Summary
醋酸激酶活性测定方法的描述。本实验利用一个直接反应在醋酸形成的方向确定不同磷受体酶的活性和乙酸激酶动力学。此外，这种方法可以用于化验等乙酰磷酸盐或乙酰CoA利用酶。
Abstract
醋酸激酶，醋酸盐和糖激酶- HSP70 -肌动蛋白（ASKHA）1-5酶超家族成员，负责对醋酸的可逆磷酸化乙酰磷酸盐作为基质利用ATP 。醋酸激酶是无处不在的细菌 ，发现一个古属的，而且也存在于 真核生物 6微生物。最特征的醋酸激酶是由产甲烷古菌甲烷嗜 热 7-14 。 阿米巴 ，阿米巴痢疾的病原体已被隔离醋酸激酶只能利用聚丙烯 ，但不乙酰磷酸形成的方向ATP，并迄今只发现该属15,16。
在乙酰磷酸形成的方向，醋酸激酶活性通常是测量使用的氧肟检测，首先由李普曼描述17-20日 ，耦合检测的ATP转化为ADP耦合NADH氧化为NAD +的酶丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶21,22，或乙酰磷酸盐产品的反应后释放的无机磷的实验测量羟胺23。醋酸形成方向相反的活动，是衡量耦合ATP的形成，从ADP 减少NADP +，NADPH酶己糖激酶和葡萄糖-6 - 磷酸脱氢酶24。
在这里，我们描述了醋酸醋酸形成，不需要耦合酶的方向激酶活性检测的方法，而是被直接测定乙酰磷酸消费。酶反应后，剩余的乙酰磷酸转化为羟肟检测，可以测量分光光度计的一个铁氧肟复杂。因此，不像STandard加上这个方向是依赖于从ADP ATP的生产检测，这种直接的检测可用于醋酸激酶产生ATP或PP 我 。
Protocol
此协议的总体方案概述图1。
1。标准曲线和检测解决方案的准备工作
- 准备100毫升2 mol / L的羟胺盐酸溶液。称取13.9克盐酸羟胺（兆瓦69.49克/摩尔），溶于约50毫升蒸馏水，去离子水（DDH 2 O）的。使用氢氧化钾颗粒或浓缩液，调整pH至7.0。带来的最终体积至100 mL。该解决方案可在常温下保存长达30天，或在4 ° C下90天。
- 准备一个三氯化铁/盐酸溶液100毫升。称取13.5克氯化铁（兆瓦270.32克/摩尔），溶于约50毫升DDH 2 O添加41.3毫升的浓盐酸（12.1 mol / L的），使终体积为100 mL。氯化铁的终浓度0.5 mol / L的终浓度的盐酸，将5 MOL/ L。解决的办法是在常温下保存。
- 准备100毫升trichoroacetic酸了1.84 mol / L的解决方案。称取30.0克的三氯乙酸（兆瓦163.39克/摩尔），溶于DDH 2 O，使最终体积至100 mL。解决的办法是在常温下保存。
- 准备0.1 mol / L的乙酰，磷酸盐溶液5毫升。称取0.092克乙酰磷酸（兆瓦184.06克/摩尔），溶于DDH 2 O，使最终体积至5 mL。分装的解决方案，离心管（0.25毫升每管），并在-20℃冻结，直到使用。解冻的解决方案应放在冰，可用于约1小时。乙酰磷酸解决方案已经解冻的，不应该再冷冻和再利用。
- 准备5毫升0.1 mol / L的ADP的解决方案。称取0.24克（兆瓦472.5克/摩尔）的ADP，溶于DDH 2 O，并把最终体积至5 mL。分装在离心管（每管0.5毫升）的解决方案，并冻结在-20 ° C直到使用。保持解冻冰上直至使用的解决方案。
- 准备50毫升的1 mol / L的三解决方案。称取6.06克三（兆瓦121.14克/摩尔），溶于40毫升DDH 2 O溶液的pH值调整到7.0用盐酸和带来最终容至50 ml。在室温下的存储解决方案。
- 准备1 mol / L的氯化镁溶液10毫升。称取2.03克氯化镁（兆瓦203.31克/摩尔），溶于DDH 2 O，并把最后容至10 mL。储存在室温下的解决方案。
- 准备好三氯化铁/盐酸溶液和三氯乙酸溶液等体积混合25毫升的开发解决方案。开发解决方案，应准备新鲜的每一天，在室温下储存。
2。乙酰磷酸标准曲线的制备
- 乙酰磷酸标准曲线生成乙酰磷酸已知金额。标准曲线的6至eighT分是合适的。该标准的范围应该每300μL，这与0.1〜3 mmol / L的终浓度从0.03μmoles到0.9μmoles稀乙酰磷酸原液100毫米三在终体积为300μL的解决方案，在适当的浓度。还应该准备一个没有控制乙酰磷酸样本。
- 每个标准控制在37 ° C的热块1分钟。
- 添加50μL盐酸羟胺溶液到每一个标准和晃动三次，控制和混合。放入60 ° C的热块的标准，并孵育5分钟。
- 加入100μL的开发解决方案的标准和控制，通过摇动三次拌匀，并让颜色在室温下至少一分钟的发展。
- 离心机中离心1分钟18000 XG的所有标准和控制。
- 分光光度计一个测量样品吨540 nm处使用1毫升塑料试管，用分光空白的控制。
- 使用适当的数据分析和绘图软件（如Kaleidagraph，协同软件）生成一个标准的曲线。 R 2的值大于或等于0.99是可取的。数据绘制与乙酰磷酸目前μmoles，在540 nm处的吸光度。
3。醋酸激酶的活性含量为
- 使用所述的解决方案，准备一个反应混合物中包含终浓度为0.1 mol / L的Tris缓冲液，10 mmol / L的氯化镁，5 mmol / L的ADP，和2 mmol / L的乙酰磷酸。在10 mL反应混合物将需要8.2毫升DDH 2 O，1.0毫升三的解决方案，为0.1 mL氯化镁溶液，0.5毫升ADP的解决方案，0.2毫升乙酰磷酸盐溶液。分布在300μL分装离心管的反应混合。动力学参数和底物浓度的优化的测定，一个基板可以多样和其他在恒定浓度的反应举行。
- 预1分钟的反应在37 ° C的热块。
- 添加酶反应所需的量，并立即返回到37℃的热块管。还包括一个控制反应没有酶添加。如果进行几个反应管，在特定的时间间隔，添加酶。一定要跟踪时间。 （注：酶的使用量将需要优化，以确保乙酰磷酸或ADP基板都不会枯竭 - 见讨论部分）
- 5分钟后，加入盐酸羟胺溶液50μL，每个反应和控制，混合，放置在60 ° C的热块管。如果正在执行的一些反应，这应该在相同的时间间隔添加酶。
- 5分钟的反应和控制孵育60 ° C。
- 新增100＆万亩; L的开发解决方案，每个反应和控制，混合，在实验室工作台上的试管架。允许发展至少1分钟的颜色。
- 离心机中离心1分钟18000 XG管。
- 分光光度计在540 nm，使用1毫升的塑料试管和乙酰磷酸标准曲线进行比较，以确定乙酰磷酸目前量的测量样品。
- 乙酰磷酸耗尽基板量可以由乙酰磷酸减去从量控制缺乏酶的乙酰磷酸酶反应后的剩余金额。使用适当的数据和图形软件（例如Kaleidagraph，协同软件）进行数据分析。 R 2的值比0.97更大的是可取的。
4。代表性的成果：
这个实验的目的是直接测量醋酸激酶活性离子的醋酸形成。这是通过测量乙酰磷酸基板的消费，因为是不容易直接测量，醋酸生产的。乙酰磷酸酶反应过程中给定的时间后剩余是转化为乙酰氧肟，并在其后铁氧肟复杂，其中有一个颜色偏红（图2），可在540 nm处测定。标准曲线的绘制吸光度与μmoles标准的乙酰磷酸目前用于确定每个反应中剩余的乙酰磷酸量。标准曲线应通过零点的线性。一个有代表性的标准曲线如图3所示的1.2332％μmole乙酰磷酸目前和 R 2值0.99吸光度单位，表明该数据符合线性方程的斜率。标准曲线数据的线性拟合方程用于计算乙酰磷酸反应中剩余的数量。该μmoles乙酰消耗磷酸是在目前缺乏酶和乙酰磷酸酶反应后剩余的μmoles控制反应的乙酰磷酸μmoles之间的差异决定的。
纯化，重组M。嗜热醋酸激酶检测使用所描述的协议。如图4所示的实验，ADP浓度保持不变在5 mmol / L的浓度变化的反应乙酰磷酸乙酰磷酸，以确定的 K m。正如所料，这个实验表明，这种酶如下每个基板标准米氏般的动力学，并产生了双曲饱和曲线在策划活动与乙酰磷酸盐浓度。明显的 K m值乙酰磷酸为0.27 ± 0.01 mmol / L时相比，毫不逊色出版的 K m值0.47 ± 0.01 mmol / L的使用加上作为说13。
直接分析，也可以用来衡量利用衬底比ATP，这是不可能使用标准的耦合检测的醋酸激酶的活动。纯化的重组大肠杆菌阿米巴醋酸激酶16，PP 我 ，而不是ATP的产生在醋酸形成的方向，受到这个实验中，使用ADP的地方磷酸钠。反应磷酸钠的浓度保持不变，在0.2 mol / L的乙酰磷酸盐浓度是不同的。至于的M.嗜热醋酸激酶， 大肠杆菌阿米巴醋酸激酶遵循米氏般的动力学和乙酰磷酸双曲饱和曲线（图5）。明显的 K m值乙酰磷酸为0.50 ± 0.006毫摩尔/升。 Reeves和格思里15如何确定的 K m值的0.06毫摩尔/大号原酶的乙酰磷酸;以往，他们的酶只是部分纯化和检测涉及四个耦合的酶，也只有部分纯化。因此，它是很难直接比较这些值。
协议计划
- 生成乙酰磷酸标准曲线
- 稀释到所需浓度的酶
- 准备反应混合物和分装300μL离心管
- Preincubate反应在37 ° C为1分钟
- 启动通过添加酶在特定的时间间隔反应
- 添加羟胺在相同的时间间隔，停止反应，并培育在60℃，5分钟
- 添加氯化铁/三氯乙酸溶液显色
- 离心管18,000 1分钟XG
- 在540 nm处测量吸光度
- 乙酰消耗磷矿量确定标准曲线比较
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图1。议定书“的计划
图2。乙酰磷酸标准 。乙酰磷酸浓度增加的反应，羟胺和颜色所述。缺乏乙酰磷酸的控制是亮黄色，并含有对乙酰磷酸越来越多的反应都先后在颜色较深。这种颜色的变化是在540 nm处测量。
图3。乙酰磷酸样品标准曲线。与羟胺反应的乙酰磷酸数额不等，颜色开发解决方案和吸光度在540 nm处测定。与μmoles乙酰磷酸在540 nm的吸光度，绘制线性拟合的数据应用。/ P>
图4 ATP生产M.乙酰磷酸的利用。 嗜热醋酸激酶 。酶活性测定醋酸形成中存在的5 mmol / L的ADP与不同浓度的乙酰磷酸的方向。乙酰磷酸消耗金额被认定为起点金额乙酰磷酸反应和乙酰磷酸酶反应后剩余的金额之间的差额。检测显示，错误的酒吧一式三份。
图5。E.利用由PP 我生产的乙酰磷酸阿米巴醋酸激酶 。在醋酸形成的方向酶活性测定在0的存在。2 mol / L的不同浓度的乙酰磷酸磷酸钠。乙酰磷酸消耗金额被认定为起点金额乙酰磷酸反应和乙酰磷酸酶反应后剩余的金额之间的差额。检测显示，错误的酒吧一式三份。
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Discussion
在这个实验中的乙酰磷酸的检测是根据足够浓度的盐酸羟胺和氯化铁溶液的浓度和酸度依赖。更改的检测量将需要重新考虑这两个组件。酶促反应这里描述的是37 °与5分钟，在60 ° C时，羟胺终止。这较高的温度是至关重要的，以便其余乙酰磷酸迅速转化为乙酰氧肟。颜色一步发展和吸光度的测量时间是不太重要的，羟胺溶液此外，可以在短短的5分钟至15分钟进行。样品应该离心读取吸光度之前，作为样品的酸度可能导致沉淀的酶，能产生一种虚假的高读数，由于浊度，而不是实际的颜色变化。发达的反应分开始发生在10-15分钟后。
这对于研究酶动力学检测的主要并发症是测定的酶量，使用和运行的第一步反应的时间长度。这些经验必须确定每种酶的活跃程度没有那么高，消耗乙酰磷酸基。 ％反应动力学曲线的每个点的乙酰磷酸消费应给予认真注意。一般来说，低浓度的动力学曲线上的不同组成部分，应该导致乙酰磷酸消费高达90％或略高于，乙酰磷酸消费饱和底物浓度应该接近10％或略少。一旦进行了优化，酶浓度的动力学常数的测定基板范围，然后确定。
P醋酸激酶活性在醋酸形成的方向测量的revious方法涉及使用耦合分析。这些方法由于依赖于耦合酶（S），其检测条件（pH，离子强度，温度等），可能与利益酶的最佳实验条件相抵触的活动动力学计算方面的问题。此外，利用一个直接的检测与抑制剂的研究可能避免耦合酶抑制可能出现的问题。总的来说，这个实验应该是有用的，不仅对醋酸激酶，但对任何酶，利用乙酰磷酸或其他激活的短链酰基基板，如乙酰丙酰辅酶A，丙磷酸，乙酰- AMP，所有这些都反应与羟胺。在这种情况下，标准曲线将产生相应的酰基基板，而不是与乙酰磷酸。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由国家科学基金会奖＃0920274和南卡罗来纳州试验站项目（SC - 1700340）幼稚园资助计划的支持。本文是技术贡献的克莱姆森大学实验站5929号。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetyl phosphate | Sigma-Aldrich | 01409 | Lithium Salt (97% ) |
| Sodium phosphate monobasic (dehydrate) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S381 | |
| Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S374 | |
| Magnesium chloride (hexahydrate) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | M33 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific, Inc. | B152 | |
| Ferric chloride (hexahydrate) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | I88 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A324 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Thermo Fisher Scientific, Inc. | H330 | |
Adenosine 5’-diphosphate sodium salt |
Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Biomate III Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 142982082 | Standard UV/Vis spectrophotometer |
References
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