Summary
En metod för bestämning av acetat kinasaktivitet beskrivs. Denna analys använder en direkt reaktion för att bestämma enzymaktiviteten och kinetik för acetat kinas i acetat-bildande riktning med olika fosforylklorid som accepterar. Dessutom kan denna metod användas för testmetoder för andra acetyl fosfat eller Acetyl-CoA använder enzymer.
Abstract
Acetat kinas, en medlem av acetat och socker kinas-HSP70-aktin (ASKHA) enzym superfamiljen 1-5, ansvarar för den reversibla fosforyleringen av acetat till acetyl fosfat använda ATP som substrat. Acetat kinaser finns överallt i bakterier, som finns i ett släkte av arkéerna, och är också närvarande i mikrober i Eukarya 6. Den mest kännetecknas acetat kinas är att från metanbildande archaeon Methanosarcina thermophila 7-14. En acetat kinas som bara kan använda PP-I men inte ATP i acetyl fosfat-bildande riktning har isolerats från Entamoeba histolytica, vilka smittämnen av amöba dysenteri, och har hittills bara hittats i denna genus 15,16.
I riktning mot acetyl fosfat bildas, är acetat kinasaktivitet normalt mätt med hydroxamate analys, som först beskrevs av Lipmann17-20, ett kombinerat test där omvandlingen av ATP till ADP är kopplad till oxidation av NADH till NAD + genom att enzymerna pyruvat kinas och laktatdehydrogenas 21,22 eller ett test som mäter utsläpp av oorganiskt fosfat efter reaktion acetyl fosfat produkt med hydroxylamin 23. Aktiviteten i den motsatta, är acetat-forming riktning mäts med koppling ATP bildas från ADP till en minskning av NADP + till NADPH av enzymer hexokinas och glukos-6-fosfatdehydrogenas 24.
Här beskriver vi en metod för detektion av acetat kinasaktivitet i riktning mot acetat formation som inte kräver koppling enzymer, utan istället bygger på direkt bestämning av acetyl fosfat konsumtion. Efter den enzymatiska reaktionen är kvar acetyl fosfat omvandlas till en järnklorid hydroxamate komplex som kan mätas spektrofotometriskt, som för hydroxamate analysen. Till skillnad från S: tandard tillsammans assay för denna riktning som är beroende av produktionen av ATP från ADP, kan denna direkta analys användas för acetat kinaser som producerar ATP eller PP i.
Protocol
Det övergripande system av det här protokollet beskrivs i figur 1.
1. Beredning av lösningar för Standard Kurvor och analyser
- Bered 100 ml av en 2 mol / l lösning av hydroxylamin-HCl. Väg upp 13,9 g hydroxylamin hydroklorid (MW 69,49 g / mol) och lös upp i cirka 50 ml destillerat-avjoniserat vatten (DDH 2 O). Justera pH till 7,0 med hjälp av kaliumhydroxid pellets eller en koncentrerad lösning. Ta den slutliga volymen till 100 ml. Lösningen kan förvaras i rumstemperatur i upp till 30 dagar eller vid 4 ° C i upp till 90 dagar.
- Bered 100 ml av en järnklorid / saltsyra. Väg upp 13,5 g järnklorid (MW 270,32 g / mol) och lös upp i cirka 50 ml DDH 2 O. Tillsätt 41,3 ml koncentrerad saltsyra (12,1 mol / L) och ta med till en slutlig volym på 100 ml. Den slutliga koncentrationen av järnklorid kommer att bli 0,5 mol / l och den slutliga koncentrationen av saltsyra blir 5 mol/ L. Lösningen förvaras i rumstemperatur.
- Bered 100 ml av en 1,84 mol / l lösning av trichoroacetic syra. Väg upp 30,0 g triklorättiksyra (MW 163,39 g / mol), lös upp i DDH 2 O och föra den slutliga volymen till 100 ml. Lösningen förvaras i rumstemperatur.
- Förbered 5 ml 0,1 mol / L acetyl fosfat lösning. Väg upp 0,092 g acetyl fosfat (MW 184,06 g / mol), lös upp i DDH 2 O och föra den slutliga volymen till 5 ml. Alikvotera lösningen till mikrocentrifugrör (0,25 ml per rör) och frys vid -20 ° C fram till användning. Upptinade lösning bör placeras på is och kan användas i ca 1 timme. Acetyl fosfat lösning som har tinats ska inte frysas om och återanvändas.
- Förbered 5 ml 0,1 mol / l lösning av ADP. Väg upp 0,24 g av ADP (MW 472,5 g / mol), lös upp i DDH 2 O, och föra den slutliga volymen till 5 ml. Alikvotera lösningen i mikrocentrifugrör (0,5 ml per rör) och frys vid -20 ° C framanvändning. Håll tinade lösningen på is tills det ska användas.
- Förbered 50 ml av en 1 mol / l lösning av tris. Väg upp 6,06 g Tris (MW 121,14 g / mol) och lös upp i 40 ml DDH 2 O. Justera lösningens pH till 7,0 med hjälp av saltsyra och föra slutliga volymen till 50 ml. Förvara lösningen i rumstemperatur.
- Förbered 10 ml av en 1 mol / L magnesiumkloridlösning. Väg upp 2,03 g magnesiumklorid (MW 203,31 g / mol), lös upp i DDH 2 O, och föra den slutliga volymen till 10 ml. Förvara lösningen i rumstemperatur.
- Bered 25 ml utveckling genom att blanda lika delar av järnklorid / saltsyra och triklorättiksyrelösning. Utveckling lösning bör beredas på nytt varje dag och förvaras i rumstemperatur.
2. Beredning av ett Acetyl Fosfat standardkurva
- En acetyl fosfat standardkurva genereras med hjälp av kända mängder av acetyl fosfat. En standardkurva sex till EighT poäng är lämplig. Normerna bör variera mellan 0,03 μmoles till 0,9 μmoles per 300 mikroliter, som korrelerar till slutliga koncentrationer på 0,1 till 3 mmol / L. Späd acetyl lösningen fosfat lager till rätt koncentrationer i 100 mM Tris lösning i en slutlig volym på 300 mikroliter. Ett kontrollprov utan acetyl fosfat bör också vara beredd.
- Inkubera varje standard och kontroll vid 37 ° C i ett värmeblock i 1 minut.
- Tillsätt 50 mikroliter av hydroxylamin hydroklorid lösning till varje standard och kontroll och blanda genom att skaka tre gånger. Placera standard i en 60 ° C värmeblock och inkubera i fem minuter.
- Tillsätt 100 mikroliter av utveckling lösning på normer och kontroll, blanda genom att skaka tre gånger, och låt färgen utvecklas under minst en minut vid rumstemperatur.
- Centrifugera alla normer och kontroll i mikrocentrifug på 18.000 xg i 1 minut.
- Mät prover spektrofotometriskt enT 540 nm med 1 mL plast kyvetter, med hjälp av kontroll som tomt för spektrofotometri.
- Generera en standardkurva med hjälp av lämpliga analys av data och diagram programvara (t ex Kaleidagraph, Synergy Software). R 2 värden på 0,99 eller mer är önskvärt. Uppgifterna är inritad som absorbans vid 540 nm gentemot μmoles av acetyl fosfat närvarande.
3. Assay för Acetat kinasaktivitet
- Med hjälp av beskrivna lösningar, förbereda en reaktionsblandning innehåller en slutlig koncentration av 0,1 mol / L Tris-buffert, 10 mmol / L magnesiumklorid, 5 mmol / L ADP och 2 mmol / L acetyl fosfat. En 10 ml reaktionsblandningen kommer att kräva 8,2 ml DDH 2 O, 1,0 ml Tris-lösning, 0,1 ml magnesiumkloridlösning, 0,5 ml ADP lösning och 0,2 ml acetyl fosfat lösning. Fördela reaktionsblandningen i 300 l prov till mikrocentrifugrör. För bestämning av kinetiska parametrar och optimering av substrat koncentrationer kan man substratetvarierad och den andra hålls på en konstant koncentration i reaktionerna.
- Pre-inkubera de reaktioner i 1 minut vid 37 ° C i ett värmeblock.
- Lägg till en önskad mängd enzym att reaktionen och omedelbart återvända röret till 37 ° C värme block. Också innehålla en kontroll reaktion som ingen enzym tillsätts. Om flera reaktioner sker, tillsätt enzym till rören med bestämda tidsintervall. Var noga med att hålla reda på tiden. (OBS: den mängd enzym som ska användas måste optimeras för att säkerställa att alla acetyl fosfat eller ADP underlaget inte kommer att vara uttömda - se Diskussion avsnitt)
- Efter 5 minuter, tillsätt 50μl av hydroxylamin hydroklorid lösning till varje reaktion och kontroll, blanda och placera rören i ett 60 ° C värme block. Om flera reaktioner utförs, bör detta ske på samma tidsintervall som enzymet tillsattes.
- Inkubera reaktioner och kontroll i 5 minuter vid 60 ° C.
- Lägg till 100 &mu, L i utvecklingen lösning till varje reaktion och kontroll, blanda, och lägg i en provrörsställ på lab bänk. Låt färgen utvecklas i minst 1 minut.
- Centrifugera alla rör i en mikrocentrifug på 18.000 xg i 1 minut.
- Mät prover spektrofotometriskt vid 540 nm med 1 mL plast kyvetter och fastställa beloppet av acetyl fosfat närvarande i jämförelse med acetyl fosfat standardkurvan.
- Mängden acetyl utarmat fosfat substrat kan bestämmas genom att subtrahera summan av acetyl fosfat kvar efter den enzymatiska reaktionen från det belopp av acetyl fosfat som finns i kontrollen saknar enzymet. Utföra analys av data med hjälp av lämpliga uppgifter och grafer programvara (t ex Kaleidagraph, Synergy Software). R 2-värden som är större än 0,97 är önskvärda.
4. Representativa resultat:
Syftet med denna analys är att mäta aktiviteten acetat kinas i direktion av acetat bildas. Detta görs genom att mäta förbrukningen av acetyl fosfat substrat, eftersom det inte är lätt, direkt mätning på acetat produktion. Acetyl fosfat kvar efter en viss tid under den enzymatiska reaktionen omvandlas till acetyl hydroxamate och därefter till järnklorid hydroxamate komplex, som har en rödaktig färg (figur 2) som kan mätas vid 540 nm. Standardkurvan plotta absorbansen kontra μmoles acetyl fosfat som finns i de standarder används för att bestämma mängden acetyl fosfat kvar i varje reaktion. Standardkurvan skall vara linjär genom nollpunkten. En representant standardkurva visas i figur 3 har en lutning på 1,2332 absorbans enheter per μmole acetyl fosfat närvarande och ett R 2 värde på 0,99, som visar data passar den linjära ekvationen bra. Ekvationen för den linjära passar till standardkurvan data används för att beräkna mängden av acetyl fosfat kvar i reaktionen. Den μmolesav acetyl konsumeras fosfat bestäms som skillnaden mellan μmoles av acetyl fosfat närvarande i kontrollrummet reaktionen saknar enzymet och μmoles av acetyl fosfat kvar efter den enzymatiska reaktionen.
Renad, rekombinant M. thermophila acetat kinas var analyseras med hjälp av den beskrivna protokollet. För experimentet visas i figur 4, var koncentrationen av ADP hålls konstant på 5 mmol / l och koncentrationen av acetyl fosfat i reaktionen varierades för att bestämma K m för acetyl fosfat. Som väntat visar detta experiment att enzymet följer standarden Michaelis-Menten-liknande kinetik för varje substrat och producerade en hyperbolisk mättnad kurvan när rita aktivitet kontra acetyl fosfat. Den skenbara K M-värdet acetyl fosfat var 0,27 ± 0,01 mmol / L, som med fördel jämföras med den publicerade K m värde av 0,47 ± 0,01 mmol / L med den kopplade somsäger 13.
Den direkta analysen kan också användas för att mäta aktiviteten av acetat kinaser som utnyttjar andra substrat än ATP, vilket inte är möjligt med användning av standarden kopplade analysen. Renat rekombinant E. histolytica acetat kinas 16, som producerar PP i stället för ATP i acetat-bildande riktning, utsattes för denna analys med hjälp av natriumfosfat i stället för ADP. Koncentrationen av natriumfosfat i reaktionen hölls oförändrad på 0,2 mol / L och acetyl fosfatkoncentrationen var varierande. När det gäller M. thermophila acetat kinas, E. histolytica acetat kinas följt Michaelis-Menten-liknande kinetik för acetyl fosfat och en hyperbolisk mättnad kurva observerades (Figur 5). Den skenbara K M-värdet acetyl fosfat var 0,50 ± 0,006 mmol / L. Reeves och Guthrie 15 fastställt ett K m värde av 0,06 mmol / L för acetyl fosfat för infödda enzymet, hur någonsin, var deras enzym endast delvis renat och deras test involverade fyra koppling enzymer som också var endast delvis renat. Därför är det svårt att direkt jämföra dessa värden.
Protokoll Scheme
- Generera en acetyl kurva fosfat standard
- Späd enzym till önskad koncentration
- Förbered reaktionsblandningen och alikvot 300 l till mikrocentrifugrör
- Preincubate reaktioner vid 37 ° C under 1 minut
- Starta reaktioner genom att lägga till enzymet med bestämda tidsintervall
- Lägg hydroxylamin med samma intervall för att stoppa reaktioner och inkubera vid 60 ° C i 5 minuter
- Lägg järnklorid / triklorättiksyrelösning för färg utveckling
- Centrifugrör på 18.000 xg under 1 minut
- Mät absorbansen vid 540 nm
- Bestäm mängden acetyl konsumeras fosfat i jämförelse med standardkurvan
tp_upload/3474/3474fig1.jpg "/>
Figur 1. Protokoll Scheme
Figur 2. Acetyl fosfat standarder. Ökande halter av acetyl fosfat reagerat med hydroxylamin och färg utvecklades enligt beskrivning. Kontrollen saknar acetyl fosfat är ljust gul och reaktioner med ökande mängder acetyl fosfat successivt mörkare i färgen. Denna färgförändring mäts vid 540 nm.
Figur 3. Sample acetyl fosfat standardkurvan. Varierande mängder av acetyl fosfat reagerat med hydroxylamin samt färgutvecklingen lösning och absorbansen mättes vid 540 nm. Absorbansen vid 540 nm gentemot μmoles acetyl fosfat var plottade och en linjär passar till data tillämpades. </ P>
Figur 4. Utnyttjande av acetyl fosfat via ATP-producerande M. thermophila acetat kinase. Enzymatisk aktivitet avgjordes i riktning mot acetat bildas i närvaro av 5 mmol / L ADP med olika koncentrationer av acetyl fosfat. Mängden acetyl fosfat som konsumeras bestämdes som skillnaden mellan grundbeloppet för acetyl fosfat i reaktionen och mängden acetyl fosfat kvar efter den enzymatiska reaktionen. Analyser utfördes i tre exemplar med fel visas staplar.
Figur 5. Utnyttjande av acetyl fosfat via PP i-producerande E. histolytica acetat kinase. Enzymaktivitet i riktning mot acetat bildning avgjordes i närvaro av 0.2 mol / l natrium fosfat med olika koncentrationer av acetyl fosfat. Mängden acetyl fosfat som konsumeras bestämdes som skillnaden mellan grundbeloppet för acetyl fosfat i reaktionen och mängden acetyl fosfat kvar efter den enzymatiska reaktionen. Analyser utfördes i tre exemplar med fel visas staplar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Upptäckten av acetyl fosfat i denna analys är beroende av en tillräcklig koncentration av hydroxylamin hydroklorid och koncentration och syra av järnklorid lösningen. Ändring av analysen volymen kommer att kräva omprövning av båda dessa komponenter. Den enzymatiska reaktioner som beskrivs här utfördes vid 37 ° C med hydroxylamin uppsägning utföras vid 60 ° C i 5 minuter. Denna högre temperatur är avgörande för att möjliggöra snabb omställning av de återstående acetyl fosfat till acetyl hydroxamate. Tidpunkten för färgutvecklingen steget och mätning av absorbans är mindre kritisk, och kan utföras på så lite som 5 minuter och upp till 15 minuter efter tillägg av hydroxylamin lösningen. Proverna skall centrifugeras innan du läser absorbans, eftersom surheten av provet kan leda till utfällning av enzymet och kan producera ett falskt högt värde på grund av grumlighet snarare än faktiska färgförändring.Fördelning av de utvecklade reaktioner börjar uppstå efter 10-15 minuter.
De primära komplikationerna vid detta test för att pröva enzymkinetik är bestämning av den mängd enzym att använda och hur lång tid att köra det första steget av reaktionen. Dessa måste bestämmas empiriskt för varje enzym så att nivån på verksamheten är inte så högt att alla acetyl fosfat substrat konsumeras. Noggrann uppmärksamhet bör ägnas åt procent acetyl fosfat förbrukningen för varje reaktion punkt i en kinetisk kurva. Generellt bör sänka koncentrationerna av de olika komponent på en kinetisk kurva resulterar i acetyl fosfat förbrukning upp till 90 procent eller något över, medan konsumtionen av acetyl fosfat vid koncentrationer som mättar underlaget ska förhålla 10 procent eller något mindre. När enzymet koncentrationen är optimerad, kan substratet intervallet för bestämning av kinetiska konstanter bestäms sedan.
Pöregående metoder för att mäta aktiviteten acetat kinas i acetat-bildande riktning inblandade användningen av kopplade analyser. Dessa metoder är problematiska med avseende på kinetiska beräkningar på grund av beroendet av aktiviteten av kopplingen enzym (s), vars analys förhållanden (pH, jonstyrka, temperatur osv) kan vara oförenligt med den optimala analysen villkoren för enzymet av intresse . Dessutom kan användning av en direkt analys av studier med hämmare undvika problem som kan uppstå hämning av kopplingen enzymer. Sammantaget bör detta test vara till nytta inte bara för acetat kinas, men för något enzym som använder acetyl fosfat eller andra aktiverade kort kedja substrat acyl som acetyl-eller propionyl-CoA, propionyl fosfat, och acetyl-AMP, som alla är reaktiva med hydroxylamin. I dessa fall skulle standardkurvan genereras med lämpligt acyl substrat istället för med acetyl fosfat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NSF utmärkelse # 0920274 och South Carolina Experiment Station Project (SC-1.700.340) till KSS. Detta papper är tekniskt bidrag nr 5929 i Clemson University Experiment Station.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetyl phosphate | Sigma-Aldrich | 01409 | Lithium Salt (97% ) |
| Sodium phosphate monobasic (dehydrate) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S381 | |
| Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S374 | |
| Magnesium chloride (hexahydrate) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | M33 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific, Inc. | B152 | |
| Ferric chloride (hexahydrate) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | I88 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A324 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Thermo Fisher Scientific, Inc. | H330 | |
Adenosine 5’-diphosphate sodium salt |
Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Biomate III Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 142982082 | Standard UV/Vis spectrophotometer |
References
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A. An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A. Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: the hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases. Protein Sci. 2, 31-40 (1993).
- Buss, K. A. Urkinase: structure of acetate kinase, a member of the ASKHA superfamily of phosphotransferases. J. Bacteriol. 183, 680-686 (2001).
- Hurley, J. H. The sugar kinase/heat shock protein 70/actin superfamily: implications of conserved structure for mechanism. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25, 137-162 (1996).
- Holmes, K. C., Sander, C., Valencia, A. A new ATP-binding fold in actin, hexokinase and Hsc70. Trends. Cell. Biol. 3, 53-59 (1993).
- Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. Acetate kinase: not just a bacterial enzyme. Trends. Microbiol. 14, 249-253 (2006).
- Aceti, D. J., Ferry, J. G. Purification and characterization of acetate kinase from acetate-grown Methanosarcina thermophila. Evidence for regulation of synthesis. J. Biol. Chem. 263, 15444-15448 (1988).
- Latimer, M. T., Ferry, J. G. Cloning, sequence analysis, and hyperexpression of the genes encoding phosphotransacetylase and acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Bacteriol. 175, 6822-6829 (1993).
- Ingram-Smith, C., Barber, R. D., Ferry, J. G. The role of histidines in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 275, 33765-33770 (2000).
- Miles, R. D., Iyer, P. P., Ferry, J. G. Site-directed mutational analysis of active site residues in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 276, 45059-45064 (2001).
- Miles, R. D., Gorrell, A., Ferry, J. G. Evidence for a transition state analog, MgADP-aluminum fluoride-acetate, in acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 277, 22547-22552 (2002).
- Ingram-Smith, C. Characterization of the acetate binding pocket in the Methanosarcina thermophila acetate kinase. J. Bacteriol. 187, 2386-2394 (2005).
- Gorrell, A., Lawrence, S. H., Ferry, J. G. Structural and kinetic analyses of arginine residues in the active site of the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 280, 10731-10742 (2005).
- Gorrell, A., Ferry, J. G. Investigation of the Methanosarcina thermophila acetate kinase mechanism by fluorescence quenching. Biochemistry. 46, 14170-14176 (2007).
- Reeves, R. E., Guthrie, J. D. Acetate kinase (pyrophosphate). A fourth pyrophosphate-dependent kinase from Entamoeba histolytica. Biochem. Biophys. Res. Commun. 66, 1389-1395 (1975).
- Fowler, M. L. Kinetic and structural characterization of the novel PPi-dependent acetate kinase from the parasite Entamoeba histolytica. , Forthcoming (2011).
- Lipmann, F.
- Lipmann, F., Tuttle, L. C. A specific micromethod for determination of acyl phosphates. J. Biol. Chem. 159, 21-28 (1945).
- Lipmann, F., Jones, M. E., Black, S., Flynn, R. M.
- Rose, I. A., Grunberg-Manago, M., Korey, S. F., Ochoa, S.
- Allen, S. H., Kellermeyer, R. W., Stjernholm, R. L., Wood, H. G. Purification and properties of enzymes involved in the proponic acid fermentation. Journal of Bacteriology. 87, 171-187 (1964).
- Clarke, P. M., Payton, M. A. An enzymatic assay for acetate in spent bacterial culture supernatants. Anal. Biochem. 130, 402-405 (1983).
- Mukhopadhyay, S., Hasson, M. S., Sanders, D. A. A continuous assay of acetate kinase activity: measurement of inorganic phosphate release generated by hydroxylaminolysis of acetyl phosphate. Bioorg. Chem. 36, 65-69 (2008).
- Nakajima, H., Suzuki, K., Imahori, K. Purification and properties of acetate kinase from Bacillus stearothermophilus. J. Biochem. 84, 193-203 (1978).
