マウスにおけるγHV68感染の測定

Summary

γ-ヘルペスウイルス（γ- HVS）生涯その宿主に持続性を確立する。 γ- HV68とマウスの感染症は、遺伝的に扱いやすいが用意されています

Abstract

γ-ヘルペスウイルスは、（γ- HVS）リンパ系細胞¹の潜伏感染を確立する能力が特徴です。このようなEBVとKSHVとしてヒトγ-ハイブリッド自動車、の狭い宿主範囲は、深刻な詳細な病原性の研究を妨げている。マウスγ-ヘルペスウイルス68（γHV68）株のヒトγ-ハイブリッド自動車との広範な遺伝学的および生物学的な類似点とネズミ科齧歯類²の自然病原体です。このように、ウイルス感染のさまざまな段階でマウスのγHV68感染近交系の評価は、γ-ハイブリッド自動車の感染時にウイルスのライフサイクルと病因を理解するための重要なモデルが用意されています。

鼻腔内接種すると、肺の急性ウイルス血症のγHV68感染の結果は、後に脾細胞とホスト^3,4のライフサイクル全体で再活性化することができる他の細胞、の潜伏感染に解決されている。このプロトコルでは、私たちはロバにプラークアッセイを使用する方法について説明します後鼻腔内感染（解像度）の - 早期（7日間5）でのベロ細胞単層上肺ホモジネート中の感染性ウイルスの力価。急性感染症は、主に2クリアされている間 - 3週間の感染後、γHV68の潜伏感染を14解像度の周りに確立され、後にマウスの脾臓の上に維持される。潜伏感染は通常、ウイルスが休眠状態にとどまり、その遺伝子発現のほとんどを遮断することにより、感染組織中の細胞の非常に小さな人口に影響を与えます。潜伏感染した脾細胞は、自発的にウイルスの潜在的な負荷を決定するために感染症センター（IC）アッセイによりrecapitulatedできる組織培養、にexplantingによってウイルスを再アクティブ化します。さらに急性および/または潜在的に感染した組織を、定量的リアルタイムPCRでウイルスゲノムのコピーの量を推定する（定量PCR）、その最大の感度と精度のために使用されます。定量PCRおよびプラークアッセイ、および/またはICアッセイの結果を組み合わせた解析は、ウイルス性の時空間プロファイルを明らかにする生体内での複製と感染。

Protocol

以下のプロトコルは、理論的にγHV68と同様のライフスタイルを共有する他のウイルスによる感染を評価するために使用できるマウスのγHV68の溶菌と潜伏感染サイクル、のウイルスの力価およびウイルスゲノムの負荷の調査を説明します。

1。 γHV68の増幅

1. 37℃の水浴中でγHV68の凍結バイアルを解凍。
2. 37℃で10cmの皿、培養感染細胞でNIH3T12または3T3細胞培養（〜50％コンフルエント）にウイルスinoculumsを追加° Cで5％CO _2。
3. 細胞変性効果（CPE）のための顕微鏡による文化を調べ、細胞の80％以上は、〜5日間感染後にCPE 4を示す時にメディアを収集する。ウイルスの収量を最大にするために、感染した細胞培養はすべての細胞関連γHV68を解放するために二回凍結と融解することができます。
4. 細胞破片を除去するために室温（RT）で5分間1000rpmで収集されたメディアを遠心。
5. 慎重に下部の細胞の破片に触れることなく、新しいチューブ（高速遠心分離管）に上清を移す。
6. 4℃、12,000 rpmで高速遠心機は、（ソーバルSA - 600用）℃で少なくとも1.5時間のウイルス粒子を集中する。
7. 10γ漂白剤の溶液中に上清を捨て、慎重に1ミリリットルの無血清DMEMでペレットを（ウイルスおよび残存細胞の破片）に再懸濁する。 1.5 mlマイクロ遠心チューブに再懸濁したペレットを移し、ボルテックスでよく混和する。
8. 残存細胞破片を除去し、新しいチューブに上清（ウイルスストックを）転送する最高速度で2分間遠心。これは感染の最終的なウイルスストックです。ウイルスストックの力価はプラークアッセイ（下記参照）によって決定されます。

2。 γHV68とマウスの鼻腔内感染

1. 1,000以上のパーティションを持つ年齢の〜6週間で、マウスに感染〜γHV68あたりのマウスの5,000プラーク形成単位（P​​FU）を。
2. 麻酔をかける腹腔内にケタミン/キシラジン（80 mg / mlのケタミンおよび12 ​​mg / mlのキシラジンの混合物の60μlの/マウス）の注入によるマウス。マウスのつま先をつまんで麻酔を監視します。これは通常、5〜10分かかります。マウスが完全に麻酔されていない場合、それらはウイルスをくしゃみをされます。
3. マウスが完全に麻酔のときは、ゆっくりと、しかし着実に、マウスのドロップでドロップするγHV68（各鼻孔に15μl）を含むPBS中〜30μlを接種するピペットを使用してください。マウスは確かに気泡を形成しようとせずに滴を吸入されていることを確認します。
4. マウスは10〜15分で回復してケージに戻す前に、マウス（例えば意識、呼吸、等）の福祉を監視することができます。動物は食物、水、および寝具の条件の病気と妥当性のために毎日チェックされます。病気、痛みや苦痛の臨床症状が進行した場合は、病因を決定するためにルーチンの診断が実施される。自分の体重の20％以上を失う動物は、最大体重減少のために記録されます。と安楽死。安楽死を実行するための最終決定は、臨床獣医師の裁量であり、主任研究者との協議を行っています。

3。急性感染肺におけるウイルス力価を決定するためにプラークアッセイ

1. ウイルスの感染力価はVero細胞の単層上でプラークの形成によって決定されます。
2. Vero細胞/ウェル、12ウェルプレートに2.5x10 ⁴細胞のプラークアッセイ前日に播種されています。細胞が均等に分配されるべきですし、細胞密度が30に到達する必要があります - 40％のプラークアッセイの日に。
3. 0.5％（w / v）のメチルセルロース（MC）オーバーレイの培地（表1）を準備します。
4. 肺に急性期のウイルス力価を決定するために鼻腔感染後5-7日間γHV68感染マウスを生け贄に捧げる。安楽死のためにケタミン塩酸（80-100 mg / kgのSC、IM、IP）は、ペントバルビタールナトリウム（30〜50 mg / kgのIP）の静脈内過剰投与に続いてIM投与されます。このメソッドは、tで承認されています彼のアメリカ獣医師会。
5. 肺を回収し、血液細胞を除去する1 × PBSで2回すすいでください。 1mlの氷冷完全DMEM培地で肺の片側を収集し、氷上に置きます。迅速に定量PCR（下記参照）によって肺内にウイルスDNAの負荷を調べるために-80 ° Cで肺や店舗の反対側を凍結する。
6. 1秒、凍結と融解3回最高速度で肺組織を均質化する組織ホモジナイザーを使用してください。サンプルを変更する際に、各ステップで70％エタノールでホモジナイザーを洗ってください。
7. で10分間4℃で3,000 rpmでホモジナイズした組織を遠心上清を収集し、プラークアッセイのために新しいチューブに移す。
8. 渦によってプレーンDMEM 1.5 mlマイクロ遠心管に肺ホモジネート試料の希釈系列を（通常は10℃から10 ^-8まで）の準備。プレフィル540μLDMEMを持つチューブの適切な数と最初のチューブに60μlのホモジネートを希釈する。私は、最初のチューブから60μlをない次のもの、というように。
9. 12ウェルプレートの準備ベロ単層から培地を吸引除去し、逆の順序（10 ^-8〜10℃から）で感染性ウイルスを含む/ウェル希釈ホモジネート液200μlをロードする。各滴定（重複の）のために2つのウェルを使用してください。
10. 37℃でウイルスinoculums 1時間でVero細胞をインキュベート℃に優しくスワールプレートを15分ごとに均等に単分子層を介してウイルスを配布する。
11. inoculumsを削除し、/ウェルオーバーレイ培地2ml（表1）に交換してください。 37一週間のためのプレートをインキュベート℃に
12. オーバーレイのメディアを削除する（完全である必要はありません）と修正/プラークアッセイの染色培地（表1）で置き換えると、室温で少なくとも1時間インキュベートする。
13. プレートを乾燥している場合、各希釈でよく分離したプラークの数を数えます。エラーを最小限に抑えるために、10から100プラークの間に含まれている唯一の井戸がカウントされます。
14. folloを使用してウイルス力価を計算する翼式：タイター（pfu / ml）を= [（プラーク/ウェルの数）/（inoculums /ウェルの量）] ×希釈率。

4。潜在的に感染した脾細胞でのウイルス負荷を測定するために感染症センターのアッセイ

1. ウイルス潜伏の負荷は、Vero細胞の単層上で感染症センター（IC）アッセイによって決定されます。 ICアッセイ前日に、6ウェルプレート（1シードのベロ細胞- 。我々は通常、脾臓のサンプルあたり11ウェルを使用する2.5 × 10 ⁵細胞/ウェル、10ウェルを希釈脾細胞の懸濁液およびテストのためにもいずれかに使用されます。凍結融解後のウイルスの自発的な再活性化。
2. （ - 感染後14日間12）の待ち時間が確立された後に感染したマウスを生け贄に捧げる。マウスの脾臓とプール、それらDMEMを冷やして1mlにして回収する。
3. マウスの脾臓の機械的解離。 10cmのプレートに、新たに分離したマウスの脾臓を移し、2％FBS含有DMEMなどの目的の培地10mlを加える。ウェットtwoすりガラスエンドガラスmicrosc氷冷培地とオペコードのスライド。あるスライドとニック他のスライドの曇らされた最後のエッジとカプセルのフロスト側の脾臓を置きます。すべての赤い塊が粉砕されるまで、機械的に（存在する場合も、脂肪粒子を除去）は、2つのスライドの間に脾臓を解離する。
4. 両方のスライド上で残りの細胞を回収するDMEMでスライドを洗浄します。
5. 50 mlコニカルスクリューキャップチューブにセルストレーナー（40μmのナイロンメッシュ）を通して穏やかに全体組織懸濁液を移す。フィルタリングながら10 mlのPBSと転送と脾臓のホモジネートを含む10 cmの皿を洗ってください。
6. 375 × gで、単一の細胞懸濁液を10分を遠心し、上清を捨てる。既存の細胞塊を分割するために細胞ペレットをはじく。赤血球を溶解するために5ミリリットルACKバッファー（表1）を追加します。 5分間インキュベートし、375 xgで再び遠心
7. 上清を捨て、PBSで穏やかにまだ徹底的に再サスペンドペレット、、、2％FBSを持つ。 4℃の細胞℃を保つにピペットを使用して、もしあれば、破片を取り除く。自動セルカウンター（Bio - Rad）を用いて生細胞を数える。
8. 4分間375 × gでPBS -再懸濁された脾細胞をスピンダウン。上清を捨て、4 mlの完全DMEM（2 × 1 mlを、元の懸濁液のIC分析に使用される細胞を再懸濁、0.6ミリリットルのICアッセイでシリアル5倍希釈で使用される、ウイルスDNAの調製と定量PCRは0.4 mlのと1 mlの懸濁液）を3回の凍結融解サイクル後の潜伏ウイルスの自然再活性化を評価するために使用されます。
9. 重複の脾細胞懸濁液のシリアルを5倍希釈（すなわち1 / 5、1 / 25、1 / 125、1 / 250）を準備する。 2.4ミリリットルDMEMとプレフィル15 mlコニカルチューブを、最初のチューブに600μlの脾細胞懸濁液を希釈し、よく混ぜる。次管に前のチューブから600μlのを転送する、などはボルテックスしないでください！
10. Vero細胞の準備を6ウェル単層から培地を吸引除去する。各希釈duplとVero細胞上に連続的に希釈した脾細胞の種子1ミリリットルicated（10ウェルを0、1 / 5、1 / 25、1 / 125、1 / 250希釈のために使用されます）。
11. 37プレートを℃、5％CO _2を 8から12時間インキュベートする。 24時間を超えないようにしてください。シードされた脾細胞懸濁液を吸引除去し、各ウェルに4ミリリットルオーバーレイメディア（表1）をロードする。さらに6日間インキュベートする。
12. プラークアッセイに示すように、クリスタルバイオレット0.2％（w / v）のとプレートを染色することによって脾臓感染センターのレベルを決定する。

5。ウイルスゲノムの定量化

1. この実験ではそのような肺と脾臓のサンプルとしてγHV68感染組織からの全ゲノムDNAを抽出します。製造業者のプロトコルに従ってDNeasy血液および組織キット（Qiagen）を、使用してください。
2. 定量PCRアッセイに使用されているDNAの同じ量を確保するために各サンプルのDNA濃度を決定する。ウイルス特異的プライマーを設計する（〜200 bpのアンプリコンは、定量PCRアッセイのために好まれる）。 5＆PR：私達は（フォワードプライマーγHV68ORF56 -特異的プライマーを用いIME; - GTAACTCGAGACTGAAACCTCGCAGAGGTCC - 3'、リバースプライマー：5' - CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG - 3'）このアッセイおよびβ-アクチンのプライマー用（フォワードプライマー：5' - cacccacactgtggcccatcat - 3'リバースプライマー：5' - gtgaggatcttcatgaggtagtc - 3'）のような定量PCR反応の制御。
3. （ - 500 ngの良い100）と2 × SYBRマスターミックス（Bio - Rad社iQはSYBRグリーンスーパーミックス）と適切なプライマーDNAサンプルを混ぜる。感染組織内のウイルス量を定量化するためのBio - Rad社製リアルタイムPCRシステムを使用してください。以下の条件でPCRを行います：15分、95の45サイクル95℃℃で30分間、60℃で30分間、および72℃のウイルスとの両方のために、曲線解析を溶融し、次いで30分、用アクチンのアンプリコン。
4. ウイルスゲノムの定量化のための標準曲線を作成するには、連続して非感染細胞から単離したゲノムDNAをγHV68バクミドDNAの既知量を希釈する。感染から取り出されたDNAと並​​行して定量PCRを実行するウイルス特異的プライマーの同じセットを使用して、TEDの組織。
5. アクチンの正規化後のゲノムDNAの単位当たりのウイルスDNAのコピー数（例えば100 ngのまたは500ngの）などの組織におけるウイルスゲノムの負荷を提示。

6。代表的な結果：

図1は、in vivoでのマウスのγHV68感染の測定のための実験の全体的なスキームを示しています。としてプラークアッセイによって決定さγHV68、の急性感染時の肺におけるウイルス力価の代表的な結果は、図2Aで示されていた。含むγHV68の変異株、非機能的なウイルス性Bcl - 2の7日間BALB / cマウス（6 - グループあたり7匹）の鼻腔内感染後の肺の中に野生型γHV68に匹敵するレベルでの複製（VBCL - 2）。ウイルスの肺の力価には統計的に有意な差は両群間で検出されなかった。このデータは、VBCL - 2でγHV68の急性感染症のための重要な要素ではないことを示してマウス。しかし、28日間の感染後で、脾臓のVBCL - 2変異ウイルスの力価は6ドロップ - 10に - 倍などの感染中心アッセイ（図2B）によって測定されたWTに比べて、示唆しているVBCL - 2変異体γHV68ウイルス感染後の脾臓の待ち時間の維持に障害があります。削減感染中心の力価との合意では、VBCL - 2変異ウイルスのウイルスゲノムの負荷が著しく、図2Cに示すように、繰り返し実験で28日目WTウイルス、のそれに比べて減少した。感染症の潜在的な段階で潜像HV68vBcl - 2変異ウイルスの再活性化のex vivoでのウイルスゲノムの負荷と周波数の間に密接な相関関係は、この変異ウイルスの感染の待ち時間の欠陥を強調しています。

図1。プラーク形成、感染症センター、および定量PCRアッセイによるマウスのγHV68感染の測定のための模式図S.

図2 in vivoでの WTと変異γHV68ウイルスの溶菌と潜伏感染。 7解像度（日、感染後）で、BALB / cマウスの肺でWTと変異VBCL - 2γHV68ウイルスの急性複製は、（）プラークアッセイによって決定した。 （BおよびC）脾臓の感染症センター（B）及び感染マウスの脾臓におけるウイルスゲノムの負荷は、（C）はそれぞれ、感染症センターのアッセイおよび定量PCRは28 dpiで測定した。赤い線、指示値の平均。 NS、有意ではない。

Discussion

γHV68は広くヒトγ-ハイブリッド自動車^2,4,5の病因を理解するモデルとして使用されています。このプロトコルでは、我々はマウスの鼻腔内接種後γHV68の急性および潜伏感染を評価するために、感染性ウイルスの力価のためのプラークアッセイ、ウイルスの潜在的な負荷のためのICアッセイ、およびウイルスゲノムの負荷の定量PCRを含む3つの日常的に使用される方法を、説明した。

プラークアッセイは、感染細胞または組織中のウイルス力価を決定するために広く使用されますが、最適な条件で使用されているウイルスによって異なりますされています。細胞単層上プラーク（可算病変）を作るためには、さまざまなウイルスの容量が異なるので、これは主です。感染後7日間 - γHV68は、通常、サルVero細胞またはそのようなNIH3T12や3T3などの培養マウス細胞の単層、6日に明らかなプラークを生成します。特に、細胞単層の年齢のようなウイルス感染の減少に対する感度やはこのように過密になり、我々通常、我々の経験で、γHV68最良の結果を示して、プラークアッセイ、のためのVero細胞のコンフルエント50％未満を使用してください。加えて、均等に分散したての単分子膜は、非常にプラークカウントの精度をお勧めします。ウイルスサンプルの希釈系列を作成しているときに、注意が気泡を避けるようにしなければならないとピペットチップは、それぞれの滴定の間で変更する必要があります。高力価ウイルスのサンプルについては、10倍連続希釈を推奨している、そうでない場合は、2 - 5倍連続希釈するために使用されています。

感染性ウイルスが直接プラーク形成能で検定が可能な急性感染症とは異なり、潜伏感染組織/試料のγ-ハイブリッド自動車は通常ではなく、ウイルスのDNAが少数の遺伝子を持つ円形のエピソームとして維持され、検出可能な予備成形された感染性ウイルスが含まれていません^6,7を表明した。このケースでは、ウイルス潜伏性の負荷がvitrでからのウイルスのex vivoでの再活性化の頻度によって決定することができます。許容インジケーター細胞培養上潜伏感染細胞（例えば、Vero細胞^）8 O植。この目的のために、感染組織の単細胞懸濁液を調製し、カウントして、プラークアッセイ培地でオーバーレイされる感受性細胞の単層上にめっきされる。このプロトコルでは、我々は、脾臓や脾細胞⁴のあたりの人口あたりの再アクティブ化する能力を持っている潜在的なウイルスの量を測定するためにICアッセイのために脾臓の単細胞懸濁液を準備する方法について説明してきました。脾細胞の唯一の小さな集団が潜在的に感染しているので、我々は通常、感染力価試験のために脾臓細胞懸濁液のシリアル低倍希釈液を調製する。細心の注意は、過酷なピペッティングまたはボルテックスセルを避けるために、手順全体で注意する必要があります。脾臓からの外植B細胞は、一般的にex vivoでの再活性化の効率に影響を与える可能性のある貧しい生存率^9を 、示すことに注意することは重要です。遅れさせるの生存率を改善する任意の遺伝子tly感染した細胞は、間接的にウイルスのex vivoでの再活性化の効率性を促進することができます。

プラーク形成とICアッセイと比較して、定量PCRは正確にリンパ球に感染したマウスにおけるγ-ハイブリッド自動車_10を定量化する効果的な手段を提供します。それはベロまたは他の標識細胞への最小限の細胞毒性に起因する不良プラーク形成能を持つウイルスに特に有用であり、そして両方の急性および慢性感染サンプルに適用することができます。標準曲線は正確にウイルスゲノムを定量するための必要かつ重要です。我々はγHV68ゲノム^8を含むバクミドクローンを利用して、ORF56遺伝子の増幅に基づくγHV68標準曲線を開発しました。定量PCRの反応ははるかにプラークアッセイの限界を超えて、定量PCRの反応ごとにウイルスDNAのさらにいくつかのコピーを検出することができるという非常に敏感です。予防策は、しかしuninfecteを含めながら、サンプル間のクロスコンタミネーションを避けるために、場所に置く必要があります各反応に必要な陰性対照としてDのサンプル。細胞DNAの膨大な量のウイルス特異的増幅の信号に影響を与える可能性があるため、定量PCR反応の特異性は、特に感染した組織サンプルのための深刻な問題になる可能性があります。これは、しかし、非特異的な増幅産物のために融解曲線分析によって検出することができます。自然に感染した脾細胞の集団で、γHV68有利子細胞の頻度は非常に低くすることができます。このシナリオでは、準種のDNAを用いたqPCR解析を補完するものとして、制限、希釈PCR（LD - PCR）は、ウイルスゲノム有利子細胞^11,12の頻度を評価するために代替の利点を提供します。簡単に言うと、γ- HVS -感染リンパ球を連続希釈されています。これらの細胞から抽出したDNAは、個々のサンプル中からシングルコピーウイルスDNAの存在を検出することができる敏感なネステッドPCRアッセイに使用されることです。限界希釈し、定量PCRの複合解析では、潜伏感染した細胞の頻度と目の両方を明らかにする電子ウイルスの潜伏DNAの負荷。

特に、ICのアッセイは、それが再びアクティブに潜伏ウイルス自体の故障に対し、ウイルスの潜在的な負荷の削減を区別していないという事実のためにウイルスの潜在的な負荷を測定するためのスタンドアローン方式、として使用することはできません。ウイルス潜伏性のさらなる対策として、定量PCRは、定量的に感染した組織の中にウイルスゲノムのコピーを評価するために使用されます。削減ウイルスゲノムの負荷と感染中心価間の相関は、ウイルスの潜伏の欠陥を示唆する。対照的に、高いウイルスゲノムの負荷と低い潜伏ウイルスの力価との間の格差は、ウイルスが潜伏ウイルスDNAのプールを維持できるものの、それは効率的に待ち時間から再度アクティブにすることができないと主張するだろう。

結論では、このプロトコルで説明する方法もγHV68以外のヘルペスウイルスに一般的な適用可能性を持って、そのために、標的細胞の種類とウイルスのゲノム配列が利用可能で、目を許可する生体内での明確なライフサイクルの電子明確な評価。また、マウスの感染症のコンテキストで特定の病原因子の生物学的役割に対処するために使用することができます。例えば、異なるウイルスBcl - 2の複製を比較することにより、野生型γHV68のそれと変異γHV68、私たちの最近の研究^8は私達がのに寄与するVBCL - 2の機能（例えばアポトーシス、オートファジー、または両方）を決定することができますマウスの急性および慢性の感染症では、このウイルスのin vivoでの挙動。従って、彼らはまた、感染時にウイルス - 宿主相互作用を分析する重要なツールを表しています。