Mesure de γHV68 infection chez les souris

Summary

γ-herpèsvirus (γ-HVS) établir long de la vie la persistance dans leur hôte. L'infection de souris avec γ-HV68 offre une tractable génétiquement

Abstract

γ-herpèsvirus (γ-VH) sont remarquables par leur capacité à établir des infections latentes de cellules lymphoïdes ^1. La gamme d'hôtes étroite humaine γ-HVS, comme l'EBV et KSHV, a gravement entravé les études détaillées pathogènes. Murin γ-herpèsvirus 68 (γHV68) part importante des similitudes génétiques et biologiques avec les humains et les γ-HVS est un agent pathogène naturel des rongeurs muridés ^2. En tant que tel, l'évaluation des γHV68 infection de la souris des souches consanguines à différents stades de l'infection virale constitue un modèle important pour la compréhension du cycle de vie virale et la pathogénèse au cours γ-HVS infection.

Après inoculation intranasale, γHV68 résultats d'infection aiguë de la virémie dans les poumons qui est ensuite résolue en une infection latente des splénocytes et des autres cellules, qui peuvent être réactivées pendant toute la durée de l'hôte ^3,4. Dans ce protocole, nous allons décrire la façon d'utiliser le dosage de la plaque d'ânestitre s de virus infectieux dans les poumons homogénats sur des monocouches de cellules Vero à un stade précoce (5 - 7 jours) de la post-infection intranasale (ppp). Alors que l'infection aiguë est largement effacé 2-3 après l'infection semaines, une infection latente de γHV68 est établi autour de 14 dpi et maintenue plus tard dans la rate des souris. L'infection latente affecte généralement une très petite population de cellules dans les tissus infectés, par lequel le virus reste dormant et s'éteint la plupart de son expression génique. Splénocytes latente infectée par le virus spontanément réactiver après explantation dans la culture tissulaire, qui peut être récapitulée par un centre infectieuses (IC) d'essai pour déterminer la charge virale latente. Afin d'estimer la quantité de copies du génome viral dans le aiguë et / ou des tissus infectés latents, quantitatifs PCR en temps réel (qPCR) est utilisé pour sa sensibilité maximale et précision. Les analyses combinées des résultats de dosage de qPCR et de la plaque, et / ou le dosage IC va révéler les profils spatio-temporelle des virusla réplication et l'infectiosité in vivo.

Protocol

Le protocole suivant décrira l'étude de titres de virus et les charges du génome viral dans le cycle d'infection lytique et latente des γHV68 chez la souris, qui peuvent théoriquement être utilisés pour évaluer l'infection par d'autres virus de partage de mode de vie semblable à celle de γHV68.

1. Amplification du γHV68

1. Dégeler une ampoule congelée d'γHV68 de 37 ° C l'eau de bain.
2. Ajouter inoculums viraux pour NIH3T12 ou la culture de cellules 3T3 (~ 50% de confluence) en boîtes de 10 cm et la culture des cellules infectées à 37 ° C dans 5% de CO _2.
3. Examiner la culture par microscopie pour effet cytopathogène (ECP) et de recueillir les médias à un moment où plus de 80% des cellules montrent CPE 4 ~ 5 jours après l'infection. Afin de maximiser le rendement de virus, de la culture de cellules infectées peuvent être congelés et décongelés deux fois-pour libérer tous les associés aux cellules γHV68.
4. Centrifuger les médias collectées à 1000 rpm pendant 5 min à température ambiante (TA) pour éliminer les débris cellulaires.
5. Soigneusement transférer les surnageants de nouveaux tubes (tube de centrifugeuse à haute vitesse) sans toucher les débris cellulaires à la base.
6. Haute-vitesse de centrifugation à 12000 rpm (pour Sorvall SA-600) à 4 ° C pendant au moins 1,5 heures pour concentrer les particules virales.
7. Jeter le surnageant dans l'eau de Javel 10γ et soigneusement re-suspendre le culot (virus et les débris cellulaires résiduels) avec 1ml DMEM sans sérum. Transférer le concentré remis en suspension dans un micro-1,5 ml tube de centrifugeuse et bien mélanger au vortex.
8. Centrifuger pendant 2 min à vitesse maximale pour éliminer les débris cellulaires résiduelle et transférer le surnageant (stock de virus) dans un nouveau tube. Ceci est le stock final de l'infection virale. Le titre du stock de virus est déterminée par dosage de plaque (voir ci-dessous).

2. L'infection intranasale de souris avec γHV68

1. Infecter des souris à ~ 6 semaines d'âge de 1000 ~ 5000 unités formant plage (UFP) de souris par γHV68.
2. Anesthésiersouris par injection de kétamine / xylazine (60 ul / souris d'un mélange de 80 mg / ml de kétamine et 12 mg / ml de xylazine) dans la cavité péritonéale. Moniteur d'anesthésie en pinçant le bout des souris. Il faut généralement min ~ 5-10. Si les souris ne sont pas complètement anesthésiés, ils éternuent le virus.
3. Lorsque la souris est totalement anesthésié, l'utilisation d'une pipette pour inoculer ~ 30 pl de PBS contenant γHV68 (15 pi à chaque narine) à des souris au goutte-à-goutte, lentement mais sûrement. Soyez certain que la souris est en effet inhaler les gouttes, sans chercher à former des bulles.
4. Laissez la souris pour récupérer pendant 10-15 min et surveiller le bien-être de la souris (par exemple la conscience, la respiration, etc) avant de les retourner à la cage. Les animaux sont contrôlés quotidiennement pour cause de maladie et de l'adéquation de la nourriture, l'eau, et les conditions de la literie. Si les signes cliniques de la maladie, la douleur ou de détresse se développer, le diagnostic de routine afin de déterminer l'étiologie sera menée. Les animaux qui perdent plus de 20% de leur poids corporel sera enregistré pour la perte de poids maximaleet euthanasiés. La décision finale de pratiquer l'euthanasie est à la discrétion du vétérinaire clinique et est faite après consultation avec le chercheur principal.

3. Essai de plaque pour déterminer le titre de virus dans les poumons infectés de façon aiguë

1. Les titres infectieux du virus sont déterminées par la formation de plaque sur des monocouches de cellules Vero.
2. Les cellules Vero sont ensemencées à 2.5x10 ⁴ cellules / puits dans 12 puits de plaques de la journée avant le dosage de plaque. Les cellules doivent être répartis uniformément et de la densité cellulaire devrait atteindre 30 - 40% le jour de la plaque assay.
3. Préparer 0,5% (p / v) la méthylcellulose (MC) milieu de recouvrement (Tableau 1).
4. Sacrifice γHV68 souris infectées 5-7 jours après l'infection intranasale pour déterminer les titres de virus de phase aiguë dans les poumons. Pour l'euthanasie Kétamine HCl (80-100 mg / kg SC, IM, IP) seront administrées IM suivie par surdose intraveineuse de pentobarbital Na (30-50 mg / kg IP). Cette méthode est approuvée par tIl American Veterinary Medical Association.
5. Récolter les poumons et rincer deux fois avec 1 x PBS pour éliminer les cellules sanguines. Recueillir un côté des poumons dans 1 ml glacée milieu DMEM complet et de garder sur la glace. Rapidement figer l'autre côté des poumons et de conserver à -80 ° C pour examiner les charges d'ADN viral dans les poumons par qPCR (voir ci-dessous).
6. Utilisez un homogénéisateur de tissu afin d'homogénéiser les tissus pulmonaires à une vitesse maximale de 1 sec, gel-dégel et à trois reprises. Laver l'homogénéisateur à l'éthanol 70% à chaque étape lors du changement de l'échantillon.
7. Centrifuger les tissus homogénéisés à 3000 rpm pendant 10 min à 4 ° C. Recueillir le surnageant et le transfert à de nouveaux tubes pour le dosage de la plaque.
8. Préparer des dilutions en série (généralement de 10 ° à 10 ^-8) des échantillons pulmonaires dans 1,5 ml d'homogénat de micro-centrifugeuse tubes avec plaine de DMEM par vortex. Prefill le nombre approprié de tubes avec 540 ul de DMEM et diluer 60 homogénat ul dans le premier tube. Transfert 60 ul du premier tube ipas le suivant, et ainsi de suite.
9. Aspirer les médias à partir des monocouches préparées Vero dans des plaques à 12 puits et la charge utile de 200 l / homogénat ainsi dilué en série contenant des virus infectieux dans un ordre inverse (de 10 ^-8 à 10 °). Utilisez deux puits pour chaque titrage (en double).
10. Incuber les cellules Vero par le virus inoculums 1 heure à 37 ° C. Mélanger délicatement les plaques toutes les 15 minutes afin de répartir uniformément le virus au cours de la monocouche.
11. Retirez les inoculums et le remplacer par 2 ml / puits de milieu de recouvrement (Tableau 1). Incuber les plaques pendant une semaine à 37 ° C.
12. Retirer milieu de recouvrement (n'a pas besoin d'être complète) et le remplacer par le correctif / moyen tache de plaque assay (tableau 1) et incuber pendant au moins 1 heure à température ambiante.
13. Lorsque les plaques sont séchées, compter le nombre de plaques bien isolées à chaque dilution. Afin de minimiser les erreurs, seuls les puits contenant entre 10 et 100 plaques sont comptées.
14. Calculer le titre du virus utilisant le Folloaile formule: titre (UFP / ml) = [(nombre de plaques / puits) / (volume de inoculums / puits)] x facteur de dilution.

4. Assay Centre infectieuses pour déterminer la charge virale dans splénocytes infectées de façon latente

1. Charge latente virale est déterminé par le centre infectieuses (IC) d'essai sur la monocouche de cellules Vero. La veille de cellules test IC semences, Vero dans des plaques 6 puits (1 -. 2,5 X 10 ⁵ cellules / puits Nous utilisons habituellement 11 puits par échantillon rate, 10 puits seront utilisées pour la suspension diluée en série splénocytes et un puits pour les tests réactivation spontanée du virus après cycles gel-dégel.
2. Sacrifice de la souris infectées après la latence est établie (12 - 14 jours après l'infection). Récolte de la rate de souris et de les mettre dans 1 ml de DMEM froid.
3. Dissociation mécanique de la rate de souris. Transfert de la rate de souris fraîchement isolées dans une plaque de 10 cm et ajouter 10 ml de milieu désiré tel que DMEM avec 2% de FBS. Humides deux en verre dépoli-end microscdiapositives avec OPE glacée à moyen terme. Placer la rate sur le côté givré d'un toboggan et Nick la capsule avec le bord de l'extrémité dépolie de la lame d'autres. Mécaniquement dissocier la rate entre deux diapositives jusqu'à ce que tous touffes rouges sont écrasés (également supprimer les particules de graisse si présent).
4. Rincer les lames avec du DMEM à récupérer les cellules restantes sur les deux diapositives.
5. Transférer la suspension de tissu ensemble délicatement dans une passoire cellulaire (40 maille de nylon um) dans un conique de 50 ml à bouchon à vis tube. Laver la vaisselle de 10 cm contenant les homogénats de rate avec 10 ml de PBS et de transfert tout en filtrant.
6. Centrifuger la cellule unique suspensions 10 min à 375 xg et éliminer le surnageant. Flick les culots pour briser les mottes de cellules existantes. Ajouter 5 ml de tampon ACK (tableau 1) pour lyser les globules rouges. Incuber 5 min et centrifuger à nouveau à 375 x g.
7. Jeter le surnageant et remettre en suspension les pellets, à fond, mais en douceur, en PBS avec 2% de FBS. Gardez les cellules à 4 ° C. Utiliser une pipette pourenlever les débris, le cas échéant. Nombre de cellules viables en utilisant un compteur de cellules automatique (Bio-Rad).
8. Isoler les splénocytes PBS-resuspendues à 375 g pendant 4 min. Rejeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 4 ml DMEM complet (2 x 1 ml sera utilisé pour le dosage de CI de la suspension d'origine; 0,6 ml utilisée pour série de cinq dilutions dans le dosage IC, 0,4 ml pour la préparation de l'ADN viral et qPCR, et 1 ml de suspension seront utilisés pour évaluer la réactivation spontanée du virus latent après trois cycles gel-dégel)
9. Préparer série de cinq dilutions (soit 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250) de la suspension splénocytes en double. Prefill les 15 ml tubes coniques avec 2,4 ml de DMEM et diluer la suspension 600 ul splénocytes dans le premier tube et bien mélanger. Transfert 600 pi du tube précédent dans le tube suivant, etc Ne pas vortexer!
10. Aspirer le support de la préparer à 6 puits monocouche de cellules Vero. Graine de 1 ml de splénocytes en série diluée sur des cellules Vero avec chaque dupl de dilutionicated (10 puits seront utilisées pour 0, 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250 dilutions).
11. Incuber les plaques 8-12 heures à 37 ° C et 5% de CO _2. Ne pas dépasser 24 heures. Aspirer la suspension ensemencé splénocytes et de la charge 4 ml de superposition des médias (tableau 1) à chaque puits. Incuber pendant 6 jours supplémentaires.
12. Déterminer les niveaux des centres de la rate infectieuses par la coloration des plaques avec 0,2% (p / v) de cristal violet, comme indiqué dans le test de la plaque.

5. La quantification du génome viral

1. Extraire l'ADN génomique total à partir des tissus infectés γHV68, comme les poumons et la rate des échantillons dans cette expérience. Utilisez le sang DNeasy & Kit tissulaire (Qiagen), selon le protocole du fabricant.
2. Déterminer la concentration d'ADN de chaque échantillon afin d'assurer la même quantité d'ADN utilisée pour le dosage de qPCR. Conception du virus amorces spécifiques (~ 200 pb amplicon est préféré pour un dosage de qPCR). Nous avons utilisé le γHV68 ORF56 amorces spécifiques (amorce sens: 5 & PRIME; - GTAACTCGAGACTGAAACCTCGCAGAGGTCC - 3 '; amorce reverse: 5'-CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG-3') pour ce test et β-actine amorces (amorce directe: 5'-cacccacactgtggcccatcat-3 'amorce reverse: 5'-gtgaggatcttcatgaggtagtc-3') en tant que un contrôle de la réaction de PCR quantitative.
3. Mélanger l'échantillon d'ADN (100 - 500 ng est bon) et des amorces appropriées avec 2 x SYBR master mix (Bio-Rad iQ SYBR Green Supermix). Utiliser le Bio-Rad système en temps réel de PCR de quantifier la charge virale dans les tissus infectés. Effectuer PCR à la condition suivante: 95 ° C pendant 15 min et 45 cycles de 95 ° C pendant 30 min, 60 ° C pendant 30 min, et 72 ° C pendant 30 min, suivi d'une fusion des analyses de courbe, tant pour les virus et amplicons d'actine.
4. Pour faire une courbe standard pour la quantification des génomes viraux, série diluer un montant connu d'un ADN γHV68 bacmide avec l'ADN génomique isolé à partir des cellules non infectées. Exécuter qPCR en parallèle avec les ADN extraites de la infectionTed tissus en utilisant les mêmes ensembles de virus des amorces spécifiques.
5. Présenter la charge du génome viral dans les tissus comme le nombre de copies d'ADN viral par unité (par exemple 100 ng ou 500 ng) d'ADN génomique après normalisation actine.

6. Les résultats représentatifs:

La figure 1 illustre le schéma d'ensemble des expériences pour la mesure de γHV68 infection chez les souris in vivo. Des résultats représentatifs de titres de virus dans les poumons lors d'une infection aiguë de γHV68, telle que déterminée par dosage de plaque, ont été montrées dans la figure 2A. Une souche mutante de γHV68 contenant non fonctionnelles virale Bcl-2 (vBcl-2) reproduit à des niveaux comparables à ceux de type sauvage γHV68 dans les poumons après 7 jours d'infection intranasale de souris BALB / c (6 - 7 souris par groupe). Aucune différence statistiquement significative dans les poumons des titres du virus ont été détectés entre deux groupes. Ces données indiquent que vBcl-2 n'est pas un facteur crucial pour l'infection aiguë des γHV68 ausouris. Cependant, après l'infection de 28 jours, le titre du vBcl-2 virus mutant dans la rate a baissé de 6 - à 10 - fois par rapport au WT, telle que mesurée par dosage de centre infectieux (figure 2B), suggérant que le vBcl-2 mutant du virus γHV68 est défectueux dans le maintien de la latence spléniques après l'infection. En accord avec le centre de réduction des titres infectieux, la charge virale du génome du virus mutant vBcl-2 a été sévèrement réduite par rapport à celle des virus WT à 28 jours dans des expériences répétées, comme le montre la figure 2C. L'étroite corrélation entre les charges génome viral et la fréquence des latente HV68vBcl-2 in vivo le virus mutant ex réactivation au stade de l'infection latente met en évidence un défaut de latence de cette infection par le virus mutant.

Figure 1. Schéma pour la mesure de γHV68 infection chez les souris par le biais de la formation de la plaque, le centre infectieuses, et le dosage qPCRs.

Figure 2. Infection lytique et latente de l'γHV68 WT et mutant virus in vivo. Réplication aiguë (A) de la WT et mutant vBcl-2 γHV68 virus dans les poumons des souris BALB / c à 7 dpi (jours après l'infection) a été déterminée par dosage de plaque. (B et C) splénique centres infectieuses (B) et la charge du génome viral (C) dans la rate de souris infectées ont été mesurées à 28 dpi par le dosage du centre infectieuses et qPCR, respectivement. Les lignes rouges, les moyennes des valeurs indiquées. ns, non significatif.

Discussion

γHV68 a été largement utilisé comme un modèle pour comprendre la pathogenèse de l'humain γ-HVS ^2,4,5. Dans ce protocole, nous avons décrit trois méthodes couramment utilisées, y compris essai de plaque pour titre viral infectieux, test de circuits intégrés pour la charge virale latente, et qPCR pour la charge du génome viral, pour évaluer l'infection aiguë et latente de γHV68 après inoculation intranasale chez des souris.

Le dosage de la plaque a été largement utilisée pour déterminer le titre du virus dans les cellules ou des tissus infectés, mais les conditions optimales varient pour le virus utilisé. Ceci est largement parce que la capacité des différents virus de produire des plaques (lésions dénombrables) sur une monocouche de cellules est différent. γHV68 produit normalement plaques évidentes sur la monocouche de cellules Vero de singe ou des cellules de souris cultivés tels que NIH3T12 ou 3T3, 6 - 7 jours après l'infection. Notamment, la sensibilité des cellules à l'infection virale diminue avec le vieillissement de monocouche ou deviennent surchargées Ainsi, nousutilisent généralement moins de 50% de confluence des cellules Vero pour le dosage de la plaque, ce qui, dans notre expérience, démontre les meilleurs résultats pour γHV68. En outre, une monocouche uniformément réparti et fraîchement faite est fortement recommandé pour la précision du comptage plaque. Tout en faisant la dilution en série des échantillons du virus, des précautions doivent être prises pour éviter les bulles et les embouts de pipettes doivent être changés entre chaque titrage. Pour les échantillons de virus de haute titrés, 10 dilutions successives sont recommandées, sinon, 2 - à 5 dilutions successives sont utilisés.

Contrairement à une infection aiguë au virus infectieux qui peuvent être directement analysés par la capacité formant des plaques, latente tissus infectés / échantillons de γ-HVS ne contiennent généralement pas détectables de virus infectieux préformé, au contraire, l'ADN viral est maintenu comme un épisome circulaire avec quelques gènes exprimé ^6,7. Dans ce cas, la charge de latence virale peut être déterminée par la fréquence de la réactivation ex vivo du virus de la de VITRexplants o cellules latentes infectées sur une culture de cellules permissives indicateur (par exemple des cellules Vero) ^8. À cette fin, la suspension cellulaire unique de tissus infectés est préparé, comptés et plaquées sur des monocouches de cellules sensibles, qui sont ensuite recouvertes d'un milieu essai de plaque. Dans ce protocole, nous avons décrit comment préparer des suspensions cellulaires simples de la rate pour le dosage IC à mesurer la quantité de virus latents qui a la capacité de réactiver par la rate ou la population par des splénocytes ^4. Puisque seule une petite population de splénocytes sont infectées de façon latente, nous avons l'habitude de préparer série faibles dilutions de la suspension splénocytes pour tester titre infectieux. Des précautions extrêmes doivent être prises pendant toute la procédure pour éviter de sévères cellules pipetage ou vortex. Il est important de noter que les cellules B de la rate explantés montrent généralement faible viabilité ^9, qui pourrait affecter l'efficacité de la réactivation ex vivo. Tout gène qui améliore la survie des latencellules infectées TLY pourrait indirectement favoriser l'efficacité de la réactivation ex vivo du virus.

Comparé avec les dosages formant des plaques et IC, qPCR fournit un moyen efficace de quantifier avec précision lymphocytaire γ-HVS chez des souris infectées _10. Il est particulièrement utile pour un virus à de mauvaises plaque capacité à former en raison de sa cytotoxicité minimale pour les cellules Vero ou d'autres indicateurs, et peut être appliquée pour les deux échantillons de manière aiguë et une infection chronique. Une courbe standard est nécessaire et important pour quantifier avec précision les génomes viraux. Nous avons développé γHV68 courbes standard basée sur l'amplification du gène ORF56, en utilisant un clone bacmide contenant le génome γHV68 ^8. qPCR réaction est extrêmement sensible pouvant détecter même quelques copies d'ADN viral par réaction PCR quantitative, bien au-delà des limites de dosage de la plaque. Précautions doivent toutefois être mis en place pour éviter toute contamination croisée entre les échantillons tout en incluant uninfecteéchantillons d si nécessaire des contrôles négatifs pour chaque réaction. La spécificité de la réaction de PCR quantitative peut être un problème grave en particulier pour les échantillons de tissus infectés, puisque énorme quantité d'ADN cellulaire peuvent affecter le signal du virus de l'amplification spécifique. Cependant, cela peut être détectée par la fonte analyse de la courbe pour les non-spécifique des produits amplifiés. Dans les populations infectées naturellement splénocytes, la fréquence des γHV68 cellules porteuses peut être très faible. Dans ce scénario, comme un complément à l'analyse qPCR utilisant l'ADN quasi-espèces, en limitant la dilution PCR (LD-PCR) fournit une alternative à l'avantage d'évaluer la fréquence des infections virales génome cellules porteuses de ^11,12. Brièvement, γ-HVS lymphocytes infectés sont dilués en série. L'ADN extrait de ces cellules est d'être utilisé pour un test PCR nichée sensibles, qui peuvent détecter la présence d'une seule copie d'ADN viral dans les échantillons individuels. Une analyse combinée de limiter la dilution et qPCR va révéler à la fois la fréquence des cellules infectées de façon latente et the la charge virale ADN latent.

Notamment, le dosage de IC ne peut pas être utilisée comme une méthode autonome pour mesurer la charge virale latente, en raison du fait qu'il ne fait pas de distinction entre les réductions de charges latentes virale par rapport à une défaillance du virus latent se réactiver. Comme mesure supplémentaire de la latence virale, qPCR est utilisée pour évaluer quantitativement les copies du génome viral dans les tissus infectés. Une corrélation entre la réduction des charges génome viral et le titre du centre infectieuses suggère un défaut de latence du virus. En revanche, une grande disparité entre les charges génome viral et le titre latente virale faible dirais que même si le virus est capable de maintenir un pool d'ADN virale latente, il est incapable de relancer efficacement à partir de latence.

En conclusion, les méthodes décrites dans ce protocole ont aussi généralement applicables à d'autres herpèsvirus que γHV68, pour lequel la cellule ciblée types et séquences génomiques virales sont disponibles et permettent èmee d'évaluation univoque des cycles de vie distincts in vivo. Il peut également être utilisée pour traiter le rôle biologique des facteurs de virulence spécifiques dans le contexte de l'infection de la souris. Par exemple, en comparant la réplication virale différente des Bcl-2 mutant γHV68 avec celle du type sauvage γHV68, nos travaux récents ⁸ nous permet de déterminer la fonction des vBcl-2 (apoptose par exemple, l'autophagie, ou les deux) contribue à l'en comportement in vivo de ce virus dans l'infection aiguë et chronique chez la souris. Ainsi, ils représentent aussi d'importants outils pour disséquer les interactions virus-hôte lors de l'infection.