Måling af γHV68 infektion i Mus

Summary

γ-herpesvirus (γ-HVS) etablere livslang persistens i deres vært. Infektion af mus med γ-HV68 giver en genetisk medgørlige

Abstract

γ-herpesvirus (γ-HVS) er kendt for deres evne til at etablere latente infektioner af lymfoide celler ^1. Den snævre værtsspektrum af menneskelige γ-HVS, såsom EBV og KSHV, har alvorligt hindret detaljerede sygdomsfremkaldende studier. Murine γ-herpesvirus 68 (γHV68) aktier omfattende genetiske og biologiske ligheder med den menneskelige γ-HVS og er en naturlig patogen af murid gnavere ^2. Som sådan evaluering af γHV68 infektion af mus indavlede stammer på forskellige stadier af virusinfektion giver en vigtig model for forståelse viral livscyklus og patogenese ved γ-HVS infektion.

Efter intranasal inokulering at γHV68 infektion resulterer i akutte viræmi i lungen er senere løst i en latent infektion i splenocytes og andre celler, som kan blive genaktiveret i hele livet i værtslandet ^3,4. I denne protokol, vil vi beskrive, hvordan du bruger plaque assay at vurderes infektiøse virus titer i lungen homogenater på Vero-celle monolag i det tidlige stadium (5 - 7 dage) af post-intranasal infektion (dpi). Mens akut infektion stort set er ryddet 2 - 3 uger postinfection, en latent infektion af γHV68 er etableret omkring 14 dpi og vedligeholdes senere i milten af ​​mus. Latent infektion normalt påvirker en meget lille population af celler i det inficerede væv, hvor virus forbliver sovende og slukker de fleste af sine genekspression. Latent-smittede splenocytes spontant reaktivere virus ved eksplantation i vævskultur, der kan gentages af en smitsom center (IC) assay for at bestemme den virale latente belastning. For yderligere at vurdere mængden af ​​virale genom kopier i akut og / eller latent inficeret væv, kvantitativ real-time PCR (qPCR) bruges til dens maksimale følsomhed og nøjagtighed. Den kombinerede analyser af resultaterne af qPCR og plaque assay, og / eller IC-analysen vil afsløre Spatiotemporal profiler af viralreplikation og smitteevne in vivo.

Protocol

Følgende protokol vil beskrive studiet af virus titre og virale genom belastninger i lytiske og latent infektion cyklus af γHV68 i mus, som kan teorien anvendes til at vurdere infektion med andre virus deler samme livsstil, til den, γHV68.

1. Forstærkning af γHV68

1. Tø en frossen hætteglas med γHV68 i 37 ° C vandbad.
2. Tilføj viral inoculums til NIH3T12 eller 3T3 cellekultur (~ 50% confluency) i 10 cm tallerkener og kultur de inficerede celler ved 37 ° C i 5% CO _2.
3. Undersøg kultur ved mikroskopi for cytopatisk effekt (CPE) og indsamle medierne på et tidspunkt, hvor mere end 80% af cellerne viser CPE 4 ~ 5 dage efter smitte. For at maksimere udbyttet af virus, kan den inficerede celle kultur frosne og optøet to gange for at løslade alle celle-associerede γHV68.
4. Centrifugér de indsamlede medierne ved 1000 rpm i 5 minutter ved stuetemperatur (RT) til at fjerne cellefragment.
5. Forsigtigt overføre supernatanter til nye rør (high-speed centrifugerør) uden at røre cellen vragrester i bunden.
6. High-speed centrifuger ved 12.000 rpm (for Sorvall SA-600) ved 4 ° C i mindst 1,5 timer til at koncentrere sig viruspartikler.
7. Kassér supernatanter ind 10γ blegemiddelopløsning og omhyggeligt genopslæmmes pellet (virus og resterende cellefragment) med 1 ml serum-fri DMEM. Overfør resuspenderet pellet i en 1,5 ml mikro-centrifugeglas, og bland godt ved hvirvelblanding.
8. Centrifugér i 2 minutter ved højeste hastighed for at fjerne resterende cellefragment og overføre supernatanten (virus lager) til et nyt rør. Dette er den sidste viral materiel til infektion. Den titer af virus bestanden er bestemt af plaque assay (se nedenfor).

2. Intranasal Infektion af mus med γHV68

1. Inficere mus på ~ 6 uger med 1.000 ~ 5.000 plak-dannende enheder (PFU) af γHV68 pr mus.
2. Anesthetizemus ved injektion af ketamin / xylazin (60 μl / mus af en blanding af 80 mg / ml ketamin og 12 mg / ml xylazin) ind i bughulen. Overvåg anæstesi ved at knibe mus tå. Det tager normalt ~ 5-10 min. Hvis mus ikke er fuldt bedøvede, vil de nyser virus.
3. Når musen er fuldt bedøvet, så brug en pipette til at pode ~ 30 μl af PBS indeholdende γHV68 (15 μl i hvert næsebor) til mus drop-by-slip langsomt men støt. Vær sikker på, at musen er faktisk at indånde dråber uden at forsøge at danne bobler.
4. Lad musen for at komme i 10-15 min og overvåge velfærd mus (fx bevidsthed, vejrtrækning, osv.), før du sende dem tilbage til buret. Dyrene kontrolleres dagligt for sygdom og tilstrækkeligheden af ​​mad, vand og strøelse betingelser. Hvis kliniske tegn på sygdom, smerte eller lidelse udvikle, vil rutine diagnostik til at bestemme ætiologien blive gennemført. Dyr, der mister mere end 20% af deres kropsvægt vil blive optaget til maksimal vægttabog aflivet. Den endelige beslutning om at udføre eutanasi, er på foranledning af den kliniske dyrlæge og er lavet efter samråd med hovedinvestigatoren.

3. Plaque-analysen til Bestem Virus Titer i akut inficerede Lunger

1. Virus infektivitet titer bestemmes af plaque dannelse på monolag af Vero celler.
2. Vero celler udsås på 2.5x10 ⁴ celler / brønd i 12 vel-plader dagen før plaque assay. Cellerne skal være jævnt fordelt, og celletæthed skal nå op på 30 - 40% på dagen for plaque assay.
3. Forbered 0,5% (w / v) methylcellulose (MC) overlay medium (Tabel 1).
4. Offer γHV68-inficerede mus 5-7 dage efter intranasal infektion til at bestemme akut-fase virus titre i lungerne. For euthanization Ketamin HCl (80-100 mg / kg SC, IM, IP) vil blive administreret IM efterfølges af intravenøs overdosis af Na pentobarbital (30-50 mg / kg IP). Denne metode er godkendt af tHan American Veterinary Medical Association.
5. Harvest lungerne og skylles to gange med 1 x PBS til at fjerne blodceller. Saml en side af lungerne i 1 ml iskold komplet DMEM mellemstore og holde på is. Hurtigt fryse den anden side af lungerne og opbevares ved -80 ° C for behandlingen af ​​viral DNA belastninger i lungerne ved qPCR (se nedenfor).
6. Brug en væv homogenisator at homogenisere lungevæv ved maksimal hastighed for 1 sek, fryse-og-tø-tre gange. Vask homogenisator med 70% ethanol ved hvert skridt, når du ændrer prøven.
7. Centrifuger homogeniserede vævet ved 3.000 rpm i 10 min ved 4 ° C. Saml supernatanten og overførsel til nye rør til plaque assay.
8. Forbered serielle fortyndinger (normalt fra 10 ° til 10 ^-8) af lunge homogenatet prøver i 1,5 ml mikro-centrifugeglas med almindeligt DMEM af vortex. Udfyld det passende antal af rør med 540 μl DMEM og fortyndes 60 μl homogenatet ind i det første rør. Overfør 60 μl fra den første prøveglas iikke den næste, og så videre.
9. Aspirer medier fra den forberedte Vero monolag i 12-både plader og belastning 200 μl / hul serielt fortyndet homogenatet indeholder smittefarlige virus i en omvendt rækkefølge (fra 10 ^-8 til 10 °). Brug to brønde til hver titrering (i to eksemplarer).
10. Inkuber Vero celler med virus inoculums 1 time ved 37 ° C. Drej forsigtigt pladerne hver 15 minutter til jævnt distribuere virus over monolag.
11. Fjern inoculums og erstatte det med 2 ml / hul overlayet medium (Tabel 1). Inkubér pladerne i en uge ved 37 ° C.
12. Fjern daeksubstratet (behøver ikke at være komplet) og erstat den med rettelsen / pletten medie plaque assay (Tabel 1) og inkuberes i mindst 1 time på RT.
13. Når pladerne er tørret, tælle antallet af godt isolerede plaques ved hver fortynding. For at minimere fejl, er det kun de brønde, der indeholder mellem 10 og 100 plaques tælles.
14. Beregn den virus titer ved hjælp af følgenwing formel: titer (PFU / ml) = [(antal plaques / brønd) / (volumen inoculums / hul)] x fortyndingsfaktor.

4. Smitsomme center-analysen til Bestem virusmængden i latent Inficerede Splenocytes

1. Viral latente belastning bestemmes af smitsom center (IC) analyse på monolayer af Vero celler. Dagen før IC-analysen, frø Vero celler i 6-godt plader (1 -. 2,5 X 10 ⁵ celler / brønd Vi plejer at bruge 11 brønde pr milt prøve, vil 10 brønde blive anvendt til serielt fortyndet splenocytes suspension og en brønd til test spontane reaktivering af virus efter frost-tø-cykler.
2. Offer de inficerede mus efter latenstid er etableret (12 - 14 dage efter infektion). Harvest musen milt og pool dem i 1 ml kølet DMEM.
3. Mekanisk adskillelse af musen milt. Overfør frisk isolerede musen milt i en 10 cm plade og tilsæt 10 ml ønskede medium, såsom DMEM med 2% FBS. Wet to matteret-end glas microscOPE dias med is-kolde medium. Placer milt på den matterede side af et dias og Nick kapslen med kanten af ​​matterede afslutningen af ​​de andre dias. Mekanisk adskille milten mellem to dias, indtil alle røde klumper er knust (også fjerne fedtpartikler hvis det findes).
4. Skyl objektglassene med DMEM at genvinde resterende celler på begge sider.
5. Overfør hele vævet suspension forsigtigt gennem en celle si (40 μm nylon mesh) i en 50 ml konisk skruelåg rør. Vask 10 cm parabol indeholder milten homogenater med 10 ml PBS og transfer, mens filtrering.
6. Centrifuger enkelt celle suspensioner 10 min ved 375 xg og kasser supernatant. Flick cellen pellets til at bryde op eksisterende celle klumper. Tilsæt 5 ml ACK buffer (tabel 1) at lysere de røde blodlegemer. Inkuber 5 min og centrifuger igen ved 375 x g.
7. Supernatanten fjernes, og genopslæmmes pellets, grundigt, men forsigtigt, i PBS med 2% FBS. Hold celler ved 4 ° C. Brug en pipette til atfjerne snavs, hvis nogen. Tæl levedygtige celler ved hjælp af en automatisk celletæller (Bio-Rad).
8. Spin ned PBS-resuspenderede splenocytes på 375 xgi 4 min. Kassér supernatanten og cellerne i 4 ml komplet DMEM (2 x 1 ml vil blive anvendt til IC analysen af ​​den oprindelige suspension; 0,6 ml bruges til serielle fem gange fortynding i IC assay; 0,4 ml for viral DNA-forberedelse og qPCR, og 1 ml suspension vil blive brugt til at evaluere spontane reaktivering af latent virus efter tre fryse-tø cykler)
9. Forbered seriel fem-folds fortyndinger (dvs. 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250) af splenocytes suspension i dubletter. Udfyld de 15 ml koniske rør med 2,4 ml DMEM og fortyndes 600 μl splenocytes suspension i det første rør og bland godt. Overfør 600 μl fra tidligere rør ind i det næste rør, osv. Må ikke vortex!
10. Aspirer mediet fra det forberedte 6-vel monolayer af Vero celler. Frø 1 ml af serielt fortyndede splenocytes på Vero celler med hver fortynding duplicated (10 brønde vil blive anvendt til 0, 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250 fortyndinger).
11. Pladerne inkuberes 8-12 timer ved 37 ° C og 5% CO _2. Må ikke overstige 24 timer. Aspirer de seedede splenocytes suspension og belastning 4 ml overlay medier (tabel 1) til hver brønd. Inkuber i yderligere 6 dage.
12. Bestemme indholdet af milten smitsomme centre ved farvning af plader med 0,2% (w / v) krystalviolet som vist i plaque assay.

5. Kvantificering af det virale genom

1. Uddrag alt genomisk DNA fra γHV68-inficerede væv, såsom lunge og milt prøver i dette eksperiment. Brug DNeasy Blood & Tissue (Qiagen), efter fabrikantens protokollen.
2. Bestem DNA-koncentration af hver prøve for at sikre den samme mængde af DNA, der bruges til qPCR analysen. Design virus-specifikke primere (~ 200 bp amplikon foretrækkes for en qPCR assay). Vi brugte γHV68 ORF56-specifikke primere (forward primer: 5 & PRIME - GTAACTCGAGACTGAAACCTCGCAGAGGTCC - 3 '; reverse primer: 5'-CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG-3') for denne analyse og β-actin primere (forward primer: 5'-cacccacactgtggcccatcat-3 'reverse primer: 5'-gtgaggatcttcatgaggtagtc-3') som en kontrol for qPCR reaktion.
3. Bland DNA-prøven (100 - 500 ng er god), og passende primere med 2 x SYBR Master Mix (Bio-Rad iQ SYBR Green Supermix). Brug Bio-Rad Real-Time PCR System til at kvantificere den virale belastning i det inficerede væv. Udfør PCR på følgende betingelse: 95 ° C i 15 min og 45 cykler af 95 ° C i 30 min, 60 ° C i 30 min, og 72 ° C i 30 min, efterfulgt af smeltende kurve analyser, for både virale og aktin amplikationsprodukter.
4. For at gøre en standardkurve til kvantificering af virale genomer, seriefremstillede fortyndes kendte mængder af et γHV68 bacmid DNA med det genomiske DNA isoleret fra inficerede celler. Kør qPCR parallelt med de udpegede nationale myndigheders hentet fra infektionerTED væv med samme sæt af virus-specifikke primere.
5. Præsenter den virale genom belastning i væv, som virale DNA-kopier, antal pr enhed (fx 100 ng eller 500 ng) af genomisk DNA efter aktin normalisering.

6. Repræsentative resultater:

Figur 1 viser den samlede ordning for forsøg med måling af γHV68 infektion i mus in vivo. Repræsentative resultater af virus titre i lungerne under akut infektion i γHV68, som bestemmes af plaque assay, blev vist i figur 2A. En mutant stamme af γHV68 indeholdende ikke-funktionelle viral Bcl-2 (vBcl-2) gentaget på et niveau svarende til vild-type γHV68 i lungerne efter 7 dage intranasal infektion i BALB / c mus (6 til 7 mus per gruppe). Ingen statistisk signifikante forskelle i lungen titre af virus blev påvist mellem to grupper. Disse data indikerer, at vBcl-2 ikke er en afgørende faktor for den akutte infektion af γHV68 imus. Men efter 28 dage postinfection faldt titer af vBcl-2 mutant virus i milt 6 - til 10 - gange sammenlignet med den WT, målt ved smitsomme center assay (Figur 2B), tyder på, at vBcl-2 mutant γHV68 virus er defekt i vedligeholdelse af milt latenstid efter infektion. Efter aftale med den reducerede smitsomme centrum titer, var den virale genom belastning af vBcl-2 mutant virus stærkt reduceret i forhold til den, WT virus på dag 28 i gentagne forsøg, som vist i figur 2C. Den tætte sammenhæng mellem virale genom belastninger og hyppigheden af latente-HV68vBcl-2 mutant virus reaktivering af ex vivo ved latent stadium af infektion fremhæver en latenstid fejl af denne mutant virus infektion.

Figur 1. Skematisk diagram til måling af γHV68 infektion i mus ved hjælp af plaque dannelse, smitsomme center, og qPCR assayS.

Figur 2. Lytiske og latent infektion i WT og mutant γHV68 virus in vivo. Akut replikation (A) af WT og mutant vBcl-2 γHV68 virus i lungerne af BALB / c mus ved 7 dpi (dag efter infektion) blev bestemt ved plaque assay. (B og C) milten smitsomme centre (B) og virale genom belastning (C) i milt fra inficerede mus blev målt ved 28 dpi ved smitsomme center assay og qPCR, hhv. Røde linjer, gennemsnit af angivne værdier. ns, ikke signifikant.

Discussion

γHV68 har været meget anvendt som model for at forstå patogenesen af menneskelige γ-HVS ^2,4,5. I denne protokol, beskrev vi tre rutinemæssigt anvendte metoder, herunder plaque assay for smittefarlige virus titer, IC assay for viral latente belastning, og qPCR for virale genom belastning, til at vurdere akutte og latent infektion af γHV68 efter intranasal podning hos mus.

Den plaque assay er blevet brugt i udstrakt grad til at bestemme virus titer i de inficerede celler eller væv, men de optimale betingelser varierer for den virus, der bruges. Dette skyldes især, at kapaciteten af ​​forskellige virus til at producere plaques (tællelig læsioner) på en celle éncellelag er anderledes. γHV68 normalt producerer indlysende plaques på monolayer af aben Vero celler eller kulturperler mus celler såsom NIH3T12 eller 3T3, 6 - 7 dage efter smitte. Især cellen følsomhed over for virusinfektion falder som monolag aldre eller bliver overfyldte Således har vinormalt bruger mindre end 50% confluency af Vero celler til plaque assay, som efter vores erfaring, viser de bedste resultater for γHV68. Desuden er en jævnt fordelt og frisklavet éncellelag stærkt anbefales til nøjagtigheden af ​​plak tælle. Samtidig med at den serielle fortynding af virus prøver, skal der udvises forsigtighed for at undgå bobler og pipettespidser skal skiftes mellem hver titrering. For high-titered virus prøver, er 10-fold seriefortyndinger anbefales, ellers 2 - til 5-fold seriefortyndinger anvendes.

I modsætning til akut infektion, hvor smitsom virus kan være direkte analyseret af plak-dannende evne, latent inficerede væv / prøver af γ-HVS normalt ikke indeholder påviselige preformed smitsomme virus i stedet, er viral DNA bevares som en cirkulær episome med få gener udtrykt ^6,7. I dette tilfælde kan den virale latenstid belastning bestemmes af frekvensen af ​​ex vivo reaktivering af virus fra i vitro eksplanteret af latent-inficerede celler på en eftergivende indikator cellekultur (f.eks Vero celler) ^8. Til dette formål er enkelt celle suspension af inficeret væv forberedt, optalt og forgyldt på monolag af følsomme celler, som derefter overlejret med plaque assay medium. I denne protokol, har vi beskrevet, hvordan du forbereder enkelt celle suspensioner af milt for IC-analysen til at måle mængden af latent virus, der har evnen til at genaktivere pr milt eller pr befolkning splenocytes ^4. Da kun en lille bestand af splenocytes latent er inficeret, vi normalt forbereder seriel lav-fold fortyndinger af splenocytes suspension smittefarlige titer test. Ekstrem forsigtighed skal træffes under hele proceduren for at undgå barske pipettering eller hvirvelblanding celler. Det er vigtigt at bemærke, at eksplanterede B-celler fra milten viser generelt dårlige rentabilitet ^9, som kan påvirke effektiviteten af ex vivo reaktivering. Enhver gen, der forbedrer overlevelse Latently inficerede celler kan indirekte fremme effektiviteten af ex vivo reaktivering af virus.

Sammenlignet med plak-dannende og IC assays, giver qPCR et effektivt middel til præcist at kvantificere lymfatisk γ-HVS i inficerede mus _10. Det er særligt nyttigt for en virus med dårlig evne til plaguedannelse på grund af sin minimale cytotoksicitet til Vero eller andre indikatorer celler, og kan anvendes til både akut og kronisk inficerede prøver. En standardkurve er nødvendig og vigtig for præcist at kvantificere viral genomer. Vi udviklede γHV68 standard kurver baseret på ORF56 genamplifikation, udnytte en bacmid klon indeholder γHV68 genomet ^8. qPCR reaktion er yderst følsom over at være i stand til at opdage selv et par eksemplarer af viral DNA pr qPCR reaktion, langt ud over grænserne for plaque assay. Forholdsregler skal dog sættes på plads for at undgå krydskontaminering mellem prøverne, samtidig med at uninfected prøver, som er nødvendige negative kontroller for hver reaktion. Specificiteten af ​​qPCR reaktion kan være et alvorligt problem især for inficeret vævsprøver, da enorme mængder af cellulær DNA kan påvirke signalet på virus-specifikke forstærkning. Dette kan dog påvises ved at smelte kurve analyse for uspecifik forstærket produkter. I naturligt inficeret splenocyte befolkninger, kan hyppigheden af ​​γHV68-bærende celler være meget lav. I dette scenario, et supplement til de qPCR analyse ved hjælp af quasispecies DNA, begrænse-fortynding PCR (LD-PCR) som er et alternativ fordel at vurdere hyppigheden af virale genom-bærende celler ^11,12. Kort fortalt, er γ-HVS-inficerede lymfocytter serielt fortyndet. DNA ekstraheret fra disse celler skal bruges til en følsom nested PCR assay, som kan påvise tilstedeværelsen af ​​enkelt-kopi viral DNA i de enkelte prøver. En kombineret analyse af begrænsning af fortynding og qPCR vil afsløre både hyppigheden af ​​latent inficerede celler og the viral latent DNA-belastning.

Især kan IC-analysen ikke bruges som en stand-alone metode til måling af viral latente belastning, skyldes, at den ikke skelner mellem reduktion i viral latente belastning versus et svigt af latent virus i sig selv at genaktivere. Som en yderligere foranstaltning af viral latenstid, er qPCR bruges til kvantitativ vurdering af den virale genom kopier i inficerede væv. En korrelation mellem reduceret virale genom belastninger og smitsomme centrum titer tyder på en latenstid fejl af virus. I modsætning hertil ville en forskel mellem høje virale genom belastninger og lave latent viral titer hævder, at selv om virus er i stand til at opretholde en latent viral DNA-pool, det er ude af stand til effektivt at genaktivere fra latency.

Konklusionen er, også de metoder, der er beskrevet i denne protokol har generelle anvendelighed på herpesvirus andet end γHV68, hvor målrettet celletyper og viral genomiske sekvenser er til rådighed, og lad the entydig vurdering af forskellige livscyklus in vivo. Den kan også bruges til at adressere den biologiske rolle af specifikke virulensfaktorer i forbindelse med musen infektion. For eksempel, ved at sammenligne replikation af forskellige virale Bcl-2 mutant γHV68 med, at af vildtype γHV68 vores seneste arbejde ⁸ giver os mulighed for at afgøre, hvilken funktion vBcl-2 (f.eks apoptose, autophagy, eller begge dele) bidrager til den i vivo-opførsel af denne virus ved akut og kronisk infektion i mus. Således, de også er vigtige redskaber til at dissekere virus-vært interaktioner i løbet af infektion.