Måling av γHV68 Infeksjon i Mus

Summary

γ-herpesviruses (γ-HVS) etablere livslange utholdenhet i verten sin. Infeksjon av mus med γ-HV68 gir et genetisk medgjørlig

Abstract

γ-herpesviruses (γ-HVS) er kjent for sin evne til å etablere latente infeksjoner av lymfoide celler ^1. Den smale vert spekter av menneskelige γ-HVS, som EBV og KSHV har sterkt hindret detaljerte sykdomsfremkallende studier. Murint γ-herpesvirus 68 (γHV68) aksjer omfattende genetiske og biologiske likheter med menneskelige γ-HVS og er en naturlig patogen av murid gnagere ^2. Som sådan, evaluering av γHV68 infeksjon av mus innavlede stammer på ulike stadier av viral infeksjon gir en viktig modell for å forstå viral livssyklus og patogenese ved γ-HVS infeksjon.

Ved intranasal inokulasjon, γHV68 infeksjon resulterer i akutt viremia i lungene som er senere løst inn i et latent infeksjon av splenocytes og andre celler, noe som kan reaktiveres gjennom hele livet av verten ^3,4. I denne protokollen, vil vi beskrive hvordan du bruker plakett analysen å vurdereer smittsomt virus titer i lungene homogenates på Vero celle monolayers på et tidlig stadium (5-7 dager) etter intranasal infeksjon (dpi). Mens akutt infeksjon er i stor grad ryddet 2-3 uker postinfection, en latent infeksjon av γHV68 er etablert rundt 14 dpi og vedlikeholdes senere i milten av musene. Latent infeksjon vanligvis påvirker en svært liten populasjon av celler i infisert vev, der viruset forblir sovende og slår av de fleste av sine genuttrykk. Latent infisert splenocytes spontant reaktivere virus ved eksplantasjon i vev kultur, som kan rekapitulert av en smittsom sentrum (IC) assay å bestemme viral latent belastning. For ytterligere å anslå mengden av virale genomet eksemplarer i akutt og / eller latent infisert vev, kvantitativ real-time PCR (qPCR) brukes for maksimal følsomhet og nøyaktighet. Den kombinerte analyser av resultatene av qPCR og plakk analysen, og / eller IC analysen vil avsløre i tid og rom profiler av viralreplikering og smittsomhet in vivo.

Protocol

Følgende protokoll vil beskrive studiet av virus titer og virale genomet belastninger i lytisk og latent infeksjon syklus av γHV68 i mus, som kan teoretisk brukes til å evaluere smitte av andre virus dele lignende livsstil som for γHV68.

1. Forsterkning av γHV68

1. Tine en frossen hetteglass γHV68 i 37 ° C vannbad.
2. Legg viral inoculums til NIH3T12 eller 3T3 cellekultur (~ 50% confluency) i 10 cm retter og kultur de infiserte cellene ved 37 ° C i 5% CO _2.
3. Undersøke kulturen ved mikroskopi for cytopathic effekt (CPE) og samle media i en tid da mer enn 80% av cellene viser CPE 4 ~ 5 dager etter smitte. For å maksimere utbyttet av virus, kan den infiserte cellen kulturen være frosset-og-tint to ganger for å løslate alle celle-assosiert γHV68.
4. Sentrifuger samlet media ved 1000 rpm i 5 min ved romtemperatur (RT) for å fjerne celleavfall.
5. Nøye overføre supernatants til nye rør (high-speed sentrifugerør) uten å berøre celleavfall nederst.
6. High-speed sentrifuger ved 12 000 rpm (for Sorvall SA-600) ved 4 ° C i minst 1,5 timer å konsentrere viruspartikler.
7. Kast supernatants inn 10γ blekemiddel løsning og nøye re-suspendere pellet (virus og residual celleavfall) med 1 ml serum-free DMEM. Overfør re-suspendert pellet inn i en 1,5 ml mikro-sentrifugerør og bland godt av virvling.
8. Sentrifuger i 2 min ved maksimal hastighet for å fjerne rester celleavfall og overfør supernatanten (virus lager) til en ny tube. Dette er det siste viral lager for infeksjon. Den titer av viruset lager bestemmes av plakk analysen (se nedenfor).

2. Intranasal Infeksjon av mus med γHV68

1. Infisere mus på ~ 6 ukers alder med 1000 ~ 5000 plakk-forming units (PFU) av γHV68 per mus.
2. Anesthetizemus ved injeksjon av ketamin / xylazin (60 mL / mus av en blanding av 80 mg / ml ketamin og 12 mg / ml xylazin) i bukhulen. Monitor anestesi ved å klemme musene tå. Det tar vanligvis ~ 5-10 min. Hvis mus er ikke fullt bedøvet, vil de nyser viruset.
3. Når musen er fullstendig bedøvet, bruk en pipette til å vaksinere ~ 30 mL PBS inneholder γHV68 (15 mL ved hvert nesebor) til mus drop-by-slipp sakte men sikkert. Pass på at musen er faktisk inhaling dråpene uten å prøve å danne bobler.
4. La musen til å gjenopprette for 10-15 min og overvåke velferd mus (f.eks bevissthet, pust, etc) før du returnerer dem til buret. Dyr blir sjekket daglig for sykdom og tilstrekkelighet av mat, vann og sengetøy forhold. Hvis kliniske tegn på sykdom, smerte eller ubehag utvikler seg, vil rutinediagnostikk å bestemme etiologi bli gjennomført. Dyr som mister mer enn 20% av kroppsvekten din blir bevart for maksimal vekttapog avlives. Den endelige beslutningen om å utføre eutanasi på skjønn av den kliniske veterinær og er laget etter samråd med rektor etterforsker.

3. Plakk Assay til Bestem Virus titer i akutt infiserte Lunger

1. Virus smittsomhet titere bestemmes av plakk dannelse på monolayers av Vero celler.
2. Vero cellene er sådd på 2.5x10 ⁴ celler / brønn i 12 vel-plater dagen før plakett analysen. Cellene skal være jevnt fordelt og cellen tetthet bør nå 30 - 40% på dagen av plakk analysen.
3. Forbered 0,5% (w / v) methylcellulose (MC) overlegg medium (Tabell 1).
4. Offer γHV68-infiserte mus 5-7 dager etter intranasal smitte for å fastslå akutt fase virus titere i lungene. For euthanization Ketamin HCl (80-100 mg / kg SC, IM, IP) vil bli administrert IM etterfulgt av intravenøs overdose av Na pentobarbital (30-50 mg / kg IP). Denne metoden er godkjent av than amerikanske Veterinary Medical Association.
5. Høste lungene og skyll to ganger med 1 x PBS for å fjerne blod celler. Samle én side av lungene i 1 ml iskaldt komplett DMEM medium og holde på is. Raskt fryse den andre siden av lungene og oppbevar ved -80 ° C for å undersøke viral DNA belastninger i lungene ved qPCR (se nedenfor).
6. Bruk en vev homogenizer til å homogenisere lunge vev ved maksimal hastighet for 1 sek, fryse-og tine tre ganger. Vask homogenizer med 70% etanol på hvert trinn når du skifter prøven.
7. Sentrifuger homogenisert vev ved 3000 rpm i 10 min ved 4 ° C. Samle supernatanten og overføring til nye rør for plakk analysen.
8. Forbered seriefortynning (vanligvis fra 10 ° til 10 ^-8) av lunge homogenate prøver i 1,5 ml mikro-sentrifugerør med vanlig DMEM av Vortex. Forhåndsutfyll riktig antall rør med 540 mL DMEM og fortynne 60 mL homogenate inn i den første tube. Overfør 60 mL fra første røret iikke den neste, og så videre.
9. Aspirer medier fra forberedt Vero monolayers i 12-brønn plater og last 200 mL / brønn serielt utvannet homogenate inneholder smittsomme virus i en omvendt rekkefølge (fra 10 ^-8 til 10 °). Bruk to brønner for hver titrering (i duplikat).
10. Inkuber Vero celler med viruset inoculums 1 time ved 37 ° C. Forsiktig virvel platene hvert 15. minutt til jevnt distribuere viruset over monolayer.
11. Fjern inoculums og erstatte den med 2 ml / brønn på overlegget medium (Tabell 1). Inkuber platene for en uke ved 37 ° C.
12. Fjern overlegg medium (trenger ikke å være komplett) og erstatte med fix / flekken medium av plakk analysen (Tabell 1) og inkuber i minst 1 time ved RT.
13. Når platene er tørket, telle antallet godt isolert plaques på hver fortynning. For å minimere feil, er bare brønnene inneholder mellom 10 og 100 plaketter telles.
14. Beregn virus titer med Follovinge formel: titer (PFU / ml) = [(antall plaques / brønn) / (volum av inoculums / brønn)] x fortynningsfaktoren.

Fire. Smittsomme Senter Assay til Bestem Virus Load i latent infisert Splenocytes

1. Viral latente last bestemmes av smittsomme sentrum (IC) assay på monolayer av Vero celler. Dagen før IC analysen, frø Vero celler i 6-brønn plater (1 -. 2,5 x 10 ⁵ celler / brønn Vi bruker vanligvis 11 brønner per milt prøve, vil 10 brønner som skal brukes for serielt utvannet splenocytes suspensjon og en brønn for testing spontan reaktivering av viruset etter fryse-tine sykluser.
2. Offer den infiserte mus etter latency er etablert (12 - 14 dager etter smitte). Høste musen milten og pool dem i 1 ml avkjølt DMEM.
3. Mekanisk dissosiasjon av mus milt. Overfør fersk isolerte musen spleens inn en 10 cm plate og tilsett 10 ml av ønsket medium som DMEM med 2% FBS. Wet to frostet-end glass microscope lysbilder med iskald medium. Plasser milt på frostet side av ett lysbilde og Nick kapselen med kanten av frostet slutten av den andre lysbildet. Mekanisk distansere milten mellom to lysbilder til alle røde klumper er knust (også fjerne fett partikler hvis den finnes).
4. Skyll lysbilder med DMEM å utvinne gjenværende cellene på begge lysbilder.
5. Overfør hele vevet suspensjonen forsiktig gjennom en celle sil (40 mikrometer nylon mesh) til en 50 ml konisk skrue-cap tube. Vask 10 cm tallerken inneholder milt homogenates med 10 ml PBS og overføre mens filtrering.
6. Sentrifuger enkelt celle suspensjoner 10 min ved 375 xg og kast supernatanten. Flick cellen pellets for å bryte opp eksisterende celle klumper. Tilsett 5 ml ACK buffer (Tabell 1) for å lyse de røde blodcellene. Inkuber 5 min og sentrifuger igjen på 375 x g.
7. Kast supernatanten og re-suspendere pellets, grundig, men forsiktig, i PBS med 2% FBS. Hold celler ved 4 ° C. Bruk en pipette tilfjerne rusk, hvis noen. Count levedyktige celler ved hjelp av en automatisk celleteller (Bio-Rad).
8. Spin ned PBS-resuspendert splenocytes ved 375 xg for 4 min. Kast supernatant og resuspender cellene i 4 ml komplett DMEM (2 x 1 ml vil bli brukt for IC analysen av den opprinnelige suspensjon, 0,6 ml benyttes for seriell fem ganger fortynning i IC assay, 0,4 ml for viral DNA forberedelse og qPCR, og 1 ml suspensjon vil bli brukt til å evaluere spontan reaktivering av latent virus etter tre fryse-tine sykluser)
9. Forbered seriell fem ganger fortynninger (dvs. 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250) av splenocytes suspensjon i duplikater. Forhåndsutfyll de 15 ml koniske rør med 2,4 ml DMEM og fortynn 600 mL splenocytes suspensjonen i det første røret og bland godt. Overfør 600 mL fra forrige tube inn i neste rør, etc. Ikke vortex!
10. Aspirer mediet fra forberedt 6-godt monolayer av Vero celler. Seed 1 ml av serielt-utvannet splenocytes på Vero celler med hver fortynning duplicated (10 brønner vil bli brukt for 0, 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250 fortynninger).
11. Inkuber skålene 8-12 timer ved 37 ° C og 5% CO _2. Ikke overstige 24 timer. Aspirer seeded splenocytes suspensjon og last 4 ml overlegg media (tabell 1) til hver brønn. Inkuber i ytterligere seks dager.
12. Bestem nivåene av milten smittsomme sentre ved farging platene med 0,2% (w / v) krystallfiolett som vist i plakk analysen.

5. Kvantifisering av Viral Genome

1. Pakk total genomisk DNA fra γHV68-infisert vev, som for eksempel lunge og milt prøver i dette eksperimentet. Bruk DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) etter produsentens protokollen.
2. Bestem DNA konsentrasjonen av hver prøve for å sikre at den samme mengden av DNA som brukes for qPCR analysen. Design av virus-spesifikke primere (~ 200 bp amplicon er å foretrekke for en qPCR assay). Vi brukte γHV68 ORF56-spesifikke primere (forward primer: 5 & PRIME; - GTAACTCGAGACTGAAACCTCGCAGAGGTCC - 3 '; reverse primer: 5'-CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG-3') for denne analysen og β-actin primere (forward primer: 5'-cacccacactgtggcccatcat-3 'reverse primer: 5'-gtgaggatcttcatgaggtagtc-3') som en kontroll for qPCR reaksjonen.
3. Bland DNA-prøve (100-500 ng er bra) og egnede primere med 2 x SYBR mester mix (Bio-Rad iQ SYBR Grønn Supermix). Bruk Bio-Rad Real-Time PCR System for å kvantifisere virusmengde i infisert vev. Utfør PCR på følgende betingelse: 95 ° C i 15 min og 45 sykluser på 95 ° C i 30 min, 60 ° C i 30 min, og 72 ° C i 30 min, etterfulgt av smelting kurve analyser, for både viral og aktin amplicons.
4. Å lage en standard kurve for kvantifisering av viral genomer, serielt fortynne kjente mengder av en γHV68 bacmid DNA med genomisk DNA isolert fra infiserte celler. Kjør qPCR parallelt med DNAS hentet fra smitteted vev med samme sett av virus-spesifikke primere.
5. Presenter den virale genomet belastning i vev som viral DNA kopi nummer per enhet (f.eks 100 ng og 500 ng) av genomisk DNA etter aktin normalisering.

Seks. Representant Resultater:

Figur 1 viser den generelle ordningen med forsøkene for måling av γHV68 infeksjon i mus in vivo. Representative resultater av virus titere i lungene ved akutt infeksjon av γHV68, som bestemmes av plakk analysen, ble vist i figur 2A. En mutant stamme av γHV68 inneholder ikke-funksjonelle viral BCL-2 (vBcl-2) replikeres på nivåer tilsvarende villtype γHV68 i lungene etter 7 dager intranasal smitte av BALB / c mus (6-7 mus pr gruppe). Ingen statistisk signifikante forskjeller i lungene titere av viruset ble oppdaget mellom to grupper. Disse dataene indikerer at vBcl-2 er ikke en avgjørende faktor for akutt infeksjon av γHV68 imus. Men ved 28 dager postinfection falt titer av vBcl-2 mutant virus i spleens 6 - til 10 - fold i forhold til WT, målt ved smittsomme sentrum analysen (figur 2B), som tyder på at vBcl-2 mutant γHV68 virus er defekt i vedlikehold av milten ventetid etter smitte. I avtalen med den reduserte smittsomme sentrum titere ble virusgenomet belastningen av vBcl-2 mutant virus sterkt redusert sammenlignet med WT virus på dag 28 i gjentatte eksperimenter, som vist i figur 2C. Den nære sammenhengen mellom viral genomet belastninger og hyppigheten av latente-HV68vBcl-2 mutant virus reaktivering ex vivo ved latent stadium av infeksjon fremhever en latency feil av denne muterte virus infeksjon.

Figur 1. Prinsippskisse for måling av γHV68 infeksjon hos mus ved hjelp av plakk dannelse, smittsomme sentrum, og qPCR assays.

Figur 2. Lytisk og latent infeksjon i WT og mutante γHV68 virus in vivo. Akutt replikering (A) på WT og mutante vBcl-2 γHV68 virus i lungene av BALB / c mus ved 7 dpi (dag etter infeksjon) ble fastsatt av plakk analysen. (B og C) milten smittsomme sentre (B) og viral genomet belastning (C) i spleens av infiserte mus ble målt ved 28 dpi ved smittsomme sentrum analysen og qPCR, henholdsvis. Røde linjer, gjennomsnitt av angitte verdiene. ns, ikke signifikant.

Discussion

γHV68 har vært mye brukt som modell for å forstå patogenesen av menneskelig γ-HVS ^2,4,5. I denne protokollen, beskrev vi tre rutinemessig brukes metoder, inkludert plakk analysen for smittsomme virus titer, IC analysen for viral latent belastning, og qPCR for viral genomet belastning, å vurdere den akutte og latent infeksjon av γHV68 etter intranasal inokulasjon i mus.

Plakk analysen har vært brukt mye til å bestemme virus titer i infiserte celler eller vev, men den optimale vilkår varierer for viruset som brukes. Dette er hovedsakelig fordi kapasiteten på ulike virus å produsere plaketter (tellbar lesjoner) på en celle monolayer er annerledes. γHV68 produserer normalt opplagt plaques på monolayer av ape Vero celler eller kulturperler musen celler som NIH3T12 eller 3T3, 6 - 7 dager etter smitte. Spesielt, cellen følsomhet for viral infeksjon avtar som monolayer aldre eller blir overfylte Dermed har vibruker vanligvis mindre enn 50% confluency av Vero celler for plakk assay, som i vår erfaring, viser de beste resultatene for γHV68. I tillegg er en jevnt fordelt og nylaget monolayer anbefales for nøyaktigheten av plakk telle. Samtidig som seriell fortynning av viruset prøvene, må forsiktighet utvises for å unngå bobler og pipettér tips bør endres mellom hver titrering. For høy-titered virus prøver, er 10-fold seriefortynning anbefales, ellers 2 - til 5-fold seriefortynning brukes.

I motsetning til akutt infeksjon der smittsomme virus kan være direkte analyseres av plakk-forming evne, latent-infisert vev / samples av γ-HVS vanligvis ikke inneholder påvisbare preformed smittsomt virus, i stedet er viral DNA opprettholdes som en sirkulær episome med få gener uttrykt ^6,7. I dette tilfellet kan viral latency lasten bli bestemt av hyppigheten av ex vivo reaktivering av virus fra i vitro explants av latent-infiserte celler på en ettergivende indikator cellekultur (f.eks Vero celler) ^8. For dette formål, er enkelt celle suspensjon av infisert vev forberedt, telte, og belagt på monolayers av mottakelige celler, som deretter kledde med plakk analysen medium. I denne protokollen, har vi beskrevet hvordan du skal forberede enkelt celle suspensjoner av milten for IC analysen for å måle mengden av latent virus som har evnen til å aktivere per milt eller per innbyggere splenocytes ^fire. Siden bare en liten bestand av splenocytes er latent infisert, pleier vi å forberede seriell lav-fold fortynninger av splenocytes suspensjon for smittsomme titer testing. Ekstrem forsiktighet må tas under hele prosedyren for å unngå harde pipettering eller virvling celler. Det er viktig å merke seg at eksplanterte B-celler fra milt generelt vise dårlig levedyktighet ^9, som kan påvirke effektiviteten av ex vivo reaktivering. Ethvert gen som øker overlevelsen av Latently infiserte celler kan indirekte lette effektiviteten av ex vivo reaktivering av viruset.

Sammenlignet med plakk-forming og IC-analysene gir qPCR et effektivt middel for å nøyaktig kvantifisere lymfatisk γ-HVS i infiserte mus _10. Det er spesielt nyttig for et virus med dårlig plakk-forming evne på grunn av sin minimale cytotoksisitet til Vero eller annen indikator celler, og kan brukes til både akutt og kronisk infisert prøver. En standard kurve er nødvendig og viktig for nøyaktig kvantifisering viral genomer. Vi utviklet γHV68 standard kurver basert på ORF56 genamplifisering, bruk en bacmid klone inneholder γHV68 genomet ^8. qPCR reaksjon er ekstremt følsom å kunne oppdage selv noen få eksemplarer av viral DNA per qPCR reaksjon, langt utover grensene for plakk analysen. Forholdsregler likevel må settes på plass for å unngå krysskontaminering mellom prøvene mens inkludert uninfected prøvene som er nødvendig negative kontroller for hver reaksjon. Spesifisiteten av qPCR reaksjon kan være et alvorlig problem spesielt for infisert vevsprøver, siden enorme mengden av cellulær DNA kan påvirke signalet av virus-spesifikke forsterkning. Dette kan imidlertid oppdages ved smelting kurve analyse for uspesifikke forsterket produkter. I naturlig smittet splenocyte populasjoner, kan hyppigheten av γHV68-bærende celler være svært lav. I dette scenariet, som et supplement til qPCR analyse ved hjelp quasispecies DNA, begrensende-fortynning PCR (LD-PCR) er et alternativ fordel å vurdere hyppigheten av viral genom-bærende celler ^11,12. Kort fortalt er γ-HVS-infiserte lymfocytter serielt utvannet. DNA ekstrahert fra disse cellene skal brukes for en følsom nestet PCR assay, som kan oppdage tilstedeværelsen av single-kopi viral DNA i de enkelte prøver. En kombinert analyse av begrensende fortynning og qPCR vil avsløre både hyppigheten av latent infiserte celler og the viral latent DNA belastning.

Spesielt kan IC analysen ikke brukes som en stand-alone metode for å måle viral latent belastning, på grunn av det faktum at den ikke skiller mellom reduksjoner i viral latent belastning versus en svikt i den latente viruset seg til å reaktivere. Som et ytterligere mål på viral latency, er qPCR brukes til å kvantitativt evaluere den virale genomet eksemplarer i infisert vev. En korrelasjon mellom redusert viral genomet belastning og smittsomme sentrum titer ville foreslå en ventetid feil av viruset. I kontrast, ville et misforhold mellom høy viral genomet belastning og lav latent virus titer hevde at selv om viruset er i stand til å opprettholde en latent viral DNA bassenget, er det ikke effektivt reaktivere fra latency.

I konklusjonen, metodene som er beskrevet i denne protokollen har også generell anvendbarhet til herpesviruses andre enn γHV68, hvor målrettet celletyper og viral genomiske sekvenser er tilgjengelig og lar the utvetydig evaluering av distinkte livssyklus in vivo. Den kan også brukes til å håndtere biologiske rolle av spesifikke virulens faktorer i sammenheng med musen infeksjon. For eksempel ved å sammenligne replikering av forskjellige viral BCL-2 mutant γHV68 med at av vill-type γHV68, gjør at våre nyeste verk ^åtte oss å finne ut hvilken funksjon av vBcl-2 (f.eks apoptose, autophagy, eller begge deler) bidrar til den i vivo oppførsel av dette viruset i akutt og kronisk infeksjon i mus. Dermed, de representerer også viktige verktøy for å dissekere virus-vert interaksjoner under infeksjonen.