Summary
γ - Herpesviruses (γ-HVS) अपने मेजबान में जीवन भर अटलता की स्थापना. Γ-HV68 के साथ चूहों के संक्रमण एक आनुवंशिक विनयशील प्रदान करता है
Abstract
γ - Herpesviruses (γ-HVS) उनके lymphoid 1 कोशिकाओं की अव्यक्त संक्रमण स्थापित करने की क्षमता के लिए उल्लेखनीय हैं. मानव EBV और KSHV जैसे γ-HVS, संकीर्ण मेजबान रेंज, गंभीर विस्तृत रोगजनक पढ़ाई रुकावट है. Murine 68 γ herpesvirus (γHV68) γ-HVS और मानव के साथ व्यापक आनुवंशिक और जैविक समानता शेयरों murid 2 कृन्तकों की एक प्राकृतिक रोगज़नक़ है . जैसे वायरल संक्रमण के विभिन्न चरणों में जन्मजात उपभेदों चूहों के γHV68 संक्रमण के मूल्यांकन γ-HVS संक्रमण के दौरान वायरल जीवन चक्र और रोगजनन समझने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल उपलब्ध कराता है.
Intranasal टीका होने पर, γHV68 के फेफड़ों में तीव्र viremia में संक्रमण का परिणाम है कि बाद में splenocytes और अन्य कोशिकाओं है, जो 3,4 मेजबान के जीवन भर सक्रिय किया जा सकता का एक अव्यक्त संक्रमण में हल हो गई है. इस प्रोटोकॉल में, हम का वर्णन करेंगे कैसे गधे पट्टिका परख का उपयोग करने के लिएबाद intranasal संक्रमण (डीपीआई) के फेफड़ों में संक्रामक वायरस टिटर प्रारंभिक चरण (7 दिनों 5) में वेरो सेल monolayers पर homogenates. जबकि तीव्र संक्रमण काफी हद तक 2 को मंजूरी दे दी है - 3 सप्ताह postinfection, γHV68 की एक अव्यक्त संक्रमण डीपीआई 14 के आसपास की स्थापना की है पर बाद में चूहों की तिल्ली में बनाए रखा. अव्यक्त संक्रमण आमतौर पर संक्रमित ऊतकों में कोशिकाओं की एक बहुत छोटी आबादी को प्रभावित करता है, जिससे वायरस निष्क्रिय रहता है और अपने जीन की अभिव्यक्ति के सबसे बन्द हो जाता है. गुप्त रूप से संक्रमित splenocytes अनायास टिशू कल्चर है जो एक संक्रामक केंद्र परख (आईसी) के द्वारा recapitulated वायरल अव्यक्त लोड निर्धारित किया जा सकता है में explanting पर वायरस को पुन: सक्रिय. आगे तीव्रता और / या गुप्त रूप से संक्रमित ऊतकों, मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर में वायरल जीनोम प्रतियां की राशि का अनुमान (qPCR) अपनी अधिक से अधिक संवेदनशीलता और सटीकता के लिए प्रयोग किया जाता है. qPCR और पट्टिका परख, और / या आईसी परख के परिणामों के संयुक्त विश्लेषण वायरल के spatiotemporal प्रोफाइल खोलेगाप्रतिकृति और vivo में संक्रामकता.
Protocol
निम्नलिखित प्रोटोकॉल वायरस lytic और अव्यक्त γHV68 के चूहों में संक्रमण चक्र है, जो सैद्धांतिक अन्य γHV68 के समान जीवन शैली साझा वायरस के संक्रमण का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और titers वायरल जीनोम भार के अध्ययन का वर्णन करेंगे.
1. ΓHV68 के प्रवर्धन
- 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एक γHV68 के जमे हुए शीशी पहले गला लें.
- NIH3T12 या 3T3 सेल संस्कृति (~ confluency 50%) वायरल inoculums 10 सेमी व्यंजन और संस्कृति संक्रमित कोशिकाओं में 37 में जोड़ें ° सी में 5% सीओ 2.
- कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव (CPE) के लिए माइक्रोस्कोपी से संस्कृति की जांच करने और एक समय में मीडिया इकट्ठा जब कोशिकाओं के 80% से अधिक संक्रमण के बाद ~ 5 दिन 4 CPE दिखाने. वायरस की उपज को अधिकतम करने के लिए, दो बार संक्रमित कोशिका संस्कृति जमे हुए और thawed सभी γHV68 सेल से जुड़े को रिहा किया जा सकता है.
- कमरे के तापमान (आरटी) में 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर एकत्र मीडिया सेल मलबे को हटाने के अपकेंद्रित्र.
- ध्यान से नीचे सेल मलबे को छू के बिना नया ट्यूब (उच्च गति अपकेंद्रित्र ट्यूब) supernatants हस्तांतरण.
- उच्च गति 4 पर 12,000 rpm पर (SA-600 Sorvall के लिए) अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस कम से कम 1.5 घंटे के लिए ध्यान केंद्रित करने के लिए वायरल कणों.
- 10γ ब्लीच समाधान में supernatants त्यागें और ध्यान से 1ml सीरम मुक्त DMEM के साथ गोली (वायरस और अवशिष्ट सेल मलबे) फिर से निलंबित. एक 1.5 मिलीलीटर सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में फिर से निलंबित गोली स्थानांतरण और मिश्रण अच्छी तरह से vortexing द्वारा.
- अधिकतम गति से 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र अवशिष्ट सेल मलबे को हटाने और एक नया ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला (वायरस शेयर) हस्तांतरण. इस संक्रमण के लिए अंतिम वायरल स्टॉक. वायरस शेयर की अनुमापांक पट्टिका परख (नीचे देखें) के द्वारा निर्धारित किया जाता है.
2. ΓHV68 साथ चूहे की intranasal संक्रमण
- ~ उम्र के 6 सप्ताह में चूहों +१,००० साथ ~ γHV68 प्रति चूहों की 5,000 पट्टिका गठन इकाइयों (pfu) को संक्रमित.
- असंवेदनता उत्पन्न करनाketamine / xylazine (60 / 80 मिलीग्राम / एमएल ketamine और 12 मिलीग्राम / मिलीलीटर xylazine का एक मिश्रण के μl माउस) के peritoneal गुहा में इंजेक्शन द्वारा चूहों. चूहों पैर की अंगुली pinching द्वारा संज्ञाहरण मॉनिटर. यह आमतौर पर ~ 5-10 मिनट लेता है. यदि चूहों पूरी तरह से संवेदनाहृत नहीं कर रहे हैं, वे वायरस छींक जाएगा.
- जब माउस को पूरी तरह anesthetized है, एक विंदुक का उपयोग करने के लिए चूहों को धीरे धीरे लेकिन लगातार ड्रॉप द्वारा ड्रॉप ~ पीबीएस युक्त γHV68 के 30 μl (प्रत्येक नथुने में 15 μl) का टीका लगाना. यकीन है कि माउस वास्तव में बुलबुले फार्म की कोशिश कर के बिना बूँदें inhaling है.
- 10-15 मिनट के लिए माउस को ठीक करने के लिए और उन्हें पिंजरे के लिए लौटने से पहले चूहों (जैसे चेतना, श्वास, आदि) के कल्याण की निगरानी की अनुमति दें. पशु दैनिक बीमारी और भोजन, पानी, और बिस्तर की स्थिति की पर्याप्तता के लिए जाँच कर रहे हैं. यदि बीमारी, दर्द, या संकट के नैदानिक लक्षण विकसित, दिनचर्या को एटियलजि निर्धारित निदान आयोजित किया जाएगा. पशु कि अपने शरीर के वजन के 20 से अधिक% खो अधिकतम वजन घटाने के लिए दर्ज किया जाएगाऔर euthanized. इच्छामृत्यु प्रदर्शन का अंतिम निर्णय नैदानिक पशुचिकित्सा के विवेक पर है और प्रमुख अन्वेषक के साथ निम्नलिखित परामर्श दिया है.
3. तीव्रता से संक्रमित फेफड़े में वायरस टिटर निर्धारित फलक परख
- वायरस संक्रामकता titers वेरो कोशिकाओं के monolayers पर पट्टिका गठन के द्वारा निर्धारित कर रहे हैं.
- वेरो कोशिकाओं 2.5x10 4 कोशिकाओं पर / 12 में अच्छी तरह से अच्छी तरह प्लेटें वरीयता प्राप्त पट्टिका परख पहले दिन. कोशिकाओं को समान रूप से हो और वितरित करना चाहिए सेल घनत्व 30 तक पहुंच जाना चाहिए - पट्टिका परख के दिन पर 40%.
- 0.5% (w / v) methylcellulose उपरिशायी (एमसी) मध्यम (1 टेबल) तैयार करें.
- 5-7 दिनों के बाद intranasal फेफड़ों में संक्रमण तीव्र चरण वायरस titers निर्धारित γHV68 संक्रमित चूहों का बलिदान. Euthanization Ketamine एचसीएल (अनुसूचित जाति 80-100 मिलीग्राम / किग्रा, आईएम, आईपी) के लिए administrated हो आईएम ना pentobarbital (30-50 आईपी मिलीग्राम / किग्रा) की नसों में अधिक मात्रा द्वारा पीछा किया. इस विधि टी द्वारा मंजूरी दे दी हैवह पशु चिकित्सा अमेरिकन मेडिकल एसोसिएशन.
- फेफड़ों हार्वेस्ट और 1 x पीबीएस के साथ दो बार कुल्ला रक्त कोशिकाओं को हटाने. 1 मिलीलीटर बर्फ ठंड पूरा DMEM मध्यम में फेफड़ों की एक साइड लीजिए और बर्फ पर रख. -80 ° सी में तेजी से फेफड़ों में qPCR (नीचे देखें) द्वारा वायरल डीएनए लोड की जांच करने के लिए फेफड़ों और दुकान के दूसरे पक्ष फ्रीज.
- अधिकतम गति पर 1 सेकंड, फ्रीज पिघलना और तीन बार के लिए फेफड़ों के ऊतकों homogenize एक ऊतक homogenizer का प्रयोग करें. 70% इथेनॉल के साथ हर कदम पर homogenizer जब नमूना बदलने धो.
- 4 में 10 मिनट के लिए 3000 rpm पर homogenized ऊतक अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस सतह पर तैरनेवाला लीजिए और पट्टिका परख के लिए नए ट्यूबों के लिए स्थानांतरण.
- सादे DMEM के साथ 1.5 मिलीलीटर सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूबों में भंवर द्वारा फेफड़ों homogenate नमूने के धारावाहिक dilutions (10 ° से 10 से -8 आमतौर पर) तैयार करें . Prefill 540 μl DMEM के साथ ट्यूबों के उपयुक्त संख्या और पहले ट्यूब में 60 μl homogenate पतला. पहली ट्यूब से 60 μl मैं स्थानांतरणअगले, नहीं एक और इतने पर.
- 12 अच्छी तरह प्लेटें में तैयार वेरो monolayers से मीडिया महाप्राण (व्यंजन) और 200 / अच्छी तरह से क्रमानुसार पतला एक रिवर्स क्रम में (10 -8 से 10 ° से) संक्रामक वायरस युक्त homogenate μl लोड . प्रत्येक अनुमापन (दो प्रतियों में) के लिए दो कुओं का प्रयोग करें.
- वायरस inoculums 1 घंटा के साथ 37 वेरो कोशिकाओं सेते डिग्री सेल्सियस धीरे से प्लेटें समान रूप से हर 15 मिनट monolayer अधिक वायरस को वितरित करने के लिए जल का भँवर.
- Inoculums निकालें और यह उपरिशायी / मध्यम (तालिका 1) का अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर के साथ की जगह. 37 पर एक सप्ताह के लिए प्लेटें सेते डिग्री सेल्सियस
- उपरिशायी मध्यम निकालें (जरूरत को पूरा नहीं करता है) और / ठीक पट्टिका परख के दाग मध्यम (तालिका 1) के साथ की जगह है और आरटी पर कम से कम 1 घंटा के लिए सेते हैं.
- जब प्लेटें सूख रहे हैं, प्रत्येक कमजोर पड़ने पर अच्छी तरह से पृथक सजीले टुकड़े की संख्या गिनती. त्रुटि कम से कम करने के लिए, केवल 10 और 100 सजीले टुकड़े के बीच युक्त कुओं गिने जाते हैं.
- वायरस टिटर का उपयोग follo की गणनाविंग सूत्र: अनुमापांक (pfu / मिली) = [(/ सजीले टुकड़े के अच्छी तरह से संख्या) / (/ inoculums अच्छी तरह से की मात्रा)] एक्स कमजोर पड़ने कारक.
4. संक्रामक केंद्र के लिए गुप्त रूप से संक्रमित Splenocytes में वायरस लोड निर्धारित परख
- वायरल अव्यक्त लोड वेरो कोशिकाओं के monolayer पर संक्रामक केंद्र परख (आईसी) के द्वारा निर्धारित किया जाता है. 6 अच्छी तरह प्लेटें में आईसी परख, बीज वेरो कोशिकाओं (1 - 2.5 एक्स 10 5 कोशिकाओं / अच्छी तरह से हम आम तौर पर तिल्ली नमूना प्रति 11 कुओं का उपयोग, 10 कुओं serially पतला splenocytes निलंबन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा और परीक्षण के लिए अच्छी तरह से एक दिन पहले फ्रीज पिघलना चक्र के बाद वायरस का सहज पुनर्सक्रियन.
- संक्रमित चूहों के बाद विलंबता (- 14 दिनों के संक्रमण के बाद 12) की स्थापना की है बलिदान. माउस प्लीहा और उन्हें एक मिलीलीटर ठंडा DMEM में पूल हार्वेस्ट.
- यांत्रिक माउस तिल्ली के पृथक्करण. एक 10 सेमी की थाली में हौसले से पृथक माउस spleens स्थानांतरण और वांछित 2% FBS के साथ DMEM जैसे माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें. गीले दो पाले सेओढ़ लिया कांच अंत microscope ठंडा मध्यम के साथ स्लाइड. एक स्लाइड और अन्य स्लाइड के पाले सेओढ़ लिया के अंत बढ़त के साथ कैप्सूल निक के पाले सेओढ़ लिया तरफ तिल्ली प्लेस. यंत्रवत् दो स्लाइड्स के बीच तिल्ली अलग कर देना जब तक कि सभी लाल clumps (वसा कणों को दूर अगर वर्तमान) कुचल कर रहे हैं.
- DMEM के साथ स्लाइड्स कुल्ला करने के लिए दोनों स्लाइड पर शेष कोशिकाओं को ठीक करने के लिए.
- पूरे ऊतक निलंबन धीरे एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पेंच टोपी में एक सेल झरनी (40 सुक्ष्ममापी नायलॉन जाल) के माध्यम से स्थानांतरण. 10 सेमी 10 मिलीलीटर पीबीएस और हस्तांतरण के साथ तिल्ली homogenates युक्त जबकि फ़िल्टरिंग पकवान धो लें.
- 375 XG में एकल कक्ष निलंबन 10 मिनट अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. सेल छर्रों झाड़ मौजूदा सेल clumps को तोड़ने. लाल रक्त कोशिकाओं lyse 5 मिलीलीटर ACK बफर (तालिका 1) जोड़ें. 5 मिनट सेते हैं और 375 x जी पर फिर से अपकेंद्रित्र
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और फिर निलंबित छर्रों, अच्छी तरह से, अभी तक धीरे पीबीएस में 2% FBS के साथ. 4 में कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस रखें एक विंदुक प्रयोग करेंमलबे को हटा दें, यदि कोई हो. व्यवहार्य एक स्वचालित सेल काउंटर (जैव रेड) का उपयोग कोशिकाओं की गणना.
- नीचे 4 मिनट के लिए 375 XG पर पीबीएस resuspended splenocytes स्पिन. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 4 मिलीलीटर पूरा DMEM (2 x 1 मिलीलीटर मूल निलंबन के आईसी परख के लिए इस्तेमाल किया जाएगा में resuspend कोशिकाओं, 0.6 मिलीलीटर आईसी परख में सीरियल पांच गुना कमजोर पड़ने के लिए इस्तेमाल किया; वायरल डीएनए तैयार करने और qPCR के लिए 0.4 मिलीलीटर, और 1 मिलीलीटर निलंबन तीन फ्रीज पिघलना चक्र के बाद अव्यक्त वायरस की सहज पुनर्सक्रियन का मूल्यांकन किया जाएगा)
- डुप्लिकेट में splenocytes निलंबन के धारावाहिक पांच गुना dilutions (यानी 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250) तैयार करें. Prefill 2.4 मिलीलीटर DMEM और पहले ट्यूब में 600 μl splenocytes निलंबन पतला और मिश्रण अच्छी तरह के साथ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों. पिछले ट्यूब से अगले ट्यूब में 600 μl स्थानांतरण, आदि भंवर मत करो!
- वेरो कोशिकाओं के तैयार monolayer 6 अच्छी तरह से मध्यम महाप्राण (व्यंजन). बीज प्रत्येक कमजोर पड़ने dupl के साथ serially - पतला वेरो कोशिकाओं पर splenocytes 1 मिलीलीटरicated (10 कुओं 0, 1 5 / 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250 dilutions के लिए इस्तेमाल किया जाएगा).
- 37 में 8-12 बजे के प्लेटें सेते डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 . 24 घंटे से अधिक मत करो. वरीयता प्राप्त splenocytes निलंबन महाप्राण (व्यंजन) और एक अच्छी तरह से 4 मिलीलीटर उपरिशायी मीडिया (1 टेबल) लोड. एक अतिरिक्त 6 दिनों के लिए सेते हैं.
- 0.2% (w / v) के साथ क्रिस्टल बैंगनी प्लेटें धुंधला के रूप में पट्टिका परख में दिखाया द्वारा तिल्ली संक्रामक केन्द्रों के स्तर का निर्धारण करते हैं.
5. वायरल जीनोम की मात्रा का ठहराव
- जैसे फेफड़ों और तिल्ली के नमूने γHV68 संक्रमित, इस प्रयोग में ऊतकों से कुल जीनोमिक डीएनए निकालें. DNeasy रक्त और ऊतक किट (Qiagen) निर्माता प्रोटोकॉल के बाद का उपयोग करें.
- प्रत्येक नमूने के डीएनए एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए डीएनए के एक ही राशि qPCR परख के लिए इस्तेमाल किया जा रहा सुनिश्चित करने के लिए. वायरस विशिष्ट प्राइमरों (~ 200 बीपी amplicon qPCR परख के लिए पसंद है) डिजाइन. हम γHV68 ORF56 विशिष्ट प्राइमरों (आगे प्राइमर इस्तेमाल किया: 5 जनसंपर्क &IME; - GTAACTCGAGACTGAAACCTCGCAGAGGTCC - 3 ', रिवर्स प्राइमर: 5'-CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG-3': 5'-cacccacactgtggcccatcat-3 'रिवर्स प्राइमर: 5'-gtgaggatcttcatgaggtagtc-3') के रूप में इस परख और β-actin (आगे प्राइमर प्राइमरों के लिए) qPCR प्रतिक्रिया के लिए एक नियंत्रण.
- (- 500 एनजी अच्छा 100) और 2 एक्स SYBR मास्टर मिश्रण (जैव रेड बुद्धि SYBR ग्रीन Supermix) के साथ उपयुक्त प्राइमरों डीएनए नमूने मिक्स. जैव रेड वास्तविक समय पीसीआर सिस्टम का प्रयोग करने के लिए संक्रमित ऊतकों में वायरल लोड यों. निम्नलिखित हालत में पीसीआर प्रदर्शन: 95 ° 15 मिनट और 95 के 45 चक्रों के लिए सी ° सी 30 मिनट के लिए, 60 ° सी के लिए 30 मिनट और 72 डिग्री सेल्सियस 30 मिनट, वक्र विश्लेषण के पिघलने के द्वारा दोनों वायरल और के लिए, बाद के लिए actin amplicons.
- वायरल जीनोम की मात्रा का ठहराव के लिए एक मानक वक्र बनाने के लिए, serially γHV68 जीनोमिक डीएनए के साथ असंक्रमित कोशिकाओं से अलग bacmid डीएनए के ज्ञात मात्रा पतला. भागो समानांतर में qPCR साथ DNAs infec से लिया गयावायरस के विशिष्ट प्राइमरों के एक ही सेट का उपयोग टेड ऊतकों.
- प्रति यूनिट वायरल डीएनए की नकल actin सामान्यीकरण के बाद जीनोमिक डीएनए की संख्या (जैसे एनजी 100 या 500 एनजी) के रूप में ऊतकों में वायरल जीनोम लोड पेश.
6. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 1 में vivo चूहों में γHV68 संक्रमण की माप के लिए प्रयोगों की समग्र योजना दर्शाया गया है. ΓHV68, के रूप में पट्टिका परख द्वारा निर्धारित की तीव्र संक्रमण के दौरान फेफड़ों में वायरस titers का प्रतिनिधि परिणाम, चित्रा 2A में दिखाया गया. ΓHV68 से युक्त एक उत्परिवर्ती तनाव गैर कार्यात्मक वायरल बीसीएल - 2 (vBcl 2) स्तरों पर γHV68 जंगली - प्रकार तुलनीय 7 दिनों BALB / ग चूहों (6 - समूह 7 प्रति चूहों) के intranasal संक्रमण के बाद फेफड़ों में दोहराया. दो समूहों के बीच वायरस के फेफड़ों titers में कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर पाया गया. इस डेटा को इंगित करता है कि vBcl-2 में γHV68 की तीव्र संक्रमण के लिए एक महत्वपूर्ण कारक नहीं हैचूहों. हालांकि, 28 दिनों postinfection से spleens में vBcl-2 उत्परिवर्ती वायरस के अनुमापांक 6 गिरा - 10 - गुना WT, के रूप में संक्रामक केंद्र परख (चित्रा 2B) द्वारा मापा की तुलना में, सुझाव है कि vBcl-2 उत्परिवर्ती γHV68 वायरस संक्रमण के बाद प्लैहिक विलंबता के रखरखाव में दोषपूर्ण है. कम संक्रामक केंद्र titers के साथ समझौते में, vBcl-2 उत्परिवर्ती वायरस के वायरल जीनोम लोड गंभीर दोहराया प्रयोगों में 28 दिन में WT वायरस, के रूप में चित्र 2C में दिखाया गया है कि तुलना में कम हो गया था. वायरल जीनोम अव्यक्त - HV68vBcl-2 उत्परिवर्ती संक्रमण के अव्यक्त अवस्था में वायरस पुनर्सक्रियन पूर्व vivo की आवृत्ति और भार के बीच घनिष्ठ संबंध इस उत्परिवर्ती वायरस के संक्रमण के एक विलंबता दोष पर प्रकाश डाला गया.
चित्रा 1 पट्टिका गठन के माध्यम से, संक्रामक केंद्र, और qPCR परख के द्वारा चूहों में γHV68 संक्रमण की माप के लिए योजनाबद्ध आरेख.एस
चित्रा 2 WT और उत्परिवर्ती vivo में γHV68 वायरस के lytic और अव्यक्त संक्रमण. WT और उत्परिवर्ती vBcl-2 γHV68 वायरस की तीव्र (ए) 7 डीपीआई (दिन पोस्ट संक्रमण) BALB / ग चूहों के फेफड़ों में नकल पट्टिका परख द्वारा निर्धारित किया गया था. (बी और सी) प्लैहिक संक्रामक केन्द्रों (बी) और संक्रमित चूहों के spleens में वायरल जीनोम लोड (सी) 28 डीपीआई पर संक्रामक केंद्र परख और qPCR द्वारा मापा गया, क्रमशः. लाल लाइनों के साथ, संकेत मूल्यों के औसत. एनएस, महत्वपूर्ण नहीं है.
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Discussion
γHV68 व्यापक रूप से किया गया है एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल मानव γ-HVS 2,4,5 के रोगजनन को समझने की. इस प्रोटोकॉल में, हम तीन संक्रामक वायरस टिटर के लिए पट्टिका परख, वायरल अव्यक्त लोड करने के लिए आईसी परख, और वायरल जीनोम लोड के लिए qPCR सहित नियमित तरीकों का इस्तेमाल किया, वर्णित है, चूहों में intranasal टीका γHV68 की तीव्र और अव्यक्त संक्रमण के बाद का मूल्यांकन.
पट्टिका परख बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है संक्रमित कोशिकाओं या ऊतकों में वायरस टिटर निर्धारित है, लेकिन इष्टतम स्थितियों को भिन्न के लिए वायरस इस्तेमाल किया जा रहा है. यह काफी हद तक है, क्योंकि अलग वायरस की क्षमता के लिए एक सेल monolayer पर सजीले टुकड़े (गणनीय घावों) का उत्पादन करने के लिए अलग है. 7 दिनों के संक्रमण के बाद γHV68 सामान्य बंदर वेरो कोशिकाओं या NIH3T12 या 3T3, 6 के रूप में सभ्य माउस कोशिकाओं के monolayer पर स्पष्ट सजीले टुकड़े का उत्पादन. विशेष रूप से, सेल monolayer की उम्र के रूप में वायरल संक्रमण में गिरावट आती है या हो जाता है के लिए संवेदनशीलता की भीड़ इस प्रकार हम,आमतौर पर कम से कम 50% पट्टिका परख है, जो हमारे अनुभव में, γHV68 के लिए सबसे अच्छा परिणाम को दर्शाता है लिए वेरो कोशिकाओं के confluency का उपयोग करें. इसके अलावा, एक समान रूप से वितरित और हौसले से बनाया monolayer पट्टिका गिनती की सटीकता के लिए अत्यधिक की सिफारिश की है. जबकि वायरस के नमूने के धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाने, सावधानी बुलबुले से बचने और pipet सुझावों प्रत्येक अनुमापन के बीच परिवर्तित किया जाना चाहिए करने के लिए लिया जाना चाहिए. 2 अन्यथा - 5 गुना धारावाहिक dilutions के लिए उपयोग किया जाता है, उच्च titered वायरस के नमूने के लिए 10 गुना धारावाहिक dilutions की सिफारिश कर रहे हैं.
तीव्र संक्रमण है जिसमें संक्रामक वायरस सीधे पट्टिका बनाने की क्षमता के द्वारा assayed किया जा सकता है के विपरीत, गुप्त रूप से संक्रमित / γ-HVS के ऊतकों के नमूनों आमतौर पर detectable preformed संक्रामक वायरस शामिल नहीं है, बजाय, वायरल डीएनए कुछ जीन के साथ एक परिपत्र episome के रूप में बनाए रखा है 6,7 व्यक्त. इस मामले में, वायरल लोड विलंबता vitr में से वायरस के पूर्व vivo पुनर्सक्रियन की आवृत्ति द्वारा निर्धारित किया जा सकता हैएक अनुमोदक सूचक सेल संस्कृति (जैसे वेरो कोशिकाओं) 8 पर गुप्त रूप से संक्रमित कोशिकाओं के ओ explants. यह अंत करने के लिए, संक्रमित ऊतकों की एकल कक्ष निलंबन के लिए तैयार है, गिना, और अतिसंवेदनशील कोशिकाओं, जो तब पट्टिका परख माध्यम से मढ़ा जाता है monolayers पर मढ़वाया. इस प्रोटोकॉल में, हम कैसे आईसी परख के लिए तिल्ली के एकल कक्ष निलंबन तैयार करने के लिए अव्यक्त वायरस की राशि है कि तिल्ली या 4 splenocytes के प्रति जनता के प्रति पुन: सक्रिय करने की क्षमता को मापने वर्णित है. Splenocytes के केवल एक छोटे से जनसंख्या के बाद से गुप्त रूप से संक्रमित है, हम आम तौर पर संक्रामक अनुमापांक परीक्षण के लिए splenocytes निलंबन के धारावाहिक गुना कम dilutions तैयार. पूरी प्रक्रिया के दौरान चरम सावधानी से लिया जाना चाहिए करने के लिए कठोर pipetting या कोशिकाओं vortexing से बचने के. यह महत्वपूर्ण है कि explanted बी कोशिकाओं तिल्ली से आम तौर पर गरीब 9 व्यवहार्यता, जो पूर्व vivo पुनर्सक्रियन की क्षमता प्रभावित हो सकता है दिखाने के नोट. किसी भी जीन है कि देर होना य देर करना के अस्तित्व में सुधारtly संक्रमित कोशिकाओं को परोक्ष रूप से वायरस के पूर्व vivo पुनर्सक्रियन की दक्षता की सुविधा सकता है.
पट्टिका बनाने और आईसी assays के साथ तुलना में, qPCR एक प्रभावी साधन प्रदान करता है के लिए सही लिम्फोसाईटिक संक्रमित 10 चूहों में γ-HVS यों है. यह गरीब पट्टिका के गठन वेरो या अन्य संकेतक कोशिकाओं को कम से कम cytotoxicity के कारण क्षमता के साथ एक वायरस के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, और दोनों तीव्रता और चिरकाल संक्रमित नमूनों के लिए लागू किया जा सकता है. एक मानक वक्र सही वायरल जीनोम बढ़ाता के लिए आवश्यक है और महत्वपूर्ण है. हम γHV68 मानक ORF56 जीन प्रवर्धन पर आधारित घटता विकसित की है, एक bacmid क्लोन युक्त γHV68 8 जीनोम का उपयोग . qPCR प्रतिक्रिया बेहद संवेदनशील है प्रति qPCR प्रतिक्रिया वायरल डीएनए तक पट्टिका परख की सीमाओं से परे भी कुछ प्रतियां का पता लगाने में सक्षम किया जा रहा है. सावधानियों लेकिन जगह में रखा जाना चाहिए करने के लिए नमूनों के बीच पार संक्रमण से बचने जबकि uninfecte सहितप्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में घ के नमूने. qPCR प्रतिक्रिया की विशिष्टता संक्रमित ऊतकों के नमूनों के लिए विशेष रूप से एक गंभीर मुद्दा हो सकता है, सेलुलर डीएनए की विशाल राशि के बाद से विशिष्ट वायरस प्रवर्धन के संकेत को प्रभावित कर सकते हैं कर सकते हैं. हालांकि यह nonspecific प्रवर्धित उत्पादों के लिए वक्र विश्लेषण पिघलने से पता लगाया जा सकता है. स्वाभाविक रूप से संक्रमित splenocyte आबादी में, γHV68 असर कोशिकाओं के आवृत्ति बहुत कम किया जा सकता है. इस परिदृश्य में, qPCR quasispecies डीएनए विश्लेषण का उपयोग करने के लिए एक पूरक, सीमित मन्दन पीसीआर (LD-पीसीआर) के रूप में वायरल जीनोम असर 11,12 कोशिकाओं की आवृत्ति का मूल्यांकन करने के लिए एक वैकल्पिक लाभ प्रदान करता है. संक्षेप में, γ-HVS संक्रमित लिम्फोसाइटों serially पतला कर रहे हैं. इन कोशिकाओं से डीएनए निकाला एक संवेदनशील नेस्टेड पीसीआर परख है, जो एकल कॉपी व्यक्तिगत नमूनों में वायरल डीएनए की उपस्थिति का पता लगाने कर सकते हैं के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है. कमजोर पड़ने और qPCR सीमित की एक संयुक्त विश्लेषण गुप्त रूप से संक्रमित कोशिकाओं के दोनों आवृत्ति और वें खोलेगाई वायरल अव्यक्त डीएनए लोड.
विशेष रूप से, आईसी परख वायरल अव्यक्त लोड, तथ्य यह है कि यह वायरल अव्यक्त भार में कटौती के बीच अव्यक्त वायरस के ही एक विफलता के लिए पुन: सक्रिय बनाम भेद नहीं करता की वजह से मापने के लिए एक स्टैंड - अलोन विधि के रूप में इस्तेमाल किया नहीं जा सकता है. वायरल विलंबता के एक उपाय के रूप में आगे, qPCR मात्रात्मक संक्रमित ऊतकों में वायरल जीनोम प्रतियां का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. कम वायरल जीनोम भार और संक्रामक केंद्र अनुमापांक के बीच एक संबंध वायरस का एक विलंबता दोष सुझाव देना चाहूँगा. इसके विपरीत, उच्च वायरल जीनोम भार और कम अव्यक्त वायरल अनुमापांक के बीच असमानता तर्क होता है कि हालांकि वायरस एक अव्यक्त वायरल डीएनए पूल को बनाए रखने में सक्षम है, यह करने के लिए कुशलतापूर्वक विलंबता से पुन: सक्रिय करने में असमर्थ है.
अंत में, इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधियों की तुलना में अन्य herpesviruses γHV68 भी सामान्य प्रयोज्यता है, जिसके लिए लक्षित सेल प्रकार और वायरल जीनोमिक दृश्यों उपलब्ध हैं और वें की अनुमतिई vivo में विशिष्ट जीवन चक्र का स्पष्ट मूल्यांकन. यह भी माउस संक्रमण के संदर्भ में विशिष्ट विषैलापन कारकों की जैविक भूमिका का पता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, γHV68 जंगली प्रकार के साथ विभिन्न वायरल बीसीएल-2 γHV68 उत्परिवर्ती की नकल की तुलना करके, हमारे हाल ही में 8 काम हमें निर्धारित करने के लिए vBcl - 2 (जैसे apoptosis, भोजी, या दोनों) के समारोह में जो करने के लिए योगदान देता है की अनुमति देता है vivo चूहों में तीव्र और जीर्ण संक्रमण में इस वायरस के व्यवहार. इस प्रकार, वे भी महत्वपूर्ण उपकरण प्रतिनिधित्व करने के लिए संक्रमण के दौरान वायरस मेजबान बातचीत टुकड़े करना.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए रेन (कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, लॉस एंजिल्स) सूर्य और Seungmin ह्वांग (वाशिंगटन विश्वविद्यालय) से तकनीकी सलाह और समर्थन को स्वीकार करना होगा. यह काम बैक्सटर फाउंडेशन, राष्ट्रीय संस्थानों स्वास्थ्य अनुदान के (CA140964 R01 और R21 सी. लिआंग AI083841) द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
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