Summary
Um método para a determinação da atividade da quinase de acetato é descrito. Este ensaio utiliza uma reação direta para determinar a atividade enzimática e cinética de acetato quinase na direção de formação de acetato com diferentes aceptores fosforil. Além disso, este método pode ser utilizado para a dosagem de fosfato de acetila ou outras enzimas acetil-CoA utilizando.
Abstract
Quinase acetato, um membro do acetato e-quinase Hsp70-actina açúcar superfamília de enzimas (ASKHA) 1-5, é responsável pela fosforilação reversível de acetato de acetil fosfato ATP, utilizando como substrato. Acetato de quinases são onipresentes na bactéria, encontrada em um gênero de Archaea, e também estão presentes em micróbios da Eukarya 6. O acetato quinase mais bem caracterizado é que a partir do metano produzindo archaeon Methanosarcina thermophila 14/07. Uma quinase de acetato, que só pode utilizar PP i ATP, mas não na direção do acetil-fosfato formando foi isolado de Entamoeba histolytica, o agente causador da disenteria amebiana, e até agora só foi encontrado nesta 15,16 gênero.
Na direção da formação de fosfato de acetil, acetato de atividade da quinase é normalmente medido utilizando o ensaio de hidroxamato, primeiramente descrita por Lipmann17-20, um ensaio acoplado em que a conversão de ATP a ADP é acoplada a oxidação de NADH para NAD + pela enzimas piruvato quinase e lactato desidrogenase 21,22, ou um ensaio de medição de liberação de fosfato inorgânico após a reação do produto acetil fosfato com hidroxilamina 23. Atividade no lado oposto, o acetato de formação de sentido é medida pelo acoplamento formação de ATP a partir de ADP para a redução do NADP + a NADPH pela hexoquinase enzimas e glicose 6-fosfato desidrogenase 24.
Aqui nós descrevemos um método para a detecção de atividade de acetato quinase na direção da formação de acetato de que não necessita de enzimas de acoplamento, mas em vez disso é baseada na determinação direta do consumo de fosfato de acetila. Após a reação enzimática, permanecendo acetil fosfato é convertido em um complexo hidroxamato férrico que pode ser medido espectrofotometricamente, como para o ensaio hidroxamato. Assim, ao contrário do stensaio acoplado andard para esta direcção, que é dependente da produção de ATP a partir de ADP, este ensaio direto podem ser utilizados para quinases acetato que produzem ATP ou PP i.
Protocol
O esquema geral deste protocolo é descrito na Figura 1.
1. Preparação solução para Curvas padrão e Ensaios
- Prepare 100 mL de solução 2 mol / L de hidroxilamina-HCl. Pesar 13,9 g de cloridrato de hidroxilamina (MW 69,49 g / mol) e dissolver em aproximadamente 50 mL de água destilada deionizada-(DDH 2 O). Ajustar o pH para 7,0 utilizando pellets de hidróxido de potássio ou uma solução concentrada. Reduzir o volume final de 100 mL. A solução pode ser armazenada à temperatura ambiente por até 30 dias ou a 4 ° C por até 90 dias.
- Prepare 100 mL de um cloreto férrico / solução de ácido clorídrico. Pesar 13,5 g de cloreto férrico (MW 270,32 g / mol) e dissolver em aproximadamente 50 mL DDH 2 O. Adicionar 41,3 mL de ácido clorídrico concentrado (12,1 mol / L) e trazer para um volume final de 100 mL. A concentração final de cloreto férrico será de 0,5 mol / L ea concentração final de ácido clorídrico será de 5 mol/ L. A solução é armazenado em temperatura ambiente.
- Prepare 100 mL de uma solução 1,84 mol / L de ácido trichoroacetic. Pesar 30,0 g de ácido tricloroacético (MW 163,39 g / mol), dissolver em DDH 2 O e trazer o volume final de 100 mL. A solução é armazenado em temperatura ambiente.
- Prepare 5 mL de uma solução de fosfato 0,1 mol / L acetil. Pesar 0,092 g de fosfato de acetila (MW 184,06 g / mol), dissolver em DDH 2 O e trazer o volume final de 5 mL. Alíquota da solução para tubos de microcentrífuga (0,25 mL por tubo) e congelar a -20 ° C até o uso. Solução de descongelado deve ser colocado sobre o gelo e pode ser usado por aproximadamente 1 hora. Solução de fosfato acetil que foram descongelados não devem ser novamente congelados e reutilizados.
- Prepare 5 mL de uma solução 0,1 mol / L de ADP. Pesar 0,24 g de ADP (MW 472,5 g / mol), dissolver em DDH 2 O, e trazer o volume final de 5 mL. Alíquota da solução em tubos de microcentrífuga (0,5 mL por tubo) e congelar a -20 ° C atéuso. Mantenha solução descongeladas em gelo até o uso.
- Prepare 50 mL de uma solução a 1 mol / L de Tris. Pesar 6,06 g Tris (MW 121,14 g / mol), e dissolver em 40 mL DDH 2 O. Ajustar o pH da solução para 7,0 com ácido clorídrico e trazer um volume final de 50 mL. Solução de armazenamento em temperatura ambiente.
- Prepare 10 mL de uma solução de cloreto de 1 mol / L de magnésio. Pesar 2,03 g de cloreto de magnésio (MW 203,31 g / mol), dissolver em DDH 2 O, e trazer um volume final de 10 mL. Guardar a solução em temperatura ambiente.
- Prepare 25 mL solução de desenvolvimento através da mistura de volumes iguais da solução de ácido cloreto férrico / clorídrico e solução de ácido tricloroacético. Solução de desenvolvimento deve ser renovada diariamente e armazenados à temperatura ambiente.
2. Preparação de uma Curve Acetyl Phosphate Padrão
- Uma curva padrão acetil fosfato é gerado utilizando quantidades conhecidas de fosfato de acetila. Uma curva padrão de seis para dezoitopontos t é adequado. Os padrões deve variar de 0,03 a 0,9 μmoles μmoles por 300 mL, que correlaciona a concentração final de 0,1 a 3 mmol / L. Diluir a solução estoque acetil fosfato à concentrações adequadas em 100 mM Tris solução em um volume final de 300 mL. A amostra de controlo sem fosfato acetil também deve estar preparado.
- Incubar cada padrão e o controle a 37 ° C em um bloco de aquecimento por 1 minuto.
- Adicionar 50 mL da solução de cloridrato de hidroxilamina a cada padrão e o controle e misture agitando três vezes. Coloque o padrão em um bloco de aquecimento 60 ° C e incubar por cinco minutos.
- Adicionar 100 mL de solução de desenvolvimento para os padrões eo controle, misture agitando três vezes, e permitir que a cor se desenvolva, pelo menos, um minuto à temperatura ambiente.
- Centrífuga todas as normas e o controle em uma microcentrífuga a 18.000 xg por 1 minuto.
- Medições com as amostras espectrofotometricamente umat 540 nm usando 1mL cubetas de plástico, usando o controle como o branco para espectrofotometria.
- Gerar uma curva padrão de análise de dados apropriado e software gráficos (por exemplo, Kaleidagraph Software Synergy). Valores de R 2 de 0,99 ou superior são desejáveis. Os dados são representados como absorbância a 540 nm contra μmoles de fosfato presente acetil.
3. Ensaio para a atividade da quinase Acetato
- Usando as soluções descritas, prepare uma mistura de reação contendo uma concentração final de 0,1 mol / L Tris buffer, 10 mmol / L de cloreto de magnésio, 5 mmol / L ADP, fosfato e 2 mmol / L acetil. A mistura de reação 10 mL 8,2 mL exigirá DDH 2 O, 1,0 mL de solução Tris, 0,1 mL de solução de cloreto de magnésio, 0,5 mL de solução ADP, e 0,2 mL de solução de fosfato de acetila. Distribua a mistura de reacção em 300 mL alíquotas para tubos de microcentrífuga. Para a determinação de parâmetros cinéticos e otimização das concentrações de substrato, um substrato podem servariada e a outra segurava a uma concentração constante nas reações.
- Pré-incubar a reação por 1 minuto a 37 ° C em um bloco de calor.
- Adicionar uma quantidade desejada de enzima para a reação e devolver imediatamente o tubo para o bloco de aquecimento 37 ° C. Incluir também uma reação de controle para que não enzima é adicionado. Se várias reações são realizadas, adicione enzima para os tubos em intervalos de tempo específicos. Certifique-se de manter o controle de tempo. (NOTA: A quantidade de enzima a ser utilizada terá que ser optimizados para garantir que todos os acetil fosfato ou substrato ADP não estarão esgotados - ver secção Discussão)
- Após 5 minutos, adicionar 50μl da solução de cloridrato de hidroxilamina a cada reação e no controle, misture e coloque os tubos em um bloco de aquecimento 60 ° C. Se diversas reações estão sendo realizadas, isso deve ser feito no mesmo intervalo de tempo como a enzima foi adicionada.
- Incubar as reações e do controle por 5 minutos a 60 ° C.
- Adicionar 100 μ L da solução de desenvolvimento para cada reação e do controle, misture e coloque em um suporte de tubos na bancada do laboratório. Permitem que a cor se desenvolva durante pelo menos 1 minuto.
- Centrifugar todos os tubos em uma microcentrífuga a 18.000 xg por 1 minuto.
- Amostras medida espectrofotometricamente em 540 nm usando 1mL cubetas de plástico e determinar a quantidade de fosfato presente acetil em comparação com a curva de acetil fosfato padrão.
- A quantidade de substrato fosfato de acetil esgotados pode ser determinado subtraindo-se a quantidade de fosfato acetil remanescente após a reação enzimática a partir da quantidade de fosfato de acetila presente na enzima controle faltando. Realizar a análise de dados usando dados apropriados e software gráficos (por exemplo, Kaleidagraph Software Synergy). Valores de R 2 superiores a 0,97 são desejáveis.
4. Resultados representativos:
O objetivo deste ensaio é medir a atividade quinase de acetato na diretaion de formação de acetato. Isto é feito através da medição de consumo do substrato fosfato de acetil, como não há medição, fácil e direta para a produção de acetato. Fosfato acetil remanescentes após um determinado tempo durante a reação enzimática é convertido em acetil hidroxamato e, posteriormente, para o complexo hidroxamato férrico, que tem uma cor avermelhada (Figura 2) que pode ser medido em 540 nm. A curva padrão traçando absorbância versus μmoles presente acetil fosfato nos padrões é usado para determinar a quantidade de fosfato acetil remanescentes em cada reação. A curva padrão deve ser linear através do ponto zero. A curva representativa padrão mostrado na Figura 3 tem uma inclinação de 1,2332 unidades de absorbância por apresentar fosfato μmole acetil e um valor de R 2 de 0,99, indicando os dados ajusta a equação linear assim. A equação para o ajuste linear para os dados da curva padrão é usado para calcular a quantidade de fosfato de acetil remanescentes na reação. O μmolesde fosfato de acetil consumida é determinada como a diferença entre o μmoles de fosfato de acetila presentes na reação controle sem enzima e do μmoles de fosfato de acetil remanescente após a reação enzimática.
Purificada, M. recombinante thermophila acetato quinase foi quantificada usando o protocolo descrito. Para o experimento mostrado na Figura 4, a concentração de ADP foi mantida constante em 5 mmol / L ea concentração de fosfato de acetila na reação foi variado para determinar o K m para o fosfato de acetila. Como esperado, este experimento demonstra que a enzima segue padrão de Michaelis-Menten-like cinética para cada substrato e produziu uma curva de saturação hiperbólica ao plotar atividade versus concentração de fosfato de acetila. A aparente K valor m para o fosfato de acetila foi de 0,27 ± 0,01 mmol / L, o que compara favoravelmente com a publicação de valor K m de 0,47 ± 0,01 mmol / L usando o juntamente comodigo 13.
O ensaio direto também pode ser usado para medir a atividade de quinases de acetato que utilizam outros substratos de ATP, o que não é possível usando o ensaio padrão acoplado. Purificada E. recombinante acetato quinase histolytica 16, que produz PP i ao invés de ATP na direção de acetato de formação, foi submetido a este ensaio utilizando fosfato de sódio no lugar de ADP. A concentração de fosfato de sódio na reação foi mantida constante em 0,2 mol / L ea concentração de fosfato de acetil foi variado. Quanto ao M. thermophila acetato quinase, o E. histolytica acetato quinase seguido Michaelis-Menten-like cinética para o fosfato de acetila e uma curva de saturação hiperbólica foi observada (Figura 5). A aparente K valor m para o fosfato de acetila foi de 0,50 ± 0,006 mmol / L. Reeves e Guthrie 15 determinou um valor de K m de 0,06 mmol / L de fosfato para a enzima acetil nativas; como nunca, a sua enzima foi parcialmente purificada e suas ensaio envolveu quatro enzimas de acoplamento que também foram apenas parcialmente purificada. Assim, é difícil comparar diretamente esses valores.
Protocolo Scheme
- Gerar uma curva padrão acetil fosfato
- Enzima para diluir a concentração desejada
- Preparar a reação da mistura e alíquota 300 ml para tubos de microcentrífuga
- Reações Pré-incubação a 37 ° C por 1 minuto
- Iniciar reações adicionando enzima em intervalos de tempo específicos
- Adicionar hidroxilamina com os mesmos intervalos para parar as reações e incubar a 60 ° C por 5 minutos
- Adicionar cloreto férrico / solução de ácido tricloroacético para o desenvolvimento de cor
- Centrifugar a 18.000 xg tubos durante 1 minuto
- Medir a absorvância a 540 nm
- Determinar a quantidade de fosfato de acetil consumida por comparação com a curva padrão
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Figura 1. Scheme Protocolo
Figura 2. Acetyl padrões de fosfato. Concentrações crescentes de fosfato de acetila foram reagiu com hidroxilamina e cor foi desenvolvida como descrito. O controle falta de fosfato de acetila é amarelo brilhante, e as reações contendo quantidades crescentes de fosfato de acetil são sucessivamente de cor mais escura. Esta mudança de cor é medida em 540 nm.
Figura 3. Sample curva padrão acetil fosfato. Diferentes quantidades de fosfato de acetila foram reagiu com hidroxilamina, e a solução de desenvolvimento de cor e absorbância foi medida em 540 nm. A absorvância a 540 nm contra μmoles fosfato de acetil foi plotada e um ajuste linear aos dados foi aplicado. </ P>
Figura 4. Utilização de fosfato de acetil pela M. ATP de produção thermophila quinase acetato. Atividade enzimática foi determinada na direção da formação de acetato na presença de 5 mmol / L ADP com diferentes concentrações de fosfato de acetila. A quantidade de fosfato consumido acetil foi determinada como a diferença entre o montante inicial de fosfato de acetila na reação e da quantidade de fosfato de acetil remanescente após a reação enzimática. Os ensaios foram realizados em triplicata com barras de erro mostrada.
Figura 5. Utilização de fosfato de acetil pelo PP i-produzindo E. histolytica quinase acetato. Atividade enzimática na direção da formação de acetato foi determinada na presença de 0.Fosfato de sódio 2 mol / L com diferentes concentrações de fosfato de acetila. A quantidade de fosfato consumido acetil foi determinada como a diferença entre o montante inicial de fosfato de acetila na reação e da quantidade de fosfato de acetil remanescente após a reação enzimática. Os ensaios foram realizados em triplicata com barras de erro mostrada.
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Discussion
A detecção de fosfato de acetil neste ensaio é dependente de uma concentração suficiente de cloridrato de hidroxilamina, e da concentração e da acidez da solução de cloreto férrico. Alteração do volume de ensaio requer a reconsideração de ambos os componentes. As reações enzimáticas descritas aqui foram realizados a 37 ° C com o término hidroxilamina realizada a 60 ° C por 5 minutos. Esta temperatura mais elevada é fundamental para permitir a rápida conversão do fosfato restantes acetil para hidroxamato acetil. O momento da etapa de desenvolvimento de cor e medição de absorbância é menos crítico, e pode ser realizada em menos de cinco minutos e até 15 minutos após a adição da solução de hidroxilamina. As amostras devem ser centrifugadas antes de ler a absorbância, como a acidez da amostra pode levar à precipitação da enzima e pode produzir uma leitura falsamente elevada devido à turbidez, em vez de mudar de cor real.Composição das reações desenvolvidas começará a ocorrer depois de 10-15 minutos.
As principais complicações desse ensaio de análise cinética enzimática são a determinação da quantidade de enzima de usar e o período de tempo para executar a primeira etapa da reação. Estes devem ser determinadas empiricamente para cada enzima, que o nível de atividade não é tão alto que todo o substrato fosfato de acetila é consumido. Atenção especial deve ser dada ao consumo de fosfato por cento acetil para cada ponto de reação em uma curva cinética. Geralmente, as concentrações mais baixas do componente variados em uma curva cinética deve resultar em consumo de fosfato de acetil até 90 por cento ou ligeiramente acima, enquanto o consumo de fosfato de acetila em concentrações de substrato saturando deve aproximar 10 por cento ou um pouco menos. Uma vez que a concentração da enzima é otimizado, o intervalo de substrato para a determinação de constantes cinéticas pode então ser determinada.
Previous métodos para medir a atividade quinase de acetato na direção de acetato de formação envolveu o uso de ensaios acoplado. Estes métodos são problemáticos em relação ao cálculo cinética devido à dependência da atividade da enzima de acoplamento (s), cujo ensaio de condições (pH, força iônica, temperatura, etc) podem ser incompatíveis com as condições de ensaio ideal para a enzima de interesse . Além disso, o uso de um ensaio de diretos para estudos com inibidores podem evitar problemas que podem surgir da inibição das enzimas de acoplamento. Globalmente, este ensaio deve ser útil não só para acetato quinase, mas para qualquer enzima que utiliza fosfato acetil ou outros substratos de cadeia curta ativado acila tais como acetil-CoA ou propionil-, fosfato de propionil e acetil-AMP, todos os quais são reativos com hidroxilamina. Nestes casos, a curva padrão seria gerado com o substrato adequado em vez de acila com fosfato de acetila.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela NSF prêmio # 0920274 e Carolina do Sul Experiment Station Project (SC-1700340) para KSS. Este artigo é Não. Contribuição Técnica 5929 da Estação Experimental de Clemson University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetyl phosphate | Sigma-Aldrich | 01409 | Lithium Salt (97% ) |
| Sodium phosphate monobasic (dehydrate) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S381 | |
| Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S374 | |
| Magnesium chloride (hexahydrate) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | M33 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific, Inc. | B152 | |
| Ferric chloride (hexahydrate) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | I88 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A324 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Thermo Fisher Scientific, Inc. | H330 | |
Adenosine 5’-diphosphate sodium salt |
Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Biomate III Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 142982082 | Standard UV/Vis spectrophotometer |
References
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A. An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A. Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: the hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases. Protein Sci. 2, 31-40 (1993).
- Buss, K. A. Urkinase: structure of acetate kinase, a member of the ASKHA superfamily of phosphotransferases. J. Bacteriol. 183, 680-686 (2001).
- Hurley, J. H. The sugar kinase/heat shock protein 70/actin superfamily: implications of conserved structure for mechanism. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25, 137-162 (1996).
- Holmes, K. C., Sander, C., Valencia, A. A new ATP-binding fold in actin, hexokinase and Hsc70. Trends. Cell. Biol. 3, 53-59 (1993).
- Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. Acetate kinase: not just a bacterial enzyme. Trends. Microbiol. 14, 249-253 (2006).
- Aceti, D. J., Ferry, J. G. Purification and characterization of acetate kinase from acetate-grown Methanosarcina thermophila. Evidence for regulation of synthesis. J. Biol. Chem. 263, 15444-15448 (1988).
- Latimer, M. T., Ferry, J. G. Cloning, sequence analysis, and hyperexpression of the genes encoding phosphotransacetylase and acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Bacteriol. 175, 6822-6829 (1993).
- Ingram-Smith, C., Barber, R. D., Ferry, J. G. The role of histidines in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 275, 33765-33770 (2000).
- Miles, R. D., Iyer, P. P., Ferry, J. G. Site-directed mutational analysis of active site residues in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 276, 45059-45064 (2001).
- Miles, R. D., Gorrell, A., Ferry, J. G. Evidence for a transition state analog, MgADP-aluminum fluoride-acetate, in acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 277, 22547-22552 (2002).
- Ingram-Smith, C. Characterization of the acetate binding pocket in the Methanosarcina thermophila acetate kinase. J. Bacteriol. 187, 2386-2394 (2005).
- Gorrell, A., Lawrence, S. H., Ferry, J. G. Structural and kinetic analyses of arginine residues in the active site of the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 280, 10731-10742 (2005).
- Gorrell, A., Ferry, J. G. Investigation of the Methanosarcina thermophila acetate kinase mechanism by fluorescence quenching. Biochemistry. 46, 14170-14176 (2007).
- Reeves, R. E., Guthrie, J. D. Acetate kinase (pyrophosphate). A fourth pyrophosphate-dependent kinase from Entamoeba histolytica. Biochem. Biophys. Res. Commun. 66, 1389-1395 (1975).
- Fowler, M. L. Kinetic and structural characterization of the novel PPi-dependent acetate kinase from the parasite Entamoeba histolytica. , Forthcoming (2011).
- Lipmann, F.
- Lipmann, F., Tuttle, L. C. A specific micromethod for determination of acyl phosphates. J. Biol. Chem. 159, 21-28 (1945).
- Lipmann, F., Jones, M. E., Black, S., Flynn, R. M.
- Rose, I. A., Grunberg-Manago, M., Korey, S. F., Ochoa, S.
- Allen, S. H., Kellermeyer, R. W., Stjernholm, R. L., Wood, H. G. Purification and properties of enzymes involved in the proponic acid fermentation. Journal of Bacteriology. 87, 171-187 (1964).
- Clarke, P. M., Payton, M. A. An enzymatic assay for acetate in spent bacterial culture supernatants. Anal. Biochem. 130, 402-405 (1983).
- Mukhopadhyay, S., Hasson, M. S., Sanders, D. A. A continuous assay of acetate kinase activity: measurement of inorganic phosphate release generated by hydroxylaminolysis of acetyl phosphate. Bioorg. Chem. 36, 65-69 (2008).
- Nakajima, H., Suzuki, K., Imahori, K. Purification and properties of acetate kinase from Bacillus stearothermophilus. J. Biochem. 84, 193-203 (1978).
