Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الكشف عن مباشرة النشاط خلات تشكيل لأنزيم كيناز خلات

Published: December 19, 2011 doi: 10.3791/3474
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Genetics and Biochemistry, Clemson University

Summary

يوصف أسلوب لتحديد النشاط كيناز خلات. هذا الاختبار يستخدم لتحديد رد الفعل المباشر لنشاط إنزيم وحركية كيناز خلات في اتجاه تشكيل خلات مع يقبلون فسفوريل مختلفة. وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة لمعايرة الفوسفات الاسيتيل أخرى أو أسيتيل التميم استخدام الانزيمات.

Abstract

كيناز خلات ، عضوا في لخلات والسكر كيناز - Hsp70 - الأكتين فوق الفصيلة انزيم (ASKHA) 1-5 ، هو المسؤول عن الفسفرة عكسها من خلات لاستغلال الفوسفات ATP الاسيتيل باعتبارها الركيزة. كاينيسات خلات موجودة في كل مكان في البكتيريا وجدت في أحد من جنس الأركيا ، وموجودة أيضا في الميكروبات من حقيقيات النوى 6. وتتميز معظم كيناز خلات جيدا هو أن من thermophila المنتجة للغاز الميثان Methanosarcina archaeon 7-14. وقد تم عزل وكيناز خلات التي تستطيع الاستفادة منها فقط PP ط ولكن ليس للاعبي التنس المحترفين في اتجاه تشكيل الاسيتيل الفوسفات من نسج المتحولة ، والعامل المسبب للمرض الزحار الأميبي ، وحتى الآن فقط تم العثور على 15،16 في هذا جنس.

في اتجاه تشكيل الفوسفات الاسيتيل ، ويقاس عادة خلات النشاط كيناز باستخدام مقايسة hydroxamate ، وصف لأول مرة من قبل Lipmann17-20 ، ومقايسة يقترن التي يقترن تحويل ATP إلى ADP للأكسدة NADH إلى NAD + من كيناز البيروفات الانزيمات واللاكتات نازعة 21،22 ، أو فحص قياس الافراج عن الفوسفات غير العضوية بعد رد فعل للمنتج الفوسفات الاسيتيل مع هيدروكسيل 23. النشاط في المقابل ، يقاس خلات تشكيل الاتجاه اقتران تشكيل ATP من ADP في الحد من NADP + إلى NADPH من هيكسوكيناز الانزيمات والجلوكوز 6 فوسفات نازعة 24.

نحن هنا وصف طريقة للكشف عن النشاط كيناز خلات في اتجاه تشكيل خلات التي لا تتطلب اقتران الانزيمات ، ولكن بدلا من ذلك على ويستند تقرير المباشر للاستهلاك الفوسفات الاسيتيل. بعد رد الفعل الأنزيمية ، يتم تحويل الفوسفات الاسيتيل المتبقية لمجمع الحديد hydroxamate التي يمكن قياسها spectrophotometrically ، أما بالنسبة للمقايسة hydroxamate. وهكذا ، خلافا للشارعandard مقايسة بالإضافة لهذا الاتجاه الذي يعتمد على إنتاج ATP من ADP ، ويمكن استخدام هذا الاختبار المباشر لتحركات خلات التي تنتج ATP أو PP ط.

Protocol

ويبين المخطط العام لهذا البروتوكول في الشكل 1.

1. تحضير محلول قياسي المنحنيات وفحوصات

  1. تحضير 100 مل من محلول مول / لتر 2 من هيدروكسيل ، حمض الهيدروكلوريك. خارج تزن 13.9 غرام من هيدروكلوريد هيدروكسيل (MW 69.49 غرام / مول) ، وتذوب في الماء المقطر حوالي 50 مل ، منزوع الأيونات (DDH 2 O). ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 باستخدام كريات هيدروكسيد البوتاسيوم أو محلول المركزة. جلب الحجم النهائي إلى 100 مل. ويمكن تخزين الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 30 يوما أو عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 90 يوما.
  2. تحضير 100 مل من كلوريد الحديديك / الهيدروكلوريك حمض الحل. تزن 13.5 غرام من كلوريد الحديديك (MW 270.32 جم / مول) ، وتذوب في ما يقرب من 50 مل O. 2 DDH إضافة 41.3 حمض الهيدروكلوريك تتركز مل (12.1 مول / لتر) وجلب إلى الحجم النهائي 100 مل. وسوف تركز النهائي من كلوريد الحديديك تكون 0،5 مول / لتر وتركيز حمض الهيدروكلوريك النهائي سيكون 5 مول/ لتر. يتم تخزين الحل في درجة حرارة الغرفة.
  3. تحضير 100 مل من محلول مول / لتر من حمض 1.84 trichoroacetic. خارج تزن 30.0 غرام من حمض التريكلوروسيتيك حمض (MW 163.39 جم / مول) ، ويحل في DDH 2 O وجلب الحجم النهائي إلى 100 ​​مل. يتم تخزين الحل في درجة حرارة الغرفة.
  4. إعداد 5 مل من 0،1 مول / لتر الحل الفوسفات الاسيتيل. خارج تزن 0،092 ز الفوسفات أسيتيل (MW 184.06 جم / مول) ، ويحل في DDH 2 O وجلب الحجم النهائي إلى 5 مل. قسامة الحل لأنابيب microcentrifuge (0.25 مل في أنبوب) وتجميد -20 درجة مئوية في حين الاستخدام. يجب وضع حل على إذابة الجليد ، ويمكن استخدامها لحوالي 1 ساعة. وينبغي حل الاسيتيل الفوسفات التي تم إذابة لا refrozen وإعادة استخدامها.
  5. إعداد 5 مل من محلول مول / لتر 0.1 ADP. خارج تزن 0،24 غرام من ADP (472.5 ميغاواط ز / مول) ، ويحل في DDH 2 O ، وجلب الحجم النهائي إلى 5 مل. قسامة الحل في أنابيب microcentrifuge (0.5 مل في أنبوب) في وتجميد حتى -20 درجة مئويةالاستخدام. يبقي الحل إذابة الجليد حتى في استخدامه.
  6. تجهيز 50 مل من محلول مول / لتر 1 من تريس. تزن 6،06 غرام من تريس (MW 121.14 جم / مول) ، وتذوب في 40 مل O. 2 DDH ضبط درجة الحموضة من الحل إلى 7.0 باستخدام حمض الهيدروكلوريك وجلب الحجم النهائي إلى 50 مل. حل تخزين في درجة حرارة الغرفة.
  7. تحضير 10 مل من (أ) 1 مول / لتر محلول كلوريد المغنيسيوم. خارج تزن 2.03 كلوريد المغنيسيوم ز (MW 203.31 جم / مول) ، ويحل في DDH 2 O ، وجلب الحجم النهائي إلى 10 مل. حل تخزين في درجة حرارة الغرفة.
  8. تحضير 25 مل من محلول التنمية عن طريق خلط كميات متساوية من حمض كلوريد الحديديك الحل / الهيدروكلوريك وحمض حمض التريكلوروسيتيك الحل. وينبغي أن تكون على استعداد حل تطورا جديدا في كل يوم وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.

2. إعداد منحنى قياسي الفوسفات أسيتيل

  1. يتم إنشاء معيار الفوسفات الاسيتيل منحنى باستخدام كميات معروفة من الفوسفات الاسيتيل. منحنى قياسي من ستة الى eighر نقاط مناسبة. ينبغي لمعايير تتراوح من 0.03 إلى 0.9 μmoles μmoles لكل 300 ميليلتر ، التي ترتبط لتركيزات النهائي 0،1-3 ملمول / لتر. المخفف للسهم الفوسفات الاسيتيل حل لتركيزات مناسبة في 100 ملي حل تريس في الحجم النهائي من 300 ميكروليتر. وينبغي أيضا عينة السيطرة دون الفوسفات الاسيتيل تكون مستعدة.
  2. احتضان كل معيار والسيطرة على 37 درجة مئوية في كتلة الحرارة لمدة 1 دقيقة.
  3. إضافة 50 ميكرولتر من الحل هيدروكلوريد هيدروكسيل على كل المعايير والسيطرة والمزيج عن طريق هز ثلاث مرات. وضع معيار في كتلة الحرارة 60 ° C واحتضان لمدة خمس دقائق.
  4. إضافة 100 ميكروليتر من محلول التنمية للمعايير ومراقبة ، ومزيج من قبل المصافحة ثلاث مرات ، والسماح للون لتطوير ما لا يقل عن دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  5. الطرد المركزي بكل المقاييس وضبط في microcentrifuge في 18000 x ج لمدة 1 دقيقة.
  6. قياس عينات spectrophotometrically aر 540 نانومتر باستخدام 1mL cuvettes البلاستيك ، وذلك باستخدام التحكم كما الفارغة لقياس الطيف الضوئي.
  7. إنشاء منحنى قياسي باستخدام المناسبة وتحليل البيانات والرسوم البيانية البرمجيات (مثل برامج Kaleidagraph التآزر ،). R 2 قيم 0.99 أو أكبر من المرغوب فيه. يتم رسم البيانات كما الامتصاصية في 540 نانومتر مقابل μmoles الحاضر الفوسفات الاسيتيل.

3. مقايسة للنشاط كيناز خلات

  1. باستخدام حلول وصفها ، إعداد مزيج التفاعل التي تحتوي على تركيز النهائي من 0.1 العازلة تريس مول / لتر ، و 10 ملمول / لتر كلوريد المغنيسيوم ، 5 ملمول / لتر ADP ، و 2 ملمول / لتر الفوسفات الاسيتيل. وهناك رد فعل 10 مل 8.2 مل مزيج تتطلب DDH 2 O ، 1.0 حل تريس مل و 0.1 مل من محلول كلوريد المغنيسيوم ، و 0.5 حل ADP مل ، و 0.2 مل من محلول فوسفات الاسيتيل. توزيع خليط التفاعل في aliquots 300 ميكروليتر إلى الأنابيب microcentrifuge. لتحديد معالم الحركية والاستفادة المثلى من تركيزات الركيزة ، يمكن للمرء أن يكون الركيزةتباينت والآخر الذي عقد في التركيز المستمر في ردود الفعل.
  2. قبل احتضان ردود الفعل ل 1 دقيقة عند 37 درجة مئوية في كتلة الحرارة.
  3. إضافة المبلغ المطلوب من الانزيم الى رد الفعل والعودة على الفور الأنبوب إلى كتلة الحرارة ° 37 مئوية. كما تشمل مراقبة ردود الفعل التي لم يتم إضافة الانزيم. إذا تم تنفيذ العديد من ردود الفعل ، إضافة إلى أنابيب الانزيم في فترات زمنية محددة. تأكد لتعقب من الوقت. (ملاحظة : إن كمية الانزيم لاستخدامها تحتاج إلى أن يكون الأمثل لضمان أن ليس كل من الفوسفات الاسيتيل أو تكون الركيزة ADP المنضب -- انظر القسم مناقشة)
  4. بعد 5 دقائق ، إضافة 50μl من الحل هيدروكلوريد هيدروكسيل على كل رد فعل والسيطرة على المزيج ، ووضع أنابيب في كتلة الحرارة 60 درجة مئوية. إذا كان يتم تنفيذ العديد من ردود الفعل ، ينبغي أن يتم ذلك في الفترة الزمنية نفسها التي تم إضافة الانزيم.
  5. احتضان ردود الفعل والسيطرة عليها لمدة 5 دقائق عند 60 درجة مئوية.
  6. إضافة 100 &مو ؛ L من حل كل رد فعل لتطوير ومراقبة المزيج ، والمكان في رفوف أنبوب المختبر على مقاعد البدلاء. تسمح اللون لتطوير ما لا يقل عن 1 دقيقة.
  7. جميع أنابيب الطرد المركزي في microcentrifuge في 18000 x ج لمدة 1 دقيقة.
  8. قياس عينات spectrophotometrically بمبلغ 540 نانومتر باستخدام cuvettes 1mL البلاستيك وتحديد كمية الفوسفات الاسيتيل الحالي مقارنة للمنحنى الفوسفات القياسية الاسيتيل.
  9. يمكن تحديد كمية الفوسفات الركيزة الاسيتيل المنضب عن طريق طرح المبلغ المتبقي من الفوسفات الاسيتيل بعد رد الفعل الأنزيمية من كمية الفوسفات الاسيتيل موجودة في الانزيم تفتقر السيطرة. إجراء تحليل البيانات باستخدام بيانات الرسوم البيانية والبرمجيات المناسبة (على سبيل المثال برامج Kaleidagraph التآزر ،). R 2 قيم أكبر من 0.97 ومرغوب فيه.

4. ممثل النتائج :

الغرض من هذا الاختبار هو قياس النشاط كيناز خلات في المباشرةايون تشكيل خلات. يتم ذلك من خلال قياس استهلاك الركيزة الفوسفات الاسيتيل ، حيث لا يوجد سهل ، والقياس المباشر لإنتاج خلات. يتم تحويل الفوسفات الاسيتيل المتبقية بعد وقت معين أثناء عملية التفاعل الأنزيمي إلى hydroxamate الاسيتيل وبعد ذلك إلى مجمع hydroxamate الحديديك ، والتي لها لون ضارب الى الحمرة (الشكل 2) التي يمكن قياسها في 540 نانومتر. يستخدم المنحنى القياسي الحالي مقابل رسم الامتصاصية μmoles الفوسفات الاسيتيل في المعايير لتحديد كمية من الفوسفات الاسيتيل المتبقية في كل رد فعل. ينبغي أن يكون المعيار منحنى خطي من خلال نقطة الصفر. منحنى ممثل القياسية هو موضح في الشكل 3 وحدات من منحدر الامتصاصية 1.2332 في μmole الحاضر الفوسفات الاسيتيل و2 R قيمة 0.99 ، مما يدل على البيانات الخطية يناسب المعادلة جيدا. وتستخدم هذه المعادلة لصالح الخطي لبيانات منحنى القياسية لحساب كمية من الفوسفات الاسيتيل المتبقية في رد الفعل. وμmolesمن الفوسفات المستهلكة الاسيتيل يتحدد على أساس الفرق بين μmoles الاسيتيل من الفوسفات الموجودة في رد فعل السيطرة وتفتقر إلى إنزيم μmoles من الفوسفات الاسيتيل المتبقية بعد رد الفعل الأنزيمية.

المنقى ، M. المؤتلف وكان يعاير thermophila كيناز خلات باستخدام بروتوكول صفها. عن هذه التجربة هو مبين في الشكل (4) ، عقد تركيز ADP ثابتة عند 5 ملمول / لتر وتركيز متنوعة من الفوسفات الاسيتيل في رد فعل لتحديد م K للفوسفات الاسيتيل. كما هو متوقع ، هذه التجربة يدل على أن يلي انزيم القياسية - ميكايليس Menten مثل حركية لكل ركيزة وأنتجت منحنى الإشباع القطعي عندما يخططون النشاط مقابل تركيز الفوسفات الاسيتيل. وكان الظاهر قيمة م K للفوسفات الاسيتيل 0.27 ± 0.01 مليمول / لتر ، والذي يقارن ايجابيا على القيمة المنشورة م ك من 0.47 ± 0.01 مليمول / لتر باستخدام بالإضافة إلىويقول 13.

يمكن أيضا فحص مباشرة يمكن استخدامها لقياس نشاط كاينيسات خلات التي تستخدم ركائز أخرى من ATP ، والتي ليس من الممكن استخدام معايرة جانب. تنقية E. المؤتلف تعرض نسج كيناز خلات 16 ، التي تنتج PP ط بدلا من ATP في الاتجاه خلات تشكيل لهذا الاختبار باستخدام فوسفات الصوديوم في مكان ADP. عقدت تركيز فوسفات الصوديوم في التفاعل ثابتة عند 0.2 مول / لتر وتركيز الفوسفات تباينت الاسيتيل. أما بالنسبة للM. thermophila كيناز أسيتات ، وهاء ثم نسج كيناز خلات - ميكايليس Menten مثل الحركية للفوسفات والاسيتيل لوحظ وجود منحنى الإشباع القطعي (الشكل 5). وكان الظاهر قيمة م K للفوسفات الاسيتيل 0.50 ± 0.006 ملمول / لتر. ريفز وتحدد قيمة غوثري 15 م ك من 0،06 ملمول / لتر بالنسبة للفوسفات لأنزيم أسيتيل الأم ، وكيف من أي وقت مضى ، لم يكن سوى على انزيم المنقى جزئيا وشمل اربع رزنها اقتران الانزيمات التي هي أيضا إلا جزئيا المنقى. وبالتالي ، فمن الصعب مقارنة هذه القيم مباشرة.

بروتوكول مخطط

  1. إنشاء معيار الفوسفات الاسيتيل منحنى
  2. انزيم لتخفيف تركيز المطلوب
  3. إعداد رد فعل الخليط وقسامة 300 ميكروليتر إلى الأنابيب microcentrifuge
  4. يحضن مسبقا ردود الفعل على 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة
  5. بدء التفاعلات بإضافة إنزيم في فترات زمنية محددة
  6. إضافة هيدروكسيل في الفترات ذاتها لوقف ردود الفعل واحتضان في 60 لمدة 5 دقائق درجة مئوية
  7. إضافة كلوريد الحديديك / حمض التريكلوروسيتيك حمض حل للتنمية اللون
  8. أنابيب الطرد المركزي في 18000 x ج لمدة 1 دقيقة
  9. قياس الامتصاصية في 540 نانومتر
  10. تحديد كمية الفوسفات الاسيتيل التي يستهلكها بالمقارنة مع منحنى القياسية

tp_upload/3474/3474fig1.jpg "/>
بروتوكول مخطط الرقم 1.

الشكل 2
الشكل 2. أسيتيل المعايير الفوسفات. وكان رد فعل زيادة تركيزات الفوسفات وضعت مع الاسيتيل هيدروكسيل واللون كما هو موضح. التحكم تفتقر الفوسفات الاسيتيل أصفر مشرق ، وردود الفعل التي تحتوي على كميات متزايدة من الفوسفات الاسيتيل وقتامة في اللون على التوالي. ويتم قياس هذا التغير في اللون 540 نانومتر.

الشكل 3
الشكل 3. نموذج قياسي الفوسفات الاسيتيل المنحنى. وكان رد فعل مبالغ متفاوتة من الفوسفات الاسيتيل مع هيدروكسيل وقياس التنمية حل اللون والامتصاصية في 540 نانومتر. وكان رسم الامتصاصية في 540 نانومتر مقابل الفوسفات μmoles الاسيتيل وطبق نوبة خطية إلى البيانات. </ P>

الشكل 4
الشكل 4. استغلال الفوسفات الاسيتيل من قبل M. المنتجة للاعبي التنس المحترفين thermophila خلات كيناز. وتم تحديد النشاط الأنزيمي في اتجاه تشكيل خلات في حضور ADP ملمول / لتر 5 مع تركيزات مختلفة من الفوسفات الاسيتيل. تم تحديد كمية الفوسفات المستهلكة الاسيتيل على أساس الفرق بين القيمة بدءا من الفوسفات الاسيتيل في التفاعل وكمية من الفوسفات الاسيتيل المتبقية بعد رد الفعل الأنزيمية. وأجريت فحوصات في ثلاث نسخ مع أشرطة خطأ مبين.

الشكل 5
الشكل 5. الاستفادة من الفوسفات الاسيتيل من PP ط المنتجة E. نسج خلات كيناز. وتم تحديد النشاط الأنزيمي في اتجاه تشكيل خلات في حضور 0.2 فوسفات الصوديوم مول / لتر مع تركيزات مختلفة من الفوسفات الاسيتيل. تم تحديد كمية الفوسفات المستهلكة الاسيتيل على أساس الفرق بين القيمة بدءا من الفوسفات الاسيتيل في التفاعل وكمية من الفوسفات الاسيتيل المتبقية بعد رد الفعل الأنزيمية. وأجريت فحوصات في ثلاث نسخ مع أشرطة خطأ مبين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الكشف عن الفوسفات الاسيتيل في هذا الاختبار يعتمد على تركيز كاف من هيدروكلوريد هيدروكسيل والتركيز والحموضة من محلول كلوريد الحديديك. وتغيير حجم مقايسة تتطلب إعادة النظر في كل من هذه المكونات. ردود الفعل الأنزيمية الموصوفة هنا أجريت في 37 درجة مئوية مع انتهاء تنفيذ هيدروكسيل عند 60 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ارتفاع درجة الحرارة هذا أمر حاسم للسماح للتحويل السريع للفوسفات في الاسيتيل المتبقية hydroxamate الاسيتيل. توقيت لون الخطوة التنمية وقياس الامتصاصية هو أقل أهمية ، ويمكن أن يؤديها في اقل من 5 دقائق ، وتصل إلى 15 دقيقة بعد إضافة محلول هيدروكسيل. يجب طرد هذه العينات قبل قراءة الامتصاصية ، والحموضة من العينة قد يؤدي إلى ترسيب الانزيم ويمكن ان تنتج على قراءة عالية زورا بسبب العكارة الفعلية بدلا من تغيير لون.وانهيار التفاعلات المتقدمة تبدأ تحدث بعد 10-15 دقيقة.

المضاعفات الرئيسية لهذا الاختبار لفحص انزيم حركية هي تحديد كمية الانزيم الاستخدام وطول الفترة الزمنية لتشغيل الخطوة الأولى من رد الفعل. ويجب تحديد هذه تجريبيا لكل انزيم مثل أن مستوى النشاط ليست مرتفعة بحيث يستهلك كل الركيزة الفوسفات الاسيتيل. وينبغي إيلاء اهتمام دقيق للفوسفات في المئة من استهلاك الاسيتيل لكل نقطة في منحنى ردود الفعل الحركية. عموما ، يجب أن تركيزات أقل من عنصر متنوعة على منحنى الحركية في الاستهلاك نتيجة الاسيتيل الفوسفات تصل إلى 90 في المئة أو أكثر قليلا ، في حين أن استهلاك الفوسفات الاسيتيل بتركيزات الركيزة النهج ينبغي أن تشبع 10 في المئة أو أقل قليلا. مرة واحدة هو الأمثل للتركيز الانزيم يمكن ، ثم مجموعة ركيزة لتحديد الثوابت الحركية يتم تحديدها.

فينطوي على أساليب revious لقياس النشاط كيناز خلات في اتجاه تشكيل خلات استخدام المقايسات جانب. هذه الأساليب هي إشكالية فيما يتعلق بحسابات حركية بسبب الاعتماد على نشاط انزيم اقتران (ق) ، الذي فحص الشروط (درجة الحموضة ، وقوة الأيونية ، ودرجة الحرارة ، الخ) قد تكون غير متوافقة مع الشروط المثلى لفحص انزيم الفائدة . بالإضافة إلى ذلك ، قد تستخدم لفحص مباشر للدراسات مع مثبطات تجنب المشاكل التي قد تنشأ من تثبيط الإنزيمات اقتران. عموما ، يجب أن هذا الاختبار يكون مفيدا ليس فقط للكيناز أسيتات ، ولكن عن أي الانزيم الذي يستخدم الفوسفات الاسيتيل أو غيرها تنشيط الأسيل سلسلة قصيرة ركائز مثل الاسيتيل أو بروبيونيل التميم ، بروبيونيل الفوسفات ، وأسيتيل AMP ، وكلها على رد الفعل مع هيدروكسيل. في هذه الحالات ، سوف يتم إنشاء منحنى القياسية مع الركيزة الأسيل المناسب بدلا من الفوسفات مع الاسيتيل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل الجائزة NSF # 0920274 وجنوب كارولينا تجربة مشروع محطة (SC - 1700340) لKSS. هذه الورقة التقنية رقم 5929 من المساهمة في تجربة جامعة كليمسون محطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetyl phosphate Sigma-Aldrich 01409 Lithium Salt (97% )
Sodium phosphate monobasic (dehydrate) Thermo Fisher Scientific, Inc. S381
Sodium phosphate dibasic (anhydrous) Thermo Fisher Scientific, Inc. S374
Magnesium chloride (hexahydrate) Thermo Fisher Scientific, Inc. M33
Tris Base Thermo Fisher Scientific, Inc. B152
Ferric chloride (hexahydrate) Thermo Fisher Scientific, Inc. I88
Trichloroacetic acid Thermo Fisher Scientific, Inc. A324
Hydroxylamine hydrochloride Thermo Fisher Scientific, Inc. H330

Adenosine 5’-diphosphate

sodium salt		 Sigma-Aldrich A2754
Biomate III Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Inc. 142982082 Standard UV/Vis spectrophotometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bork, P., Sander, C., Valencia, A. An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).
  2. Bork, P., Sander, C., Valencia, A. Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: the hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases. Protein Sci. 2, 31-40 (1993).
  3. Buss, K. A. Urkinase: structure of acetate kinase, a member of the ASKHA superfamily of phosphotransferases. J. Bacteriol. 183, 680-686 (2001).
  4. Hurley, J. H. The sugar kinase/heat shock protein 70/actin superfamily: implications of conserved structure for mechanism. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25, 137-162 (1996).
  5. Holmes, K. C., Sander, C., Valencia, A. A new ATP-binding fold in actin, hexokinase and Hsc70. Trends. Cell. Biol. 3, 53-59 (1993).
  6. Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. Acetate kinase: not just a bacterial enzyme. Trends. Microbiol. 14, 249-253 (2006).
  7. Aceti, D. J., Ferry, J. G. Purification and characterization of acetate kinase from acetate-grown Methanosarcina thermophila. Evidence for regulation of synthesis. J. Biol. Chem. 263, 15444-15448 (1988).
  8. Latimer, M. T., Ferry, J. G. Cloning, sequence analysis, and hyperexpression of the genes encoding phosphotransacetylase and acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Bacteriol. 175, 6822-6829 (1993).
  9. Ingram-Smith, C., Barber, R. D., Ferry, J. G. The role of histidines in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 275, 33765-33770 (2000).
  10. Miles, R. D., Iyer, P. P., Ferry, J. G. Site-directed mutational analysis of active site residues in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 276, 45059-45064 (2001).
  11. Miles, R. D., Gorrell, A., Ferry, J. G. Evidence for a transition state analog, MgADP-aluminum fluoride-acetate, in acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 277, 22547-22552 (2002).
  12. Ingram-Smith, C. Characterization of the acetate binding pocket in the Methanosarcina thermophila acetate kinase. J. Bacteriol. 187, 2386-2394 (2005).
  13. Gorrell, A., Lawrence, S. H., Ferry, J. G. Structural and kinetic analyses of arginine residues in the active site of the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 280, 10731-10742 (2005).
  14. Gorrell, A., Ferry, J. G. Investigation of the Methanosarcina thermophila acetate kinase mechanism by fluorescence quenching. Biochemistry. 46, 14170-14176 (2007).
  15. Reeves, R. E., Guthrie, J. D. Acetate kinase (pyrophosphate). A fourth pyrophosphate-dependent kinase from Entamoeba histolytica. Biochem. Biophys. Res. Commun. 66, 1389-1395 (1975).
  16. Fowler, M. L. Kinetic and structural characterization of the novel PPi-dependent acetate kinase from the parasite Entamoeba histolytica. , Forthcoming (2011).
  17. Lipmann, F. Enzymatic synthesis of acetyl phosphate. J. Biol. Chem. 155, 55-70 (1944).
  18. Lipmann, F., Tuttle, L. C. A specific micromethod for determination of acyl phosphates. J. Biol. Chem. 159, 21-28 (1945).
  19. Lipmann, F., Jones, M. E., Black, S., Flynn, R. M. The mechanism of the ATP-CoA-acetate reaction. J. Cell. Physiol. Suppl. 41, 109-112 (1953).
  20. Rose, I. A., Grunberg-Manago, M., Korey, S. F., Ochoa, S. Enzymatic phosphorylation of acetate. J. Biol. Chem. 211, 737-756 (1954).
  21. Allen, S. H., Kellermeyer, R. W., Stjernholm, R. L., Wood, H. G. Purification and properties of enzymes involved in the proponic acid fermentation. Journal of Bacteriology. 87, 171-187 (1964).
  22. Clarke, P. M., Payton, M. A. An enzymatic assay for acetate in spent bacterial culture supernatants. Anal. Biochem. 130, 402-405 (1983).
  23. Mukhopadhyay, S., Hasson, M. S., Sanders, D. A. A continuous assay of acetate kinase activity: measurement of inorganic phosphate release generated by hydroxylaminolysis of acetyl phosphate. Bioorg. Chem. 36, 65-69 (2008).
  24. Nakajima, H., Suzuki, K., Imahori, K. Purification and properties of acetate kinase from Bacillus stearothermophilus. J. Biochem. 84, 193-203 (1978).

Tags

علم الأحياء الجزيئية ، العدد 58 ، كيناز خلات ، خلات والفوسفات الاسيتيل ، بيروفوسفات ، وبالارقام ، ATP
الكشف عن مباشرة النشاط خلات تشكيل لأنزيم كيناز خلات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fowler, M. L., Ingram-Smith, C. J.,… More

Fowler, M. L., Ingram-Smith, C. J., Smith, K. S. Direct Detection of the Acetate-forming Activity of the Enzyme Acetate Kinase. J. Vis. Exp. (58), e3474, doi:10.3791/3474 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter