Измерение γHV68 инфекции у мышей

Summary

γ-Herpesviruses (γ-HVS) устанавливает пожизненное настойчивость в их хозяина. Заражение мышей с γ-HV68 обеспечивает генетически послушный

Abstract

γ-Herpesviruses (γ-HVS) отличаются способностью устанавливать скрытые инфекции лимфоидных клеток ^1. Узком диапазоне множество человеческих γ-HVS, таких как ВЭБ и KSHV, серьезно препятствует детальные исследования патогенных. Мышей γ-герпесвирусов 68 (γHV68) акций обширные генетические и биологические сходства с человеческим γ-HVS и является естественным возбудителем мюрид грызунов ^2. Таким образом, оценка γHV68 заражение мышей инбредных линий на разных стадиях вирусной инфекции служит важной моделью для понимания вирусной жизненного цикла и патогенез при γ-HVS инфекции.

После прививки интраназально, γHV68 инфекция приводит к острой виремии в легких, который позже решил в латентной инфекции спленоцитов и других клеток, что может быть возобновлен в течение всего срока хост ^3,4. В этом протоколе мы опишем, как использовать доску анализа для оценкис инфекционным титром вируса в легких гомогенатах на Веро монослоев ячейки на ранней стадии (5 - 7 дней) после интраназального заражения (точек на дюйм). Хотя острой инфекции в значительной степени очистили 2 - 3 недели postinfection, латентной инфекции из γHV68 установлено около 14 точек на дюйм и поддерживаться в дальнейшем в селезенке мышей. Скрытая инфекция обычно поражает очень небольшой популяции клеток в инфицированных тканях, при этом вирус остается бездействующим и отключает большую часть своей экспрессии генов. Латентно-инфицированных спленоцитов спонтанно активировать вирус на культивирующий в искусственной среде в культуре ткани, которая может быть кратко изложил на инфекционный центр (ИЦ) анализа для определения вирусной нагрузки скрытой. Для дальнейшей оценки количества вирусных копий генома в острой и / или латентно инфицированных тканей, количественный ПЦР в реальном времени (КПЦР) используется для его максимальной чувствительности и точности. Комбинированный анализ результатов КПЦР и налета анализа и / или IC анализ покажет пространственно-временные профили вирусногорепликации и инфекционности в естественных условиях.

Protocol

Следующий протокол будет описывать изучение вируса титры и вирусной нагрузки генома в литический и латентной инфекции цикл γHV68 у мышей, которые теоретически могут быть использованы для оценки заражения другими вирусами с похожими образ жизни, что и γHV68.

1. Усиление γHV68

1. Оттепель замороженных флакон γHV68 в 37 ° С водяной бане.
2. Добавить к вирусным inoculums NIH3T12 или культуры клеток 3T3 (~ 50% слияния) в 10 см блюда и культуры инфицированных клеток при 37 ° С в 5% СО _2.
3. Изучение культуры микроскопии для цитопатический эффект (ЦПЭ) и сбор средств массовой информации в период, когда более 80% клеток показывают, CPE, 4 ~ 5 дней после заражения. Для максимального выхода вируса, инфицированные культуры клеток можно заморозить-и-талого дважды, чтобы освободить всех клеточно-ассоциированных γHV68.
4. Центрифуга собранных средств массовой информации при 1000 оборотов в минуту в течение 5 мин при комнатной температуре (RT), чтобы удалить ячейку мусора.
5. Тщательно передачи супернатантах к новой трубы (высокоскоростной центрифуге трубки), не касаясь ячейки мусора на дне.
6. Высокоскоростные центрифуги при 12000 оборотов в минуту (для Sorvall SA-600) при температуре 4 ° С в течение не менее 1,5 часов, чтобы сосредоточиться вирусных частиц.
7. Отменить супернатанты в 10γ отбеливающим раствором и тщательно повторно приостанавливать гранул (вирус и остаточного мусора ячейки) с 1 мл бессывороточной DMEM. Передача ресуспендировали гранулы в 1,5 мл микро-центрифуге трубки и хорошо перемешать на вортексе.
8. Центрифуга в течение 2 мин при максимальной скорости для удаления остатков мусора клеток и передачи супернатант (вирус акций) в новую пробирку. Это последняя вирусная акция для инфекции. Титр вируса акции определяется доска анализа (см. ниже).

2. Интраназально Заражение мышей с γHV68

1. Infect мышей при ~ 6-недельного возраста с 1000 ~ 5000 бляшкообразующих единиц (БОЕ) в γHV68 на мышах.
2. Анестезироватьмышей на инъекции кетамина / ксилазина (60 мкл / мышь из смеси 80 мг / мл кетамина и 12 мг / мл ксилазина) в брюшную полость. Монитор анестезии, зажимая мышей ног. Обычно это занимает ~ 5-10 мин. Если мышь не в полной мере под наркозом, то они будут чихать вируса.
3. При наведении курсора мыши полностью под наркозом, использование пипетки привить ~ 30 мкл PBS содержащие γHV68 (15 мкл в каждую ноздрю) мышам капельный медленно, но неуклонно. Убедитесь, что мышь действительно вдыхание капель, не пытаясь форме пузырьков.
4. Разрешить мыши для восстановления в течение 10-15 мин и контролировать благополучие мышей (например, сознание, дыхание и т.д.) перед их возвращением в клетку. Животные проверяются ежедневно в течение болезни и адекватности пищи, воды и постельные принадлежности условиях. Если клинические признаки болезни, боль или страдание развиваться, рутинной диагностики для определения этиологии будет проводиться. Животные, которые теряют более 20% своего веса будет записан для максимального снижения весаи эвтаназии. Окончательное решение о проведении эвтаназии по усмотрению клинического ветеринара и производится после консультации с главным исследователем.

3. Зубной налет Пробирной для определения титра вируса в зараженных Остро Легкие

1. Титр вируса инфекционной определяются образование бляшек на монослоев клеток Веро.
2. Веро клетки высевают на 2.5x10 ^{4 клеток} / лунку в 12 хорошо пластин день до доски анализа. Камеры должны быть равномерно распределены и плотность клеток должна достигать 30 - 40% в день налета анализа.
3. Подготовка 0,5% (вес / объем) метилцеллюлозы (МЦ) наложение среде (табл. 1).
4. Жертва γHV68-инфицированных мышей через 5-7 дней после интраназального инфекции для определения острой фазы титр вируса в легких. Для euthanization Кетамин HCl (80-100 мг / кг подкожно, IM, IP) будут администрируемых IM последующей внутривенной передозировки Na пентобарбитала (30-50 мг / кг, IP). Этот метод утвержден тон Американской Ветеринарной Медицинской Ассоциации.
5. Урожай легких и полоскать два раза с 1 х PBS для удаления клеток крови. Сбор одной стороны легких в 1 мл ледяной полной среде DMEM и держать на льду. Быстрое замораживание другой стороны легких и хранить при температуре -80 ° С для изучения вирусной нагрузки ДНК в легкие КПЦР (см. ниже).
6. Использование ткани гомогенизатор для гомогенизации ткани легких при максимальной скорости в течение 1 сек, замораживания-оттаивания и в три раза. Вымойте гомогенизатор с 70% этанола на каждом шагу при смене образца.
7. Центрифуга гомогенизированных тканей при 3000 оборотов в минуту в течение 10 мин при 4 ° C. Сбор супернатант и перехода на новые трубы для доски анализа.
8. Подготовка серийных разведений (обычно от 10 ° до 10 ^-8) легких гомогената образцов в 1,5 мл микро-пробирок с простым DMEM от вихря. Заполнять соответствующее количество труб с 540 мкл DMEM и разбавленных 60 мкл гомогената в первые трубки. Передача 60 мкл из первой трубки яНе следующий, и так далее.
9. Аспирируйте средств массовой информации из подготовленных Веро монослоев в 12-луночных планшетах и нагрузка 200 мкл / лунку последовательно разбавлены гомогената, содержащие инфекционные вирусы в обратном порядке (от 10 ^-8 до 10 °). Использование двух скважин для каждого титрования (в двух экземплярах).
10. Инкубируйте Веро клетки с вирусом inoculums 1 час при температуре 37 ° C. Аккуратно водоворот пластин каждые 15 минут, чтобы равномерно распределить вирус на монослой.
11. Удалить inoculums и заменить его на 2 мл / лунку наложения среде (табл. 1). Инкубируйте пластин в течение одной недели при температуре 37 ° C.
12. Удаление наложения среды (не нужно быть полным) и заменить исправить / пятно среде доска анализа (табл. 1) и инкубировать в течение по крайней мере на 1 час при комнатной температуре.
13. Когда пластины сушат, подсчитать количество хорошо изолированных бляшек на каждого разведения. Чтобы свести к минимуму ошибки, только скважин, содержащих от 10 до 100 бляшек, подсчитываются.
14. Рассчитать титр вируса использованием ФоллоКрыло формуле: титр (БОЕ / мл) = [(число бляшек / а) / (Объем inoculums / а)] х коэффициент разведения.

4. Инфекционные Пробирной центр для определения вирусной нагрузки в латентно инфицированных Спленоциты

1. Вирусная нагрузка скрытой определяется инфекционный центр (ИЦ) анализ на монослой клеток Веро. Накануне IC анализа, семена клеток Веро в 6-луночных планшетах (1 -. 2,5 • 10 ^{5 клеток} / лунку Мы обычно используем 11 скважин в селезенке образца, 10 скважин будут использованы для серийно разведенной суспензии спленоцитов и одной скважины для тестирования спонтанной реактивации вируса после циклов замораживания-оттаивания.
2. Жертва инфицированных мышей после задержки устанавливается (12 - 14 дней после заражения). Урожай селезенки мыши и бассейном их в 1 мл охлажденной DMEM.
3. Механическая диссоциация мыши селезенки. Передача свежевыделенных селезенки мышей в 10 см тарелку и добавить 10 мл желаемого среде, такой как DMEM с 2% ЭТС. Влажные два матовое стекло класса microscОПЕ слайды с ледяной среде. Место селезенки на стороне матового одного слайда и ник капсула с краю замороженный конец другой слайд. Механически отделить селезенку между двумя слайдами, пока все красные сгустки измельчаются (также удалить жировые частицы, если имеется).
4. Промыть слайды с DMEM восстановить оставшиеся клетки с обеих слайдов.
5. Передача всей подвески ткани мягко через ячейки сетчатого фильтра (40 мкм нейлоновая сетка) в 50 мл коническую завинчивающейся крышкой трубки. Вымойте 10 см блюдо с селезенкой гомогенатах с 10 мл PBS и передачи при фильтрации.
6. Центрифуга одного клеточные суспензии, 10 мин при температуре 375 мкг и отбросить супернатант. Флик ячейки гранул, чтобы разбить существующие сгустки клеток. Добавьте 5 мл ACK буфера (табл. 1) для лизиса эритроцитов. Выдержите 5 минут и снова центрифуге при 375 х г.
7. Удалите супернатант и вновь приостановить гранулы, тщательно, но осторожно, в PBS с 2% ЭТС. Держите клетки при 4 ° C. Используйте пипеткуудаления мусора, если таковые имеются. Граф жизнеспособные клетки, используя автоматический счетчик клетки (Bio-Rad).
8. Спином вниз PBS-ресуспендировали спленоцитов в 375 мкг в течение 4 мин. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в 4 мл полной DMEM (2 х 1 мл будет использоваться для IC анализа исходной суспензии, 0,6 мл использовать для последовательного пять раз растворение в анализе IC, 0,4 мл для вирусной ДНК и подготовка КПЦР, и 1 мл суспензии будет использоваться для оценки спонтанной реактивации латентного вируса после трех циклов замораживания-оттаивания)
9. Подготовка серийного пять раз разведения (т.е. 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250) спленоцитов суспензии в дубликатов. Заполнять 15 мл конические пробирки с 2,4 мл DMEM и разбавьте 600 мкл суспензии спленоцитов в первой пробирке и хорошо перемешать. Передача 600 мкл от предыдущих трубку в следующем трубки и т.д. Не вихрь!
10. Аспирируйте среды от подготовлены 6-а монослой клеток Веро. Семенной 1 мл серийно разбавленного спленоцитов на Vero клетках с каждого разведения duplicated (10 скважин будут использованы для 0, 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250 разведения).
11. Инкубируйте пластин 8-12 часов при 37 ° С и 5% CO _2. Не превышать 24 часов. Аспирируйте подвески посеяны спленоцитов и нагрузки 4 мл наложения средств массовой информации (табл. 1) в каждую лунку. Инкубировать 6 дополнительных дней.
12. Определить уровни селезенки инфекционных центров окраски плит с 0,2% (вес / объем) кристаллический фиолетовый, как показано в зубном налете анализа.

5. Количественная оценка вирусного генома

1. Извлечение общей геномной ДНК из γHV68-инфицированных тканях, таких как рак легких и селезенки образцы в этом эксперименте. Используйте DNeasy крови и тканей Kit (Qiagen), следуя протоколу производителя.
2. Определение концентрации ДНК каждого образца, чтобы обеспечить такое же количество ДНК используется для анализа КПЦР. Дизайн вирус-специфических праймеров (~ 200 б.п. ампликона является предпочтительным для анализа КПЦР). Мы использовали γHV68 ORF56-специфических праймеров (прямого праймера: 5 и пр.IME; - GTAACTCGAGACTGAAACCTCGCAGAGGTCC - 3 '; обратный праймер: 5'-CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG-3') для этого анализа и β-актина праймеров (прямого праймера: 5'-cacccacactgtggcccatcat-3 'обратный праймер: 5'-gtgaggatcttcatgaggtagtc-3'), как контроль за реакцией КПЦР.
3. Смешайте образец ДНК (100 - 500 нг хорошо), и соответствующие грунтовки с 2-х SYBR мастер смеси (Bio-Rad IQ SYBR Green Supermix). Используйте Bio-Rad ПЦР в реальном времени системы для количественного определения вирусной нагрузки в пораженных тканях. Выполните ПЦР на следующие условия: 95 ° C в течение 15 мин и 45 циклов 95 ° C в течение 30 мин, 60 ° С в течение 30 мин и 72 ° С в течение 30 мин, после чего кривая плавления анализ, как для вирусных и актина ампликонов.
4. Для стандартной кривой для количественного определения вирусного генома, серийно разбавленного известные количества γHV68 bacmid ДНК с геномной ДНК, выделенной из неинфицированных клеток. Запуск КПЦР параллельно с ДНК извлекается из инфекцийТед тканей с использованием того же набора вирус-специфических праймеров.
5. Настоящий вирусная нагрузка генома в тканях, как вирусная числа копий ДНК на единицу (например, 100 нг или 500 нг) геномной ДНК после актина нормализации.

6. Представитель Результаты:

На рисунке 1 представлена ​​общая схема экспериментов для измерения γHV68 инфекции у мышей в естественных условиях. Представитель результаты вируса титры в легких во время острой инфекции из γHV68, как это определено доска анализа, были показаны на рисунке 2А. Мутантного штамма γHV68 содержащие нефункциональные вирусных Bcl-2 (vBcl-2) реплицируются на уровне, сопоставимом с диким типом γHV68 в легких после 7 дней интраназального заражения BALB / с мышей (6 - 7 мышей в группе). Никаких статистически значимых различий в легких титры вируса были обнаружены между двумя группами. Эти данные показывают, что vBcl-2 не является решающим фактором для острой инфекции из γHV68 вмышей. Тем не менее, на 28 postinfection дней титр vBcl-2 мутант вируса в селезенке упал 6 - до 10 - раза по сравнению с WT, если судить по инфекционным центром анализа (рис. 2В), предполагая, что vBcl-2 мутант вируса γHV68 неисправен в поддержании селезенки задержкой после заражения. В соответствии с уменьшенным инфекционных титров центр, вирусная нагрузка генома vBcl-2 мутант вируса значительно сниженным по сравнению с WT вирусов на 28-й день в повторных экспериментах, как показано на рис 2С. Тесная взаимосвязь между вирусной нагрузкой генома и частота скрытого HV68vBcl-2 мутант вируса реактивации исключая виво в латентной стадии инфекции подчеркивает задержки недостаток этого мутанта вирусной инфекции.

Рисунок 1. Схема для измерения γHV68 инфекции у мышей с помощью зубного камня, инфекционный центр, и КПЦР анализаs.

Рисунок 2. Литические и латентной инфекции WT и мутантных γHV68 вирусов в естественных условиях. Острый репликации (А) WT и мутантных vBcl-2 γHV68 вирусов в легких мышей BALB / C мышей на 7 точек на дюйм (день после инфекции) определялось доска анализа. (В и С) селезенки инфекционных центров (B) и вирусной нагрузки генома (C) в селезенке зараженных мышей измеряли на 28 точек на дюйм инфекционными анализа центре и КПЦР, соответственно. Красные линии, средние значения указанных значений. нс, не имеет значения.

Discussion

γHV68 был широко использован в качестве модели для понимания патогенеза человека γ-HVS ^2,4,5. В этом протоколе, мы описали три обычно используются методы, в том числе доска тест для инфекционного титра вируса, IC анализ на вирусную нагрузку скрытой, и КПЦР вирусной нагрузки генома, для оценки острой и латентной инфекции из γHV68 после интраназального прививки у мышей.

Доска анализа широко используется для определения титра вируса в инфицированных клетках или тканях, но оптимальные условия изменяются для вирусов используется. Это в значительной степени потому, что способность различных вирусов для производства бляшек (счетная поражений) на клеточный монослой иная. γHV68 обычно производит очевидный бляшек на монослоя клетки Vero обезьяна или культивируемых клеток мыши, такие как NIH3T12 или 3T3, 6 - 7 дней после заражения. Следует отметить, что чувствительность клеток к вирусной инфекции снижается как монослой возраста или становится переполненной Таким образом, мыобычно используют менее 50% от слияния клеток Веро налета анализа, который, по нашему опыту, показывает лучшие результаты для γHV68. Кроме того, равномерно распределяется и свежемолотый производства однослойных рекомендуется для точности подсчета доска. Делая серийные разведения образцов вирусов, осторожность должны быть приняты, чтобы избежать пузырей и пипетки советы должны быть изменены между титрования. Для получения высокого оттитрованы образцов вирусов, 10-кратный серийные разведения рекомендуется, в противном случае, 2 - 5-кратный серийные разведения используются.

В отличие от острой инфекции, в которой инфекционный вирус может быть непосредственно анализировали с помощью бляшкообразующих способности, латентно-инфицированных тканях / образцов γ-HVS обычно не содержат предварительно обнаружить инфекционного вируса, вместо этого, вирусная ДНК поддерживается в виде круговой эписомы с несколькими генами выразил ^6,7. В этом случае задержка вирусной нагрузки можно определить по частоте бывшего реактивации естественных вируса от в ВИТРо эксплантов латентно инфицированных клеток на разрешительной культуре клеток индикатора (например, клетки Vero) ^8. С этой целью суспензии отдельных клеток, зараженных тканей готова, считается, и высевали на монослоев чувствительные клетки, которые затем обложил доска среда анализа. В этом протоколе, мы описали, как подготовить единый клеточные суспензии селезенки для IC анализа для измерения количества латентного вируса, который обладает способностью активировать в селезенке или на душу населения спленоцитов ^4. Так как только небольшая популяция спленоцитов является латентно инфицированных, мы обычно подготовить серийный низким кратные разведения суспензии спленоцитов для инфекционных тестирования титра. Крайняя осторожность должны быть приняты в течение всей процедуры, чтобы избежать суровых клетки пипеткой или вортексе. Важно отметить, что эксплантированных В-клеток селезенки обычно показывают бедных жизнеспособность ^9, которая может повлиять на эффективность бывший реактивации естественных условиях. Любой ген, который улучшает выживание латенскогоTLY инфицированных клеток может косвенно способствовать повышению эффективности естественных бывший реактивации вируса.

По сравнению с бляшкообразующих и IC анализы, КПЦР предоставляет эффективные средства для точного количественного лимфоцитарного γ-HVS у инфицированных мышей _10. Это особенно полезно для вирусов с низким бляшкообразующих способности из-за его минимальную цитотоксичность к Веро или других клеток индикатор, и может быть применен как для остро и хронически инфицированных образцов. Калибровочной кривой необходимо и важно для точного количественного вирусных геномов. Мы разработали γHV68 стандартных кривых на основе ORF56 амплификации гена, используя bacmid клон, содержащий γHV68 генома ^8. КПЦР реакции чрезвычайно чувствительна возможность обнаружить даже несколько копий вирусной ДНК в реакции КПЦР, далеко за пределы зубного налета анализа. Меры предосторожности тем не менее должны быть приняты для предотвращения перекрестного загрязнения между образцами в то время как в том числе uninfecteг по мере необходимости образцы отрицательного контроля для каждой реакции. Специфика КПЦР реакция может быть серьезной проблемой, особенно для инфицированных образцов тканей, так как огромное количество клеточной ДНК может влиять на сигнал вирус-специфических усиления. Это, однако, могут быть обнаружены путем анализа кривых плавления для неспецифической амплифицированных продуктов. В естественно инфицированных спленоцитов населения, частота γHV68 несущие клетки могут быть очень низкими. В этом случае в качестве дополнения к КПЦР анализ с использованием квазивидов ДНК, ограничение разведения ПЦР (LD-PCR) представляет собой альтернативу преимущество для оценки частоты вирусного генома клетки несущие ^11,12. Короче говоря, γ-HVS-инфицированных лимфоцитов последовательно разбавлены. ДНК, извлеченной из этих клеток, которые будут использоваться для чувствительной вложенный ПЦР, которые могут обнаружить присутствие одной копии вирусной ДНК в отдельных образцах. Совместный анализ предельного разбавления и КПЦР покажет как частота латентно инфицированных клеток и йэлектронной вирусной нагрузки ДНК скрытой.

Примечательно, что IC анализ не может быть использован в качестве отдельного метода для измерения вирусной нагрузки скрытых, в связи с тем, что он не делает различия между снижение вирусной нагрузки скрытой против провала латентный вирус сам активировать. В качестве дополнительной меры вирусных задержки, КПЦР используется для количественной оценки вирусных копий генома в инфицированных тканях. Корреляция между снижается вирусная нагрузка генома и инфекционных титр центр будет предлагать задержки дефект вируса. С другой стороны, несоответствие между высокой вирусной нагрузки генома и низкой скрытой вирусной титр бы сказал, что хотя вирус способен поддерживать скрытой вирусной ДНК, бассейн, оно не в состоянии эффективно активировать с задержкой.

В заключение, методы, описанные в данном протоколе также имеют общую применимость к герпеса, кроме γHV68, для которых целевой типов клеток и вирусных геномных последовательностей доступны и позволяют гоэлектронной однозначные оценки различных циклов жизни в естественных условиях. Она также может быть использована для решения биологической роли специфических факторов вирулентности в контексте мыши инфекции. Например, сравнивая репликацию различных вирусных Bcl-2 мутанта γHV68 с дикого типа γHV68, наши недавние работы ⁸ позволяет нам определить, какие функции vBcl-2 (например, апоптоза, аутофагии, или оба) вносит свой ​​вклад в естественных условиях поведение этого вируса в острой и хронической инфекции у мышей. Таким образом, они также представляют собой важные инструменты для рассекать вирус-хозяин взаимодействия во время инфекции.