv metode til måling af pO2 i hjernevæv er phosphorescens quenching, hvor hastigheden af nedbrydning af den exciterede proben er proportional med oxygenkoncentrationen 4. Denne metode giver nøjagtige iltkoncentrationer, men kræver en proprietær farvestof og en teknisk avanceret fosforescens levetid imaging system. Her viser vi en enkel, enklere tilgang, der kan gennemføres på en standard to-foton imaging system med to flurescence kanaler. Vores fremgangsmåde drager fordel af en indre væv signal 5 ennd kræver kun kontrasterende visualisering af cortical mikrocirkulation. Grund af den ikke-lineære, i det væsentlige binær forøgelse af NADH fluorescens ved funktionelt at begrænse oxygenkoncentrationer en øget iboende NADH fluorescens observeres kun i områder med betydeligt, metabolisk begrænsende hypoxi. En vigtig implikation er, at væv grænser iltdiffusion fra corticale mikrokar direkte ses af cylinderformede intensitet ændringer af endogen NADH fluorescens. Vi henviser til disse strukturer, som Krogh cylindre, idet konceptet cylindrisk formede strukturer, der definerer den oxygenerede volumen væv, som omgiver et blodkar blev indført i august Krogh, og er for nylig blevet eksperimentelt observeret ved anvendelse af to-foton NADH billeddannelse 1. Krogh cylindre billeder kan opsamles i 3D ved at tage en z-stak af billedrammer. De er især fremtrædende i nærheden af gennemtrængende arterioler og de er kongruent vidh kapillærrør forarmet periarteriolar væv cylindre 1,4.
At tilvejebringe en objektiv bestemmelse af Krogh vævet cylinderens radius R (se afsnit 5.2) målte vi deres radiale pixelintensitetsniveauerne værdier inden for et veldefineret segment mellem midten af cylinderen og den ydre afgrænsning ved hjælp af Matlab funktionen "improfile". Den ydre grænse af segmentet skal vælges til at strække sig med en sikkerhedsmargen over det synlige grænse. At forbedre signal-støj-niveau vi averageed i alle radiale linier, der er nødvendige for at dække det synlige cylindersegmentet ved 1 ° trin. Den resulterende gennemsnitlige radiale intensitet profil inden for segmentet viste en kraftig stigning, der svarede til den synlige vævet grænsen R. Det, vi passer en S-formet funktion (f.eks Boltzmann-funktion) til gennemsnitlige radiale intensitet profil og brugt sit vendepunkt (også kendt som x 0) som en definition af R. De tilsvarende to-photon microangiography (Texas-rød) viste tværsnit af en enkelt central blodkar i centrum af cylinderen. Diameteren af den centrale blodkar kan anvendes direkte til at bestemme r.
To-foton NADH billeddannelse tilvejebringer den samme rumlige opløsning som samtidig høj opløsning billeddannelse af den korticale microangiography. Et vigtigt træk til kvantitativ anvendelse af denne fremgangsmåde er, at p 50 NADH fluorescens stigningen er blevet målt til at være 3,4 ± 0,6 mm Hg 1, og at NADH fluorescensintensiteten som en funktion af microregional væv pO2 kan matematisk beskrevet med en sigmoidal funktion. . Vi viser, at denne teknik tillader en at identificere områder i hjernen, der er mest sårbare over for hypoksi (ved at reducere oxygenindholdet i luften til 10%). Vi viser også, at iltdiffusion følger en simpel geometrisk perivaskulær mønster.
Et crittisk trin til denne fremgangsmåde, er kvaliteten af den kraniale vinduet præparat. Operationen må frembringe minimal skade for ikke at forstyrre blodstrømmen til det blotlagte område. En bekymring er, at i et kirurgisk kompromitteret præparat, kan cortex under vinduet være hypoxisk til at begynde med, udelukker enhver meningsfuld eksperimenter. En velforberedt kraniel vindue skal have intakte store og små blodkar med levende blodgennemstrømningen i alle skibstyper, og ingen væsentlig blødning langs kanterne. Under normoxiske forhold (PaO2 80-100 mmHg, Sp O2 97-99%) i hjerneparenkymet skal udvise en ensartet, homogen NADH fluorescens uden iøjnefaldende, lyse væv pletter med forhøjet NADH fluorescens.
En fundamental fysisk begrænsning i vores tilgang er begrænset dybde penetration. Den blågrønne NADH fluorescens i hjernen hurtigt dæmpes hæmoglobin absorption og væv lysspredning ved disse bølgelængder. Selv med høj numerisk apertur (f.eks 1,05) vandnedsænkning mål to-foton NADH imaging er i øjeblikket begrænset til cortical lag I og II. Denne begrænsning er fagligt relevant, fordi energiomsætningen i eller i nærheden af hvid substans sandsynligvis vil afvige fra grå stof. Imidlertid vil undersøgelse af dybe corticale strukturer, såsom lag IV-VI eller subkortikale strukturer såsom hvide substans skrifter eller striatum kræve anvendelse af specialiserede mikrolinser som beskrevet i musen cortex in vivo 6.
NADH-baserede målinger af oxygendiffusion grænser kan være særligt nyttigt, når den kombineres med andre målinger, såsom analyser af funktionelle hyperæmi, og detektion af kapillære fluxhastigheder 7. For eksempel kan denne teknik være indrettet til at visualisere hypoxi ved slagtilfælde og Alzheimers sygdom (AD)-modeller. Den simple geometri oxygendiffusion gør det muligt at forudsige oxygen gradient i mikrovaskulære senge under omstændigheder, hvor kapillær densitet er deøget 8 (f.eks AD 9), og at undersøge, om hjernevæv regioner med nedsat kapillær tæthed er i øget risiko for iltmangel skader som følge af microstrokes. Evnen til at afbilde microregionally også gør det muligt at undersøge geometri og størrelse væv microstrokes og bestemme mængden af væv, hvori hypoxi forekommer, såvel som forholdet mellem vævshypoxi og efterfølgende neuronal død eller kapillær remodellering 10.
Endelig, da stigninger i endogen NADH fluorescens er en direkte følge af akut mitokondriel dysfunktion, denne metode giver mulighed for at bruge NADH billeddannelse som en specifik reporter for neurale energistofskiftet 11 og en proxy for mitokondriel dysfunktion.
Som konklusion er to-foton-billeddannelse af endogent NADH fluorescens et simpelt, krævende værktøj, som kan anvendes til at forstå ilttilførsel og forbrug i hjernen under både normaleog i patologiske tilstande.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Maiken Nedergaard (University of Rochester Medical Center) for hovedet pladen design. Arbejdet har været støttet af NIH priser til SD (R01DA026325 og P30AI078498 og fondsmidler til KK (DANA fundament Brain and Immunoimaging program, American Heart Association 0635595T og ALS Association [# 1112)]).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heating pads | Beyond Bodi Heat | ||
| Ophthalmic ointment (Artificial tears) | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Povidone-iodine 10% solution | Betadine Puredue Pharma | ||
| Ferric chloride 10% solution | |||
| Cement | Stoelting Co. | 51456 | |
| Cyanoacrylate 454 | Loctite | ||
| aCSF | Harvard Apparatus | 597316 | |
| Microtorque II handpiece kit | Pearson Assessments | R14-0002 | |
| IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| Forceps #5 | Fine Science Tools | 11295 | |
| Forceps #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| #0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu Corp. | HC125-02 | |
| Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Newport Corp. |
References
- Kasischke, K. A. Two-photon NADH imaging exposes boundaries of oxygen diffusion in cortical vascular supply regions. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 31, 68-81 (2011).
- Ndubuizu, O., LaManna, J. C.
- Sharan, M., Vovenko, E. P., Vadapalli, A., Popel, A. S., Pittman, R. N. Experimental and theoretical studies of oxygen gradients in rat pial microvessels. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 28, 1597-1604 (2008).
- Sakadzic, S. Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue. Nat. Methods. 7, 755-759 (2010).
- Vishwasrao, H. D., Heikal, A. A., Kasischke, K. A., Webb, W. W. Conformational dependence of intracellular NADH on metabolic state revealed by associated fluorescence anisotropy. J. Biol. Chem. 280, 25119-25126 (2005).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 15741-15746 (1998).
- Brown, W. R., Thore, C. R. Review: cerebral microvascular pathology in ageing and neurodegeneration. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 37, 56-74 (2011).
- de la Torre, J. C. Impaired brain microcirculation may trigger Alzheimer's disease. Neurosci. Biobehav. Rev. 18, 397-401 (1994).
- Brown, C. E., Boyd, J. D., Murphy, T. H. Longitudinal in vivo imaging reveals balanced and branch-specific remodeling of mature cortical pyramidal dendritic arbors after stroke. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 30, 783-791 (2010).
- Wilson, D. F., Erecinska, M., Drown, C., Silver, I. A. The oxygen dependence of cellular energy metabolism. Arch. Biochem. Biophys. 195, 485-493 (1979).
