Summary
Her beskriver vi en metode for å direkte visualisere microregional vevshypoksi i mus cortex
Abstract
Hjernens evne til å fungere ved høye nivåer av metabolsk etterspørsel avhenger kontinuerlig oksygentilførsel gjennom blodstrøm og vev oksygen diffusjon. Her presenterer vi en visualisert eksperimentell og metodisk protokoll til direkte visualisere microregional vevshypoksi og å antyde perivaskulær oksygen gradienter i musen cortex. Den er basert på ikke-lineært forhold mellom nikotinamid adenindinukleotid (NADH) endogen fluorescensintensiteten og oksygen partialtrykk i vevet, hvor observert vev NADH fluorescens brått øker på vev oksygennivået under 10 mmHg en. Vi bruker to-foton eksitasjon ved 740 nm som gjør det mulig for samtidig eksitasjon av egenverdi NADH vev fluorescens og blodplasma kontrastert med Texas-Rød dekstran. Fordelene med denne metoden fremfor eksisterende tilnærminger omfatter følgende: det tar fordel av en indre vev signal og kan utføres ved hjelp av standard to-foton in vivo imaldrende utstyr, det tillater kontinuerlig overvåking i hele synsfeltet med en dybde oppløsning på ~ 50 mikrometer. Vi viser at hjernevev områder lengst fra cerebrale blodkar tilsvare sårbare vannskille områder som er de første til å bli funksjonelt hypoksisk etter en nedgang i vaskulær oksygentilførsel. Denne metoden gjør det mulig å bilde microregional kortikal oksygenering og er derfor nyttig for å undersøke rollen utilstrekkelig eller begrenset vev oksygentilførsel i nevrovaskulære sykdommer og slag.
Protocol
1. Forberedelse dyret for bildebehandling
Merk: Vi bruker voksne c57BL mus. Ulike transgene stammer kan brukes avhengig av problemstillingen. Mikrovaskulære operasjoner og pulsoksymetri er tilrettelagt i mus med hvit pels (f.eks FVB belastning).
- Forbered kirurgiske området på benken. Alle kirurgiske instrumenter må autoklaveres eller desinfiseres med 70% etanol.
- Sett inn en rektal probe, og kontinuerlig måle dyrets kroppstemperatur hele prosedyren
- Anesthetize musen bruker i utgangspunktet 5% isofluran. I 15-30 s, når dyret ikke er i bevegelse, legg den på en varmepute (37 ° C), og bruke en ansiktsmaske for kontinuerlig levering av luft som inneholder 1.3 til 1.5% isofluran). Sørg for at dyret ikke reagerer på en smerte stimulus (f.eks hale klype).
- Bruk kunstig tåre gel å dekke musens øyne, for å hindre eksponering for tørr luft.
- Ved hjelp av en elektrisk barbermaskin, fjerne hår from hodet og fra begge lårene. Påfør hår remover (f.eks Nair) til låret i 2 min, og tørk den nøye for å fjerne gjenværende hår. Dette lår vil bli brukt til oksymetri.
- Desinfiser hodebunnen med en 10% povidonjodid løsning og 70% etanol.
2. Klargjøre det åpne hodeskallen cranial vindu
- Starte 5 mm kaudal til skallen, gjøre et snitt i hodebunnen med saks, og fremme en centimeter. Flytt huden til sidene for å avsløre skallen.
- For å fjerne membraner på toppen av skallen gjelde 10% Ferric klorid løsning til toppen av skallen. Tørk bort overflødig løsning, og skrap membraner unna med 45 ° vinkel # 5 pinsett. Det er viktig å forberede området nøye, for å sikre at hodet platen kan festes til skallen (trinn # 4-6).
- Ved hjelp av en disseksjon mikroskop, identifisere område av interesse. Merk at de kraniale suturer bør unngås fordi skallen cen pause uforutsigbart langs disse linjene.
- Påfør et tynt lag med rask lim (f.eks Locktite 454) rundt kantene på vinduet av hodet platen (figur 1). Plasser hodet plate på en slik måte at det området av interesse er eksponert i vinduet. Bruk lett press på hodet plate. Påfør en liten mengde dental sement til polymerisere limet raskt. Hold i 10 sekunder mens limet er polymerizing.
- Påfør en liten mengde rask lim til kantene på vinduet for å forsegle hodet plate og skallen. Skru hodet plate til dyret innehaveren under disseksjon omfang.
- Bruke Microtorque II drillen satt til 6000 rpm og en IRF 005 borekrone, fjerne all ekstra lim fra hodeskallen og fra hodet plate. Enhver gjenværende lim på hodet tallerkenen bør fjernes, siden det vil ellers forstyrre feste glassdekselet.
- Still drillen ved 1000 rpm, og starte boring hodeskallen ved å lage en sirkel inne i hodet plate vinduet, diameter ~ 5 mm. Bruk lette feiende bevegelser som om du tegner med en meget myk blyant. Stopp boring hvert 20-30 sekunder for å fjerne bein støv med trykkluft.
Merk: Formen på åpningen i hodet plate gir ytterligere adgang for borbits (for venstre-og høyrehendte kirurg), som gjør det enklere å lage en sirkulær kranial vindu. I tillegg de to rare hullene gi den nødvendige plass til å sette en Clark-elektrode eller glass-elektrode inn i hjernevevet under kraniale vinduet for ytterligere polarographic eller elektrofysiologisk målinger. - Som boring utføres, er en hule dannet rundt intakt hodeskalle i midten. Vær forsiktig så du ikke rote gjennom tynnet skallen, men å gjøre denne hule av jevn tykkelse. Vær ekstra forsiktig rundt store blodkar, de bør ikke bli kompromittert, og hvis mulig, ikke engang rørt.
- Bruk en "etappe" av pinsett # 3 å løfte ("flick off") benet i midten av vinduet. Påfør en dråpe artificIAL cerebrospinalvæsken (aCSF) på vinduet.
- Tørk aCSF forsiktig ved hjelp av et hjørne av mykt vev papir (f.eks Kimwipe). Vanligvis dura er skadet i en eller flere steder rundt kanten av vinduet. Starter på ett av disse nettstedene, forsiktig løft og fjern deretter dura fra hjernen overflaten, bruker 45 ° vinkel pinsett # 5. Ved valg av nettstedet der for å begynne å fjerne dura, unngå områder som grenser til store blodkar. Hvis blødningen oppstår, gjelder en dråpe aCSF og vente i 2-3 min for mindre blødninger til å stoppe.
- Forbered 0,07% lav-smelting agarose oppløst i aCSF) Bring smeltet agarose til kroppstemperatur. Tørk bort overflødig av aCSF fra overflaten av hjernen. Hell agarose i vinduet, og dekk med et glass lysbilde. Trykk glasset forsiktig å lage en kontakt mellom glasset og hodet plate, og vent 10-20 sek til agarose er solid.
- Fjern overflødig agarose fra glassdekselet med pinsett og mykt vev papir.
- Sett en litenMengden rask lim rundt glasset å lime glasset i hodet plate. Påfør en liten mengde dental sement til stivne limet (figur 1).
3. Intravenøs injeksjon og blod oksygenering overvåking
Merk: Vi rutinemessig brukte femoralvenepunksjon for intravenøs bruk av Texas røde snarere enn halen blodåre. Dette er fordi femoralvenepunksjon injeksjoner gi trygge og reproduserbar bolus injeksjoner av fargestoffet.
- Slå dyret delvis over til utsette på innsiden av venstre lår. Bruk tape til å feste dyret i denne posisjonen.
- Bruk antiseptisk kratt, og deretter 100% etanol til huden.
- Lag et snitt langs mediale lår fra kneet til symfyseprovokasjonstester. Separate myke vev ved stump disseksjon med pinsett # 5.
- Fyll 1ml sprøyte med 130 mL of Texas Red (2,5 mg / ml). Fest en ny nål (gauge 30), og bøy den forsiktig på 30 °, holde skråkant opp. Fyll nålen with Texas Red løsning.
- Under en disseksjon mikroskop, stikk nålen inn i femoralvenepunksjon og injisere 100 mL of Texas Red. Fjern nålen og trykke lett på venen med gasbind for å stoppe blødning.
- Lukk huden ved hjelp av 4-0 sutur.
- For kontinuerlig overvåking av blod SpO 2 (for å sikre tilstrekkelig oksygentilførsel i blodet) plasserer oksymeteret sonde på høyre lår (som håret ble tidligere fjernet).
4. To-foton bildebehandling
Merk: Vi bruker en Olympus Fluoview1000 multiphoton imaging system (oppreist) med en Spectra-Physics Maitai HP DeepSee femtosecond Ti: Sa laser som en eksitasjon kilde. For bildebehandling, bruker vi × 10 NA 0,45 (Zeiss C-Apochromat), eller × 25 NA 1.05 (Olympus XLPlan N) vann-nedsenking mål. Vi tar bilder ved 12-bit dybde med en oppløsning på 512 × 512 piksler med en piksel holdetid på 2 μs. NADH og Texas-Red-dekstran er samtidig spent på 740 nm, og Fluorescence skilles fra eksitasjon lys ved hjelp av en dichroic speil / nær-IR-blokkerende filter kombinasjon (FF665-Di01; FF01-680/SP, Semrock, Rochester, NY, USA) delt i to kanaler som bruker en dichroic speil (505DCXRU, Chroma , Rockingham, VT, USA), og Båndpassdesign filtrert (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36). Lasereffekt målt etter målet var 10-20 mW for avbildning i lag jeg og 20-50 mW for avbildning i lag II.
- Overfør kirurgisk forberedt musen til mikroskop scenen. Ta en innledende bilde av den kraniale vinduet nettstedet ved hjelp av lys feltet belysning ved 4x forstørrelse til å bruke som en referanse kart for registrering med høyere forstørrelse to-foton angiographies.
- Zoom inn på området av interesse å bruke × 10 forstørrelse. Velg et område av interesse i kortikale lag I eller II (opptil 150 mikrometer under pial overflaten). Hvis høyere forstørrelse er ønskelig kan man bruke × 25 mål
- Start registrere tidsserien (Figure 2). Vi anbefaler å bruke et gjennomsnitt på 3-5 rammer for å øke kvaliteten på bildet.
- Fremkall hypoksemi ved å legge 50% N2 til luft som dyret puster. Dette vil bringe O2 nivå til 10%. Kontroller hypoksemi ved å overvåke oksymeter data.
- Fortsett å registrere tidsseriene gjennom hypoksemi (for eksempel i 30 sekunder), og etter normal O2 nivået er gjenopprettet.
- Samle data for beregning av oksygen fordeling ved å registrere, måle og kvantifisere området hypoksi og oksygenert vev sylindere rundt blodårene.
5. Databehandling
- Bestem Krogh vev sylinderen radius R. Dette kan gjøres manuelt (figur 3) ved å måle avstanden mellom senter av blodårer og grensen hvor høy NADH fluorescens detekteres.
- Alternativt kan du bruke beregningsorientert etterforsker-uavhengig semi-automatisert bestemmelse av vev sylinder radius R og den sentrale blood fartøy r som har blitt beskrevet tidligere en i tilleggsskjema og oppsummert i diskusjonen delen av denne protokollen.
- Finne arealet av hypoksi bruke open-access bildeanalyse programvare, f.eks ImageJ. For å gjøre dette, bruker NADH signal, definere en terskel som beskriver det høye NADH intensitet område, og deretter måle området med forhøyet NADH vev fluorescens.
6. Representative Resultater
Figur 2 viser en video av NADH / angiografi bilder under forbigående hypoksemi (for PDF-versjon av denne figur, har valgt stillbildene blitt brukt). Den inspirerte oksygenkonsentrasjonen ble senket fra 21% til 10% for en periode på 3 min. Dette nivået av eksperimentelt indusert hypoksemi er tilstrekkelig til å indusere alvorlig hypoksi i hjernebarken. Hypoksi førte til en økning i NADH fluorescens, først i de områdene som var lengst fra den arterielle blodtilførselen. Legg merke til skarpe NADH vevgrenser, som representerer observerbare vev grenser oksygen diffusjon fra cortical mikrosirkulasjonen. Bildet i Figur 3 viser geometrien av oksygen diffusjon grenser rundt cerebrale fartøy. Det er mulig å utlede Krogh sylinder diameter fra disse grensene, som beskrevet tidligere en.
Figur 1. (A) Mouse med kranial vindu forberedt for bildebehandling. (B) Dimensjoner på hodet plate.
Figur 2. Endogen NADH grønn fluorescens visualisert med to-foton bildebehandling gjennom skallen vinduet, ca 50 mikrometer under pial overflaten. Blodårene er visualisert med Texas Red dekstran. Oksygen i innåndingsluften ble redusert til 10% for 3 min, og deretter restaurert for 21%. Scale bar: 50μm.
<img alt = "Figur 3" src = "/ files/ftp_upload/3466/3466fig3.jpg" />
Figur 3. Geometry av NADH fluorescens grenser. Gul skisse viser grense for funksjonell hypoksi, blå sirklene viser beregnede oksygenfattige (Krogh) sylindre. Blå streker viser sylinder radier; tallene viser radier i mikrometer.
Discussion
Høy romlig oppløsning informasjon om oksygen diffusjon er viktig å forstå hvordan blodgjennomstrømningen i hjernen er regulert til å gi oksygen til hjerneceller, og for å møte metabolsk etterspørselen. Tradisjonelle polarographic oksygen målinger ved hjelp av Clark-stil glass elektrodene er svært invasiv og har lav romlig oppløsning 2-3 og signifikant (andre rekke) responstid. Så langt den eneste ikke-invasiv metode for måling av PO 2 i hjernevev er morilden slukke, der frekvensen av forfallet av den opphissede sonden er proporsjonal med oksygenkonsentrasjonen 4. Denne metoden gir nøyaktige oksygenkonsentrasjoner, men krever en proprietær fargestoff og en teknisk sofistikert morilden levetid imaging system. Her viser vi en grei, enklere tilnærming som kan gjennomføres på en standard to-foton imaging system med to flurescence kanaler. Vår tilnærming tar fordel av en indre vev signal 5 ennd krever bare kontrast visualisering av kortikale mikrosirkulasjonen. På grunn av den ikke-lineære, i hovedsak binær økning av NADH fluorescens ved funksjonelt begrense oksygenkonsentrasjoner en økt egenverdi NADH fluorescens er kun observert i områder med betydelig, metabolsk begrensende hypoksi. En viktig implikasjon er at vevet grensene for oksygen diffusjon fra kortikale microvessels er direkte observerbart av cylindrically formet intensitet endringer av endogen NADH fluorescens. Vi viser til disse strukturene som Krogh sylindere, fordi begrepet cylindrically formede strukturer som definerer oxygenated volumet av vevet rundt en blodåre ble introdusert i august Krogh og har nylig blitt eksperimentelt observert ved hjelp av to-foton NADH bildebehandling en. Krogh sylindere bilder kan hentes i 3D ved å ta en z-stabel med bilde rammer. De er spesielt fremtredende i nærheten av gjennomtrengende arterioler og de er congruous viddh Kapillær utarmet periarteriolar vev sylindere 1,4.
Å gi en objektiv fastsettelse av Krogh vev sylinderen radius R (se pkt. 5.2) vi målte deres radial pikselintensiteten verdier innenfor et veldefinert segment mellom midten av sylinderen og ytre grense ved hjelp av Matlab funksjonen "improfile". Den ytre grensen av segmentet bør velges for å utvide med en sikkerhetsmargin utover synlig grense. For å forbedre signal-til-støy nivå vi averageed over alle radiale linjer som trengs for å dekke synlige sylinder segmentet på 1 ° skritt. Den resulterende gjennomsnittlig radial intensitet profil innenfor segmentet viste en bratt økning som tilsvarer den synlige vev grensen R. Det vi passer en sigmoidal funksjon (f.eks Boltzmann funksjon) til den gjennomsnittlige radial intensitet profil og brukte sin vendepunkt (også kjent som x 0) som en definisjon av R. Den tilsvarende to-photon microangiography (Texas-rød) avslørte tverrsnitt av en enslig sentral blodåre i sentrum av sylinderen. Diameteren på den sentrale blod fartøyet kan bli brukt direkte for å bestemme r.
To-foton NADH bildebehandling gir samme romlige oppløsning som samtidige høy oppløsning avbildning av kortikale microangiography. En viktig funksjon for kvantitativ anvendelsen av denne metoden er at p 50 av NADH fluorescens økningen er målt til å være på 3,4 ± 0,6 mm Hg 1 og at NADH fluorescensintensiteten som en funksjon av microregional vev PO 2 kan matematisk beskrives med en sigmoidal funksjon. . Vi viser at denne teknikken gjør det mulig å identifisere hjernen områder som er mest sårbare for hypoksi (ved å redusere oksygeninnholdet i luften til 10%). Vi viser også at oksygen diffusjon følger en enkel geometrisk perivaskulær mønster.
En critiCal skritt for denne metoden er kvaliteten av den kraniale vinduet forberedelse. Operasjonen skal produsere minimal skade for ikke å forstyrre blodtilførselen til det utsatte området. En bekymring er at i en kirurgisk kompromittert forberedelse, kan cortex under vinduet være hypoksisk til å begynne med, utelukker enhver meningsfull eksperimenter. En godt forberedt kranial vindu skal ha intakte store og små blodkar med levende blodgjennomstrømning i alle skipstyper og ingen signifikant blødning langs kantene. Under normoksisk forhold (PaO2 80-100 mmHg, Sp O2 97-99%) i hjernen parenchyma skal fremvise uniform, ensartet NADH fluorescens uten synlige, lyse vev patcher med forhøyet NADH fluorescens.
En grunnleggende fysisk begrensning av vår tilnærming er begrenset dybde penetrasjon. Den blå-grønne NADH fluorescens i hjernen er raskt dempes med hemoglobin absorpsjon og vev spredning ved disse bølgelengdene. Selv med høy numerisk apertur (f.eks 1.05) vannnedsenking mål to-foton NADH avbildning er foreløpig begrenset til kortikal lag I og II. Denne begrensningen er vitenskapelig relevant fordi energiomsetningen i eller i nærhet til hvit substans vil trolig variere fra grå materie. Vil imidlertid etterforskningen av dype kortikale strukturer som for eksempel lag IV-VI eller subkortikale strukturer som hvit substans traktater eller striatum krever bruk av spesialiserte mikrolinser som beskrevet i mus cortex in vivo 6.
NADH-basert måling av oksygen diffusjon grenser kan være spesielt nyttig når den kombineres med andre målinger som analyser av funksjonell hyperemi, og påvisning av kapillære flux priser 7. For eksempel kan denne teknikken tilpasses visualisere hypoksi i slag og Alzheimers sykdom (AD) modeller. Den enkle geometrien av oksygen diffusjon gjør det mulig å forutsi oksygen gradient i mikrovaskulære senger under omstendigheter der kapillær tetthet er deøkt 8 (f.eks AD 9) og for å undersøke om hjernevev regioner med redusert kapillær tetthet har økt risiko for hypoksi skader som skyldes microstrokes. Muligheten til bildet microregionally også gjør det mulig å undersøke geometri og størrelse av vev microstrokes og bestemme omfanget av vev som hypoksi oppstår, samt forholdet mellom vevshypoksi og påfølgende neuronal død eller kapillær remodeling 10.
Til slutt, siden økninger i endogen NADH fluorescens er en direkte følge av akutt mitokondriell dysfunksjon, skaper denne metoden anledning til å bruke NADH bildebehandling som en spesifikk reporter for nevrale energiomsetningen 11 og en proxy for mitokondriell dysfunksjon.
I konklusjonen, er to-foton avbildning av endogen NADH fluorescens et enkelt, lite krevende verktøy som kan brukes til å forstå oksygen levering og forbruk i hjernen under både normaleog i patologiske tilstander.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Maiken Nedergaard (University of Rochester Medical Center) for hodet plate design. Arbeidet har vært støttet av NIH utmerkelser til SD (R01DA026325 og P30AI078498 og fundament tilskudd til KK (DANA fundament Brain og Immunoimaging program, American Heart Association 0635595T og ALS Association [# 1112)]).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heating pads | Beyond Bodi Heat | ||
| Ophthalmic ointment (Artificial tears) | Pfizer Pharma GmbH | ||
| Povidone-iodine 10% solution | Betadine Puredue Pharma | ||
| Ferric chloride 10% solution | |||
| Cement | Stoelting Co. | 51456 | |
| Cyanoacrylate 454 | Loctite | ||
| aCSF | Harvard Apparatus | 597316 | |
| Microtorque II handpiece kit | Pearson Assessments | R14-0002 | |
| IRF 007 drill bits | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| Forceps #5 | Fine Science Tools | 11295 | |
| Forceps #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| #0 glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 63750-01 | |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu Corp. | HC125-02 | |
| Ti:Sapphire laser Mai-Tai | Newport Corp. |
References
- Kasischke, K. A. Two-photon NADH imaging exposes boundaries of oxygen diffusion in cortical vascular supply regions. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 31, 68-81 (2011).
- Ndubuizu, O., LaManna, J. C.
- Sharan, M., Vovenko, E. P., Vadapalli, A., Popel, A. S., Pittman, R. N. Experimental and theoretical studies of oxygen gradients in rat pial microvessels. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 28, 1597-1604 (2008).
- Sakadzic, S. Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue. Nat. Methods. 7, 755-759 (2010).
- Vishwasrao, H. D., Heikal, A. A., Kasischke, K. A., Webb, W. W. Conformational dependence of intracellular NADH on metabolic state revealed by associated fluorescence anisotropy. J. Biol. Chem. 280, 25119-25126 (2005).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 15741-15746 (1998).
- Brown, W. R., Thore, C. R. Review: cerebral microvascular pathology in ageing and neurodegeneration. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 37, 56-74 (2011).
- de la Torre, J. C. Impaired brain microcirculation may trigger Alzheimer's disease. Neurosci. Biobehav. Rev. 18, 397-401 (1994).
- Brown, C. E., Boyd, J. D., Murphy, T. H. Longitudinal in vivo imaging reveals balanced and branch-specific remodeling of mature cortical pyramidal dendritic arbors after stroke. J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 30, 783-791 (2010).
- Wilson, D. F., Erecinska, M., Drown, C., Silver, I. A. The oxygen dependence of cellular energy metabolism. Arch. Biochem. Biophys. 195, 485-493 (1979).
