Summary
아세테이트 키나제 활동의 결정을위한 방법을 설명합니다. 이 분석은 다른 phosphoryl acceptors와 아세테이트 - 성형 방향으로 아세테이트 키나제 효소의 활동과 속도론을 결정하기위한 직접적인 반응을 활용합니다. 또한,이 방법은 다른 아세틸 인산 또는 아세틸 - COA 활용한 효소를 시금 활용하실 수 있습니다.
Abstract
아세테이트 키나제, 아세테이트, 설탕 키나제 - Hsp70 - 굴지 (ASKHA) 효소 superfamily 1-5의 회원은 기판으로 ATP를 이용 아세틸 인산에 아세테이트의 인산화 가역에 대한 책임이 있습니다. 아세테이트 kinases는 Archaea 중 하나 속에서 발견, 박테리아에 유비 쿼터스하고 있으며, 또한 Eukarya 6 미생물에 존재한다. 가장 잘 특징 아세테이트 키나제는 그 메탄 생산 archaeon Methanosarcina thermophila 7-14에서. 단 인산염 - 성형 아세틸 방향으로 ATP하지 i를 PP 활용할 수도 있지만 아세테이트 키나제는 Entamoeba histolytica, 아메바 이질의 원인이되는 대리인으로부터 격리되어 있으며, 지금까지이 속 15,16에서만 발견되었습니다.
아세틸 인산 형성의 방향에서 아세테이트 키나제 활동이 일반적으로 첫번째 Lipmann에 의해 설명 hydroxamate 분석을 사용하여 측정17-20, 효소의 pyruvate의 키나 아제 및 젖산 탈수소 효소 21,22에 의해 ADP로 ATP의 전환이 NAD으로 NADH의 산화에 결합되는 결합 분석 +, 또는 아세틸 인산 제품의 반응 후 무기 인산염의 릴리스를 측정 분석 히드록 실 아민 23. 반대로 활동은 아세테이트 - 형성 방향은 ADP에서 NADP의 감소 + 효소의 hexokinase 및 포도당 6 인산 탈수소 효소에 의해 24 NADPH로하는 ATP 형성을 결합하여 측정됩니다.
여기 커플링 효소를 필요로하지 않는 아세테이트 형성의 방향으로 아세테이트 키나제 활동의 검출하는 방법을 설명하는 대신 아세틸 인산 소비의 직접적인 결정에 따라 달라집니다. 효소 반응 후 남아있는 아세틸 인산이 hydroxamate 분석에 관해서 spectrophotometrically 측정할 수있는 푹 삭은 hydroxamate 복합 변환됩니다. 따라서 일와는 달리ADP에서 ATP의 생산에 의존이이 방향에 대한 andard 결합 분석,이 직접적인 분석은 ATP 또는 PP i를 생산 아세테이트 kinases 사용할 수 있습니다.
Protocol
이 프로토콜의 전체 구조는 그림 1에 설명되어있다.
1. 표준 곡선 및 Assays을위한 솔루션 준비
- 히드록 실 아민 - HCL의 2 몰 / L 솔루션의 100 ML를 준비합니다. 히드록 실 아민 하이드로 클로라이드의 13.9 g (MW 69.49 g / 몰)을 무게와 약 50 ML 증류수 - 탈이온수 (ddH 2 O)에 용해. 수산화 칼륨의 알약이나 집중 솔루션을 사용하여 7.0 산도를 조정합니다. 100 ML에 최종 볼륨을 가져와. 솔루션은 최대 30 일 또는 4 ° C 90 일까지에 대한 상온에서 저장할 수 있습니다.
- 산화철 염화 / 염산 용액 100 ML을 준비합니다. 13.5 g 산화철 염화물 (MW 270.32 g / 몰)을 무게와 약 50 ML ddH 2 O.에 용해 41.3 ML 집중 염산 (12.1 몰 / L)을 추가 100 ML의 최종 볼륨 가져와. 산화철 염화의 최종 농도는 0.5 몰 / L와 염산의 최종 농도는 5 몰 될 것입니다/ L. 솔루션은 상온에서 저장됩니다.
- trichoroacetic 산의 1.84 몰 / L 솔루션의 100 ML를 준비합니다. trichloroacetic 산 (MW 163.39 g / 몰)의 30.0 g를 무게, ddH 2 O에 용해 100 ML에 최종 볼륨을 가지고. 솔루션은 상온에서 저장됩니다.
- 0.1 몰 / L 아세틸 인산 용액 5 ML을 준비합니다. 0.092 g 아세틸 인산이 전분 (MW 184.06 g / 몰)을 무게, ddH 2 O에 용해 5 ML에 최종 볼륨을 가지고. 나누어지는 microcentrifuge 튜브 (튜브 당 0.25 ML)에 솔루션을 사용하기 전까지 -20 ° C에서 동결. 해동 솔루션은 얼음에 배치해야하고 약 1 시간 동안 사용할 수 있습니다. 해동되었습니다 아세틸 인산 솔루션은 refrozen하고 다시 사용하지 않을 것입니다.
- ADP의 0.1 몰 / L 솔루션의 5 ML을 준비합니다. ADP의 0.24 g을 (MW 472.5 g / 몰) 달아서 나누다, ddH 2 O에 용해, 5 ML에 최종 볼륨을 가지고. -20에서 나누어지는 microcentrifuge 튜브에 용액 (튜브 당 0.5 ML)과 냉동 ° C까지사용합니다. 사용 전까지 얼음에 해동 솔루션 보관하십시오.
- 트리스의 1 몰 / L 용액의 50 ML을 준비합니다. 6.06 g 트리스 (MW 121.14 g / 몰)을 무게, 40 ML ddH 2 O.에 용해 염산을 사용하여 7.0 솔루션의 산도를 조정 50 ML에 최종 볼륨을 가지고. 상온에서 저장 솔루션입니다.
- 1 몰 / L 마그네슘 염화물 솔루션 10 ML을 준비합니다. 2.03 g의 염화 마그네슘 (MW 203.31 g / 몰)을 무게, ddH 2 O에 용해, 10 ML에 최종 볼륨을 가지고. 상온에서 솔루션을 저장합니다.
- 산화철 염화 / 염산 용액과 산성 trichloroacetic 솔루션의 동등 권을 혼합 25 ML 개발 솔루션을 준비합니다. 개발 솔루션은 매일 신선한 준비하고 실온에서 보관해야합니다.
2. 아세틸 인산 표준 곡선의 준비
- 아세틸 인산 표준 곡선은 아세틸 인산 알려진 금액을 사용하여 생성됩니다. eigh 6의 표준 곡선t 포인트 적합합니다. 기준은 0.03 μmoles에서 0.9 μmoles로 0.1-3 mmol / L.의 최종 농도로 300 μL 상호를 범위해야 300 μL의 최종 볼륨 100 MM 트리스 솔루션에 적절한 농도로 아세틸 인산 재고 솔루션을 희석. 아세틸 인산이없는 컨트롤 샘플도 준비되어야합니다.
- ° C 열 블록에서 1 분 37 각 표준 및 컨트롤을 품어.
- 각 표준에 히드록 실 아민 하이드로 클로라이드 솔루션과 세 번 흔들어하여 제어 및 혼합 50 μL를 추가합니다. 60 ° C 열 블록에 표준을 놓고 5 분 동안 품어.
- 100 표준 개발 솔루션의 μL 및 제어, 세 번 흔들어하여 믹스를 추가하고 색상 실온에서 1 분 이상을 위해 개발 수 있습니다.
- 1 분 18,000 XG에 microcentrifuge의 모든 기준과 컨트롤을 원심.
- spectrophotometrically 샘플을 측정분광 광도법을위한 빈과 같은 컨트롤을 사용하여 1mL 플라스틱 cuvettes를 사용하여 t 540 NM.
- 적절한 데이터 분석 및 그래프 소프트웨어 (예 : Kaleidagraph, 시너지 소프트웨어)를 사용하여 표준 곡선을 생성합니다. 0.99 이상의 R 2 값은 매력입니다. 데이터는 아세틸 인산 현재의 μmoles 비해 540 nm의 흡광도에서로 꾸몄다 있습니다.
3. 아세테이트 키나제 활동에 대한 분석
- 설명된 솔루션을 사용하여, 0.1 몰 / L 트리스 버퍼, 10 mmol / L 마그네슘 염화물, 5 mmol / L ADP, 2 mmol / L 아세틸 인산의 최종 농도를 포함하는 반응 혼합물을 준비합니다. 10 ML 반응 혼합물은 8.2 ML ddH 2 O, 1.0 ML 트리스 솔루션, 0.1 ML 마그네슘 염화물 용액, 0.5 ML ADP 솔루션, 그리고 0.2 ML 아세틸 인산 솔루션을 필요합니다. microcentrifuge 튜브 300 μl aliquots의 반응 믹스를 배포합니다. 기판 농도의 운동 매개 변수와 최적화 결정에 대한 하나의 기판 수 있습니다다양하고 다른 반응에 일정한 농도에서 열립니다.
- 37 일분 대한 반응을 미리 품어 ° C 열 블록에.
- 반응 효소의 원하는 금액을 추가하고 즉시 37 ° C 열 블록에 튜브를 반환합니다. 또한는 효소가 추가되지되는 컨트롤에 대한 반응을 포함합니다. 여러 개의 반응을 수행할 경우, 특정 시간 간격으로 튜브에 효소를 추가합니다. 시간 추적해야합니다. (참고 : 사용할 수 효소의 양은 아세틸 인산이나 ADP 기판의 모든이 소진되지 않을 것임을 보장하기 위해 최적화해야합니다 - 토론 섹션을 참조)
- 5 분 후에 각각의 반응과 제어, 혼합에 히드록 실 아민 하이드로 클로라이드 솔루션의 50μl를 추가하고, 60 ° C 열 블록에 튜브를 삽입합니다. 여러 가지 반응이 수행되는 경우에는 효소가 추가되면서, 이것은 동일한 시간 간격으로 수행되어야합니다.
- 60에서 5 분 동안 반응과 컨트롤을 품어 ° C.
- 100 및 추가무, 각각의 반응과 실험실 벤치에서 튜브 랙에 제어, 믹스, 그리고 장소에 개발 솔루션의 L. 색상은 적어도 1 분 개발할 수 있습니다. 허용
- 1 분 18,000 XG에 microcentrifuge의 모든 튜브를 원심 분리기.
- 측정 샘플 spectrophotometrically 1mL 플라스틱 cuvettes를 사용하여 540 nm의에서, 아세틸 인산 표준 곡선과 비교하여 아세틸 인산 현재의 양을 결정합니다.
- 고갈 아세틸 인산 기판의 크기는 조절 부족한 효소에있는 아세틸 인산이 전분의 양을에서 효소 반응 후 남아있는 아세틸 인산이 전분의 양을 빼서에 의해 결정하실 수 있습니다. 적절한 데이터 및 그래프 소프트웨어 (예 : Kaleidagraph, 시너지 소프트웨어)을 사용하여 데이터 분석을 수행합니다. 0.97보다 큰의 R 2 값은 매력입니다.
4. 대표 결과 :
이 분석의 목적은 직접에 아세트산 키나제의 활동을 측정하는 것입니다아세테이트 형성 이온. 아세테이트 생산에 대한 쉬운, 직접 측정이없는 등이, 아세틸 인산 기판의 소비를 측정하여 이루어집니다. 효소 반응 동안 주어진 시간 이후에 남아있는 아세틸 인산이 아세틸 hydroxamate하고 이후 540 nm의에서 측정할 수있는 붉은 색 (그림 2)이 산화철 hydroxamate 단지로 변환됩니다. 표준 μmoles 아세틸 인산 선물 대 흡광도를 계획하고 표준 곡선은 각 반응에 남아 아세틸 인산이 전분의 양을 결정하는 데 사용됩니다. 표준 곡선은 영점을 통해 선형되어야합니다. 그림 3과 같이 대표적인 표준 곡선은 데이터를 잘 선형 방정식에 맞는을 나타내는 μmole 아세틸 인산 제시하고 0.99의 R 2 값 당 1.2332 흡광도 단위의 슬로프가 있습니다. 표준 곡선 데이터에 선형 적합 방정식은 반응에 남아 아세틸 인산의 수량을 계산하는 데 사용됩니다. μmoles소비 아세틸 인산이 전분의 효소 및 효소 반응 후 남아있는 아세틸 인산의 μmoles을 부족한 제어 반응에있는 아세틸 인산의 μmoles 차이로 결정됩니다.
정화, 재조합 M. thermophila 아세트산 키나제는 설명 프로토콜을 사용 assayed했다. 그림 4에 표시된 실험, ADP의 농도 5 mmol / L에서 지속적인 개최되었으며 반응으로 아세틸 인산의 농도는 아세틸 인산에 대한 K M을 결정하기 위해 다양한되었습니다. 예상했던대로,이 실험은 효소가 각 기판에 대한 표준 Michaelis - Menten 같은 속도론을 다음과 아세틸 인산 농도 비교 활동을하려 할 때 쌍곡선 포화 곡선을 생산 것을 보여줍니다. 아세틸 인산이 전분에 대한 명백한 K m 값은 0.27 ± 0.47의 게시된 K m 값 유리와 비교 0.01 mmol / L, ± 결합으로 사용하는 0.01 mmol / L되었습니다13 말한다.
직접 분석은 또한 표준 결합 분석을 사용 불가능 ATP 이외의 기판을 활용 아세테이트 kinases의 활동을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 재조합 E.을 정화 아세테이트 - 성형 방향으로 PP 전보다는 ATP를 생산 histolytica 아세테이트 키나제 16, ADP 대신에 인산 나트륨을 사용하여이 분석의 대상이되었다. 반응에서 인산 나트륨의 농도는 0.2 몰 / L에서 지속적인 개최되었다 그리고 아세틸 인산 농도가 다양했습니다. M.에 대해서는 thermophila 아세트산 키나제, E. histolytica 아세트산 키나제는 아세틸 인산에 대한 Michaelis - Menten 같은 속도론을 따라하고 쌍곡선 포화 곡선은 (그림 5) 관찰되었다. 아세틸 인산이 전분에 대한 명백한 K m 값은 0.50 ± 0.006 mmol / L.되었습니다 리브스와 오클라호마 주 15 원래 효소에 대한 아세틸 인산에 대한 0.06 mmol / L의 K m 값을 결정; 방법 도, 그들의 효소가 부분적으로만 정제 및 분석도 일부만 정화 4 명이 결합 효소를 참여했습니다. 그러므로, 그것은 바로 이러한 가치를 비교하기가 어렵습니다.
프로토콜 제도
- 아세틸 인산 표준 곡선을 생성
- 원하는 농도에 효소를 희석
- microcentrifuge 튜브에 반응 혼합물과 나누어지는 300 μl 준비
- 1 분 37 Preincubate 반응 ° C
- 특정 시간 간격으로 효소를 추가하여 반응을 시작합니다
- 반응을 중지하고 60 부화 같은 간격으로 히드록 실 아민을 추가 ° C를 5 분
- 산화철 염화물 / 컬러 개발을위한 trichloroacetic 산 솔루션 추가
- 1 분 18,000 XG에 튜브를 원심 분리기
- 540 nm의 흡광도를 측정에서
- 표준 곡선과 비교하여 소비 아세틸 인산이 전분의 양을 결정
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그림 1. 프로토콜 계획
그림 2. 아세틸 인산 기준. 아세틸 인산의 농도 증가가 설명된대로 히드록 실 아민 및 색상이 개발로 반응했다. 아세틸 인산이 부족한 컨트롤은 밝은 노란색이며, 아세틸 인산의 증가 금액을 포함하는 반응 컬러 연속 어두운됩니다. 이러한 색상 변경은 540 nm의에서 측정됩니다.
그림 3. 샘플 아세틸 인산 표준 곡선. 아세틸 인산이 전분의 다양한 양의 히드록 실 아민과 반응되었으며 색상 개발 솔루션과 흡광도가 540 NM에서 측정되었다. μmoles 아세틸 인산이 전분 대 540 nm의 흡광도에서이 역모되었고 데이터에 선형에 맞게이 적용되었습니다. </ P>
그림 4. ATP 생산 M.에 의해 아세틸 인산의 이용 thermophila 아세트산 키나제. 효소 활동은 아세틸 인산의 다양한 농도 5 mmol / L ADP의 면전에서 아세테이트 형성의 방향으로 결정되었다. 아세틸 인산 소비의 양은 반응으로 아세틸 인산의 시작 금액 및 효소 반응 후 남아있는 아세틸 인산의 양에 차이로 결정되었습니다. Assays이 표시 오차 막대와 세중의에서 수행되었습니다.
그림 5. PP에 의해 아세틸 인산의 이용 전 생산하는 E. histolytica 아세트산 키나제. 아세테이트 형성의 방향으로 효소 활동은 0의 존재에서 산출된 것입니다.아세틸 인산의 농도를 변화 2 몰 / L 인산 나트륨. 아세틸 인산 소비의 양은 반응으로 아세틸 인산의 시작 금액 및 효소 반응 후 남아있는 아세틸 인산의 양에 차이로 결정되었습니다. Assays이 표시 오차 막대와 세중의에서 수행되었습니다.
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Discussion
이 분석에서 아세틸 인산의 감지는 히드록 실 아민 하이드로 클로라이드의 충분한 농도와 산화철 염화물 용액의 농도와 산도에 의존적일 수 밖에 없습니다. 분석 볼륨의 변경은 이러한 구성 요소 모두의 재검토가 필요합니다. 효소 반응이 여기에 설명된 37 실시했다 ° 5 분 ° C 60 수행한 히드록 실 아민의 종료와 함께 C. 이것은 높은 온도는 아세틸 hydroxamate에 남아있는 아세틸 인산의 급속한 전환 수 있도록 중요합니다. 흡광도의 색상 개발 단계 및 측정에 소요되는 기간은 덜 중요하고, 히드록 실 아민 솔루션뿐만 아니라 다음과 같이 작은 5 분 최대 15 분 이내에 수행할 수 있습니다. 샘플의 산성은 효소의 강수량으로 이어질 수 있으며 탁도보다는 실제 색상의 변화로 인해 부당하게 높은 독서를 만들 수있는 샘플은 흡광도를 읽기 전에 centrifuged해야합니다.개발된 반응의 내역은 10~15분 후에 발생하기 시작합니다.
효소 속도론을 조사이 분석의 주요 합병증은 사용하는 효소의 양을 결정과 반응의 첫 단계를 실행하는 시간의 길이입니다. 이러한 활동의 수준 아세틸 인산 기판의 모든 소비되도록 높지 않을 그러한 각각의 효소에 대해 경험적으로 결정되어야합니다. 세심한주의는 운동 곡선의 각 반응 점에 대한 %를 아세틸 인산 소비 부여하여야한다. 포화 기판 농도에 아세틸 인산의 소비가 10 % 이상 약간은 덜 접근해야하는 동안 일반적으로 운동 곡선의 다양한 구성 요소의 낮은 농도는 최대 약간 위 90% 또는 아세틸 인산 소비의 결과 것입니다. 효소 농도가 최적화되면 운동 상수의 결정을위한 기판 범위는 다음 확인할 수 있습니다.
피아세테이트 - 성형 방향으로 아세테이트 키나제의 활동을 측정 revious 방법은 결합 assays의 사용을 참여. 이러한 방법은 분석 조건 (산도, 이온 강도, 온도 등) 관심의 효소에 대한 최적의 분석 조건에 호환되지 않을 수 커플링 효소 (들)의 활동에 의존으로 인해 운동 계산에 대하여는 문제가 . 또한, 억제제와 함께 연구에 대한 직접적인 분석의 사용은 커플링 효소의 억제에서 발생할 수있는 문제를 방지 수 있습니다. 전반적으로,이 분석은 아세테이트 키나제 유용뿐만 아니라 있어야하지만 아세틸 인산과 같은 아세틸 또는 propionyl - COA 다른 활성 짧은 사슬 아실 기판, propionyl 인산과 반응 모두있는 아세틸 - AMP를 이용하는 효소에 대한 히드록 실 아민과 함께. 이러한 경우에는, 표준 곡선은 아세틸 인산과 대신 적절한 아실 기판과 함께 생성됩니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NSF 상을 # 0,920,274 및 사우스 캐롤라이나 실험 역 프로젝트 (SC - 1700340) KSS에 의해 지원되었다. 본 논문은 클렘슨 대학 실험 역 5929 기술 공헌 번호입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetyl phosphate | Sigma-Aldrich | 01409 | Lithium Salt (97% ) |
| Sodium phosphate monobasic (dehydrate) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S381 | |
| Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S374 | |
| Magnesium chloride (hexahydrate) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | M33 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific, Inc. | B152 | |
| Ferric chloride (hexahydrate) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | I88 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A324 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Thermo Fisher Scientific, Inc. | H330 | |
Adenosine 5’-diphosphate sodium salt |
Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Biomate III Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 142982082 | Standard UV/Vis spectrophotometer |
References
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