Summary
γ-疱疹病毒(γ- HVS)在其主机建立终身续保。感染小鼠γ- HV68提供了一种基因听话
Abstract
γ-疱疹病毒(γ- HVS)为显着的能力,建立潜伏感染的淋巴细胞1。人类γ- HVS,如EBV和KSHV的宿主范围狭窄,严重阻碍了详细的致病性研究。小鼠γ-疱疹病毒68(γHV68)股广泛的遗传和生物与人类的γ- HVS, 相似之处是2 murid啮齿动物的天然病原体。因此,γHV68感染小鼠近交系的评价,在病毒感染的不同阶段提供了一个认识过程中γ- HVS感染病毒的生命周期和发病机制的重要模式。
鼻内接种后,γHV68肺感染的急性血症结果,就是后来成隐性感染者脾细胞及其他细胞,这可能是整个生活的主机3,4恢复解决。在这个协议中,我们将描述如何使用斑块的检测,以评估在传染性病毒滴度肺组织匀浆后滴鼻感染(DPI)在早期阶段(5 - 7天)在Vero细胞单层。虽然急性感染主要是清除2 - 3周,隐性感染的γHV68各地建立了14 DPI,以后维持在小鼠的脾。隐性感染者通常会影响在受感染的组织细胞的一个非常小的人口,据此病毒保持休眠状态,并关闭其大部分基因的表达。潜伏感染的脾细胞自发激活后病毒组织培养,可以通过扼要传染病中心(IC)检测,以确定病毒潜伏负荷explanting。要进一步病毒基因组副本的数量估计在急性和/或潜伏感染的组织,实时定量PCR(定量PCR)用于其最大的灵敏度和准确性。的qPCR和斑块的检测和/或IC检测的结果结合起来分析,就会发现病毒的时空分布在体内的复制和传染性。
Protocol
下面的协议,将描述研究的病毒滴度和病毒基因组的γHV68溶骨性和潜伏性感染周期,在小鼠中,理论上可以用于评估感染其他病毒,分享相似的生活方式γHV68负载。
1。扩增的γHV68
- 在37℃水浴解冻γHV68冷冻小瓶。
- 将病毒接种到NIH3T12或3T3细胞培养(〜50%汇合)在10厘米的菜肴和文化感染的细胞在37℃,5%的CO 2。
- 检查显微镜细胞病变效应(CPE)的文化和媒体时大于80%的细胞显示4〜5天,感染后CPE收集一次。为了最大限度地提高产量病毒,受感染的细胞培养可冻结和解冻两次释放所有细胞相关γHV68。
- 在1000转速在室温(RT)5分钟离心收集媒体以去除细胞碎片。
- 仔细上清转移到新管(高速离心管),而不触及底部的细胞碎片。
- 12,000 rpm的高速离心机(SA - 600 Sorvall)在4 ° C下至少1.5小时集中的病毒颗粒。
- 到10γ漂白粉溶液倒掉上清,并仔细地重新悬浮颗粒(病毒和细胞碎片残留)用1ml无血清DMEM。转移到1.5 ml的微量离心管中的悬浮颗粒,拌匀由涡旋。
- 离心机以最大速度为2分钟,以去除残留的细胞碎片和上清液(病毒存量)转移到一个新的管。这是病毒感染的最终股票。病毒的滴度是由斑块的检测(见下文)。
2。滴鼻感染小鼠γHV68
- 感染〜6周龄的小鼠与1000〜5000γHV68每小鼠的菌斑形成单位(PFU)。
- 麻醉小鼠腹腔注入氯胺酮/甲苯噻嗪(80毫克/毫升氯胺酮和12毫克/毫升甲苯噻嗪的混合物60μL/鼠标)。监测麻醉捏小鼠脚趾。它通常需要〜5-10分钟。如果老鼠是不充分麻醉的,他们会打喷嚏病毒。
- 当鼠标完全麻醉,用吸管给小鼠接种〜30μLPBS中γHV68(15μL)在每个鼻孔下拉,缓慢但稳步下降。确保鼠标确实是吸入而试图形成气泡滴。
- 让鼠标恢复为10-15分钟,监测,然后把他们送回笼的小鼠(如意识,呼吸等)的福利。动物疾病和充足的食物,水,和被褥条件,每天检查。如果疾病,疼痛或窘迫的临床体征的发展,将进行常规诊断,以确定病因。失去的体重超过20%的动物,将录得最大的减肥安乐死。最终决定执行安乐死是在临床兽医的自由裁量权,是与主要研究者协商后。
3。斑块含量,以确定在急性感染肺病毒滴度
- Vero细胞单层斑块的形成是由病毒感染性滴度。
- 斑块检测的前一天,在2.5 × 10 4细胞Vero细胞接种/ 12孔板。细胞应分布均匀,细胞密度应达到30 - 40%的斑块检测的一天。
- 准备0.5%(W / V)甲基纤维素(MC)覆盖介质(见表1)。
- 牺牲后5-7天γHV68感染小鼠滴鼻感染,以确定在肺部急性期病毒滴度。对于euthanization氯胺酮盐酸(80-100毫克/千克SC,IM IP)将给药的IM戊巴比妥钠(30-50毫克/千克的IP),静脉注射过量。这种方法是由T批准他在美国兽医医疗协会。
- 收获的肺和1 × PBS冲洗两次,去除血细胞。收集1毫升冰冷的完整的DMEM培养基的一个侧面的肺部和保持在冰上。迅速冻结于-80 ° C,在肺部的qPCR(见下文)审查病毒DNA载量的肺部和存储的另一边。
- 使用组织匀浆均质在肺组织的最高速度为1秒,冻结与解冻三次。洗净,在每一步改变样品时,用70%乙醇的匀浆。
- 在10分钟3000转离心匀浆组织于4 ° C。收集上清,斑块检测转移到新的管。
- 准备在1.5毫升微量离心管与普通的DMEM涡肺组织匀浆样品连续稀释(通常是从10 °到10 -8)。充液管的适当数量与540μLDMEM培养液稀释成60μL匀浆管头。传输我从第一管60μL没有下一个,依此类推。
- 准备在12孔板VERO单层吸媒体和负载200μL/连续稀释匀浆含有传染性病毒,在相反的顺序( 从 10-8到10 °) 。每次滴定的两口井(一式两份)。
- 孵育Vero细胞病毒接种1小时37 ° C。轻轻摇动板每15分钟均匀地分布在单层病毒。
- 取出接种2毫升/覆盖介质(见表1)替换它。一个星期板在37 ° C。
- 删除覆盖介质(不需要是完整的),更换与修复/斑块检测的染色介质(见表1)和至少1小时在室温下孵育。
- 当干板,隔离斑块的数量在每个稀释度计数。为了尽量减少错误,只包含在10和100斑块之间的水井也计算在内。
- 计算病毒滴度使用follo翼公式:滴度(PFU / ml的)= [(斑块数/孔)/(接种/以及体积)] ×稀释倍数。
4。传染病中心检测,以确定潜伏感染脾细胞中的病毒载量
- 是由传染病中心(IC)检测单层Vero细胞病毒潜伏负载。 IC检测,种子Vero细胞在6孔板的前一天(1 - 2.5 × 10 5细胞/孔,我们通常使用脾样本的11%口井,10口井将用于连续稀释的脾细胞悬浮和一个用于测试冻融循环后自发激活病毒。
- 牺牲后延迟(感染后12 - 14天)感染小鼠。收获的小鼠脾和游泳池到1毫升冷冻的DMEM。
- 机械分离小鼠脾。新鲜分离的小鼠脾脏转移到一个10厘米的钢板,并添加10毫升含2%FBS的DMEM培养基所需。湿两种磨砂高端玻璃显微OPE幻灯片用冰冷的介质。将脾上一张幻灯片和尼克胶囊与其他幻灯片的磨砂结束边缘磨砂。机械游离于两个幻灯片之间的脾粉碎,直到所有的红色团块(去除脂肪颗粒如果存在的话)。
- 用DMEM冲洗的幻灯片,幻灯片上都恢复剩余的细胞。
- 通过细胞过滤器(40微米尼龙网)传输整个组织悬液,轻轻放入50毫升的锥形螺丝帽筒。 10 cm培养皿,同时过滤含有10毫升PBS和转让脾匀浆洗净。
- 375 XG离心机的单细胞悬液10分钟,弃上清。弗里克细胞沉淀,打破现有的细胞团块。加入5毫升的ACK缓冲液(见表1)裂解红细胞。孵育5分钟,再次离心375 X G.
- 弃上清,重新暂停颗粒,彻底,还轻轻在PBS,含2%FBS。保持细胞在4 ° C。使用吸管清除杂物,如果有的话。使用自动细胞计数器(BIO - RAD)的计数活细胞。
- 离心4分钟XG 375的PBS重悬脾。弃上清,重悬细胞,在4毫升完全DMEM(2 × 1毫升,将用于集成电路检测原悬挂;串行五倍稀释在IC检测用0.6毫升0.4毫升病毒DNA的制备和定量PCR, 1毫升悬液,将用于评估三个冻融循环后自发激活潜伏的病毒)
- 准备串行的5倍稀释(即1 / 5,1 / 25,1 / 125,1 / 250)脾悬挂在重复。预填的15毫升2.4毫升的DMEM和第一管稀释成600μL脾悬挂拌匀锥形管。从以前的管传输到600μL,下管等,不要旋涡!
- 从准备6井单层Vero细胞吸介质。种子1毫升到Vero细胞的连续稀释,每个稀释dupl脾icated(10口井将用于为0,1 / 5,1 / 25,1 / 125,1 / 250稀释)。
- 板8-12小时在37 ° C和5%的CO 2。不要超过24小时。吸种子脾悬挂和加载4毫升覆盖媒体(见表1)每口井。孵育一个额外的6天。
- 确定斑块检测显示,板块与0.2%(W / V)结晶紫染色脾传染病中心的水平。
5。病毒基因组的量化
- 从γHV68感染的组织,如肺,脾样本,在这个实验中提取总DNA。使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen),按照制造商的协议。
- 确定每个样本的DNA的浓度,以确保DNA的定量PCR检测正在使用的相同数额。设计病毒的特异性引物(〜200 bp的扩增是一个定量PCR检测的首选)。我们使用γHV68ORF56特异引物(正向引物:5′ - GTAACTCGAGACTGAAACCTCGCAGAGGTCC - 3',反向引物:5' - CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG - 3'),此法和β- actin引物(正向引物:5' - cacccacactgtggcccatcat - 3'反向引物:5' - gtgaggatcttcatgaggtagtc - 3')控制的qPCR反应。
- 混合DNA样本(100 - 500吴好)和适当的引物与2 × SYBR的master mix(Bio - Rad公司的iQ SYBR绿色Supermix)。使用Bio - Rad公司的实时PCR系统量化在受感染的组织的病毒载量。在下列条件下进行PCR:95℃15分钟和45周期95 ° C为30分钟,60 °彗星为30分钟,72 ° C下30分钟,其次是病毒和熔解曲线分析,肌动蛋白扩增产物。
- 为了使病毒的基因组进行量化的标准曲线,一个γHV68与未受感染的细胞中分离出基因组DNA bacmid DNA连续稀释的已知金额。并行运行的qPCR的DNA与从感染检索TED组织使用同一组病毒特异性引物。
- 目前病毒DNA每单位正常化后肌动蛋白的基因组DNA的拷贝数(例如100毫微克或500纳克)组织的病毒基因组负载。
6。代表性的成果:
图1描绘了γHV68感染小鼠体内的测量实验的总体方案。代表性的成果,在γHV68斑块检测确定,急性感染期间肺部的病毒滴度,如图2a所示。一个含有γHV68非功能性的突变株病毒BCL - 2(vBcl 2)在肺部复制水平与野生型γHV68后7天滴鼻感染BALB / c小鼠(6 - 7%组小鼠)。肺病毒滴度检测两组差异无统计学意义。这一数据表明,vBcl - 2不是γHV68急性感染的关键因素小鼠。然而,28天postinfection,脾脏vBcl - 2变异病毒滴度下降6 - 10 - 倍的WT,传染病中心检测(图2B)来衡量,这表明vBcl - 2突变体γHV68病毒在感染后脾延迟的维修是有缺陷的。在协议减少传染病中心滴度,vBcl - 2突变病毒的病毒基因组负载严重减少相比,野生型病毒,在反复实验第28天,如在图2C所示。潜HV68vBcl - 2突变体病毒再激活体内潜伏的感染阶段的病毒基因组的负载和频率之间的密切的关系,突出了这种突变病毒感染的潜伏期缺陷。
γHV68感染小鼠的斑块形成,传染病中心和定量PCR检测的测量示意图图 1。第
图2。溶解的和潜在的WT和突变γHV68 在体内的病毒感染。在7天感染后DPI()的BALB / c小鼠的肺部急性WT和突变vBcl - 2γHV68病毒的复制(一)是由斑块检测。 (B和C)测定脾传染病中心(B)和病毒基因组的负载(三)在感染小鼠脾脏的28 dpi的传染病中心检测和定量PCR,分别。红线,指示值的平均值。 NS,不显着。
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Discussion
γHV68已被广泛用于作为一种模式来理解人类γ- HVS 2,4,5的发病机制。在这个协议中,我们描述了三个经常使用的方法,包括斑块传染性病毒滴度的检测,IC病毒潜伏负载检测,病毒基因组负载的qPCR,以评估后,在小鼠滴鼻接种γHV68急性和隐性感染者。
斑块的检测已广泛使用,以确定受感染的细胞或组织中的病毒滴度,但不同的病毒正在使用的最佳条件。这主要是因为不同病毒的能力,以产生一个细胞单层上的斑块(可数病变)是不同的。 γHV68正常生产单层猴Vero细胞培养的小鼠细胞,如NIH3T12或3T3,6明显的斑块 - 在感染后7天。值得注意的是,传感器的灵敏度病毒感染单层年龄下降或变得人满为患因此,我们通常使用低于50%的Vero细胞斑块检测,其中,在我们的经验,演示γHV68最好的结果汇合。此外,分布均匀,新鲜的单层强烈建议斑块计数的准确性。同时使病毒样本的连续稀释,必须采取谨慎,以避免气泡和吸管提示应改变彼此之间滴定。高滴度的病毒样本,10倍系列稀释建议,否则,2 - 5倍系列稀释使用。
不像急性传染性病毒感染,其中可直接检测斑块形成能力,潜伏感染的组织/γ- HVS样品通常不包含检测到的预制传染性病毒,而不是病毒DNA保持圆形附加体作为一个与几个基因表示6,7。在这种情况下,病毒的潜伏期负载可以由病毒的体外激活的频率在vitrØ植到一个宽容的指标细胞培养(如Vero细胞)8潜伏感染的细胞。为此,准备受感染的组织单细胞悬液,计数,并镀上的易感细胞,然后将这些斑块检测介质覆盖的单层。在这个协议中,我们已经描述了如何准备的IC检测脾单细胞悬液来衡量潜伏的病毒量,有能力,激活每脾脏或脾4人口每。由于只有一个小的脾人口潜伏感染,通常我们准备感染性滴度检测串行低倍稀释的脾细胞悬液。在整个过程中必须格外小心,以避免恶劣的移液器或涡旋细胞。重要的是要注意,explanted的B细胞,一般从脾显示穷人的生存能力,这可能影响的体外激活的效率。任何基因,提高了生存latenTLY感染的细胞,可以间接地促进病毒的体外激活的效率。
定量PCR检测斑块形成和IC相比,提供了一种有效的手段,准确地量化在10个受感染的小鼠淋巴细胞γ - HVS。这是一个差的菌斑形成能力,由于其最小VERO或其他的指标细胞的细胞毒性的病毒特别有用,可应用于急性和慢性感染的样本。标准曲线是必要和重要的精确量化病毒的基因组。我们开发γHV68基于ORF56基因扩增的标准曲线,利用bacmid克隆含有γHV68基因组 8 。 qPCR的反应极为敏感,能够检测到的病毒DNA每定量PCR反应,远远超出斑块检测的限制,甚至几份。注意事项,但必须落实到位,以避免样品间的交叉污染,同时包括uninfecte每个反应必要的阴性对照D采样。定量PCR反应的特异性,可以是一个严重的问题,特别是对受感染的组织样本,因为数额巨大,可能会影响细胞DNA的病毒特异性扩增的信号。然而,这可通过非特异性扩增产物熔点曲线分析检测。在自然感染脾的人群,γHV68轴承细胞的频率非常低。在这种情况下,作为一个使用准种的DNA的qPCR分析的补充,限制稀释PCR(LD - PCR技术)提供了一种替代的优势,以评估病毒的基因组轴承细胞11,12频率。简言之,γ- HVS感染的淋巴细胞连续稀释。从这些细胞中提取DNA是一个敏感的巢式PCR检测方法,它可以检测单拷贝病毒DNA在个别样品存在。相结合的有限稀释定量PCR分析将揭示潜伏感染的细胞的频率和日发送病毒潜伏DNA载量。
值得注意的是,IC检测不能被用来作为一个独立的方法来衡量病毒潜伏负载,由于这样的事实,它并没有减少病毒潜伏负载之间的区分与一个重新激活潜伏的病毒本身的失败。由于病毒潜伏期的进一步措施,qPCR可以用于定量评价在受感染的组织的病毒基因组副本。减少病毒基因组的负载和传染病中心滴度之间的相关性,建议延迟缺陷的病毒。与此相反,病毒基因组高负荷和低潜伏的病毒滴度之间的差距会认为,虽然该病毒是能够保持一个潜在的病毒DNA池的,它是无法有效地激活延迟。
总之,在本议定书中所描述的方法也有普遍的适用性其他疱疹病毒比γHV68,其中目标类型的细胞和病毒基因组序列可用,并允许日个人明确的评价, 在体内不同的生命周期。它也可以用来解决具体的致病因素在小鼠感染中的生物学作用。例如,通过比较不同的病毒突变γHV68BCL - 2的复制与野生型γHV68,我们最近的工作8使我们能够确定vBcl - 2(如细胞凋亡,细胞自噬,或两者兼而有之)的功能,有助于在的在小鼠的急性和慢性感染这种病毒在体内的行为。因此,他们也代表了解剖在感染病毒宿主相互作用的重要工具。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者要感谢任孙(美国加州大学洛杉矶分校)和Seungmin黄某(华盛顿大学)的技术咨询和支持。这项工作是由巴克斯特基金会,国家卫生赠款研究院(R01 CA140964和R21 AI083841 C.梁)。
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