Summary
Eine Methode zur Bestimmung von Acetat-Kinase-Aktivität beschrieben. Dieser Assay nutzt eine direkte Reaktion zur Bestimmung der Enzymaktivität und die Kinetik der Acetat-Kinase in die Acetat-bildenden Richtung mit unterschiedlichen Phosphoryl Akzeptoren. Darüber hinaus kann diese Methode für die Untersuchung auf andere Acetyl-Phosphat-oder Acetyl-CoA-Enzyme verwendet genutzt werden.
Abstract
Acetat-Kinase, ein Mitglied der Acetat-und Zucker-Kinase-Hsp70-Aktin (ASKHA) Enzym-Superfamilie 1-5, ist verantwortlich für die reversible Phosphorylierung von Acetat zu Acetyl-Phosphat nutzen ATP als Substrat. Acetat-Kinasen sind ubiquitär in der Bakterien, in einer Gattung von Archaea gefunden und sind auch in Mikroben der Eukarya 6. Die am besten charakterisierten Acetat-Kinase ist, dass aus der Methan-produzierenden Archaeon Methanosarcina thermophila 7-14. Ein Acetat-Kinase, die nur nutzen können, PP i, aber nicht in die Acetyl-Phosphat-bildenden Richtung ATP ist von Entamoeba histolytica, der Erreger der Amöbenruhr isoliert worden, und bisher nur in dieser Gattung 15,16 gefunden.
In Richtung der Acetyl-Phosphat-Bildung ist Acetat-Kinase-Aktivität in der Regel unter Verwendung der Hydroxamat Assay, die zuerst von Lipmann beschrieben17-20, eine gekoppelte Assay, bei dem Umsatz von ATP zu ADP um die Oxidation von NADH zu NAD + gekoppelt ist durch die Enzyme Pyruvatkinase und Lactat-Dehydrogenase 21,22 oder ein Assay Messung Freisetzung von anorganischem Phosphat nach der Reaktion der Acetyl-Phosphat-Produkts mit Hydroxylamin 23. Aktivität in das Gegenteil, ist Acetat-bildenden Richtung durch die Kopplung ATP-Bildung aus ADP auf die Reduktion von NADP + durch die Enzyme Hexokinase und Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase 24 NADPH gemessen.
Hier beschreiben wir eine Methode zum Nachweis von Acetat-Kinase-Aktivität in Richtung der Acetat-Bildung, der keine Kopplung Enzyme, sondern ist auf die direkte Bestimmung von Acetyl-Phosphat-Verbrauch. Nach der enzymatischen Reaktion wird noch Acetylphosphat zu einem Eisen-III-Hydroxamat komplex, dass spektrophotometrisch gemessen werden kann, wie für die Hydroxamat Assay umgewandelt. So anders als die standard gekoppelte Assay für diese Richtung, dass abhängig von der Produktion von ATP aus ADP ist, kann diese direkt Assay für Acetat-Kinasen, ATP oder PP i zu produzieren verwendet werden.
Protocol
Das Gesamtkonzept dieses Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Herstellung der Lösung für Standard-Kurven und Assays
- Bereiten Sie 100 mL einer 2 mol / L Lösung von Hydroxylamin-HCl. Abwiegen 13,9 g Hydroxylamin-Hydrochlorid (MW 69,49 g / mol) und lösen sich in ca. 50 mL destilliertem entionisiertem Wasser (ddH 2 O). Den pH-Wert auf 7,0 mit Kaliumhydroxid Pellets oder eine konzentrierte Lösung. Bringen Sie das Endvolumen von 100 mL. Die Lösung kann bei Raumtemperatur bis zu 30 Tage oder bei 4 ° C für bis zu 90 Tage gelagert werden.
- Bereiten Sie 100 mL einer Eisenchlorid / Salzsäure-Lösung. Abwiegen 13,5 g Eisenchlorid (MW 270,32 g / mol) und lösen sich in ca. 50 mL ddH 2 O. Add 41,3 mL konzentrierte Salzsäure (12,1 mol / L) und bringen Sie auf ein Endvolumen von 100 mL. Die Endkonzentration von Eisenchlorid wird 0,5 mol / L und die endgültige Konzentration der Salzsäure wird 5 mol werden/ L. Die Lösung wird bei Raumtemperatur gelagert.
- Bereiten Sie 100 mL einer 1,84 mol / L Lösung von trichoroacetic Säure. Abwiegen 30,0 g Trichloressigsäure (MW 163,39 g / mol), in ddH 2 O lösen und bringen das endgültige Volumen von 100 mL. Die Lösung wird bei Raumtemperatur gelagert.
- Bereiten Sie 5 mL einer 0,1 mol / L Acetyl-Phosphat-Lösung. Abwiegen 0,092 g Acetyl-Phosphat (MW 184,06 g / mol), in ddH 2 O lösen und bringen das endgültige Volumen auf 5 mL. Aliquot der Lösung Mikrozentrifugenröhrchen (0,25 ml pro Röhrchen) und bei -20 ° C bis zur Verwendung. Aufgetaute Lösung sollte auf Eis gelegt werden und kann für ca. 1 Stunde verwendet werden. Acetyl-Phosphat-Lösung, die aufgetaut hat, sollte nicht wieder eingefroren werden und wieder verwendet werden.
- Bereiten Sie 5 mL einer 0,1 mol / L Lösung von ADP. Abwiegen 0,24 g ADP (MW 472,5 g / mol), in ddH 2 O lösen, und bringen das endgültige Volumen auf 5 mL. Aliquot der Lösung in Reaktionsgefäße (0,5 ml pro Röhrchen) und bei -20 ° C biszu verwenden. Keep aufgetauten Lösung auf Eis bis zum Gebrauch.
- Bereiten Sie 50 ml einer 1 mol / L Lösung von Tris. Abwiegen 6,06 g Tris (MW 121,14 g / mol), und lösen sich in 40 mL ddH 2 O. Den pH-Wert der Lösung auf 7,0 mit Salzsäure und bringen Endvolumen von 50 mL. Shop-Lösung bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie 10 ml einer 1 mol / L Magnesiumchlorid-Lösung. Abwiegen 2,03 g Magnesiumchlorid (MW 203,31 g / mol), in ddH 2 O lösen und bringen Endvolumen von 10 mL. Bewahren Sie die Lösung bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie 25 mL Lösung für die Entwicklung durch Mischen gleicher Volumina der Eisenchlorid / Salzsäure-Lösung und der Trichloressigsäure-Lösung. Entwicklung Lösung sollte täglich frisch zubereitet werden und bei Raumtemperatur gelagert.
2. Vorbereitung einer Acetyl-Phosphat Standardkurve
- Ein Acetylphosphat Standardkurve wird unter Verwendung bekannter Mengen von Acetyl-Phosphat. Eine Standardkurve von sechs bis eight Punkte geeignet ist. Die Standards sollten von 0,03 umol auf 0,9 umol Bereich pro 300 ul, die Endkonzentrationen von 0,1 bis 3 mmol / L. korreliert Verdünnen Sie die Acetyl-Phosphat-Stammlösung zu den entsprechenden Konzentrationen in 100 mM Tris-Lösung in einem Endvolumen von 300 ul. Eine Kontrollprobe ohne Acetylphosphat sollten auch vorbereitet werden.
- Inkubieren jeden Standard und die Kontrolle bei 37 ° C in einem Heizblock für 1 Minute.
- Dann werden 50 ul der Hydroxylaminhydrochlorid-Lösung in jede Standard-und die Kontroll-und Mix durch Schütteln dreimal. Legen Sie die Standard-in eine 60 ° C Heizblock inkubieren 5 Minuten.
- Add 100 ul Lösung für die Entwicklung der Standards und der Kontrolle, mischen durch Schütteln dreimal, und damit Farbe für mindestens eine Minute lang bei Raumtemperatur zu entwickeln.
- Centrifuge alle Standards und die Kontrolle in einer Mikrozentrifuge bei 18.000 xg für 1 Minute.
- Messen Sie die Proben spektrophotometrisch eint 540 nm mit 1 ml Kunststoff-Küvetten, mit dem Steuerelement, das als Rohling für Spektrophotometrie.
- Generieren Sie eine Standardkurve mit Hilfe geeigneter Datenanalyse und-darstellung Software (zB Kaleidagraph, Synergy Software). R 2-Werte von 0,99 oder größer sind wünschenswert. Die Daten werden als Absorption bei 540 nm im Vergleich zu umol Acetylphosphat Gegenwart dargestellt.
3. Assay für Acetat-Kinase Aktivität
- Mit den beschriebenen Lösungen, bereiten eine Reaktion Mix mit einer Endkonzentration von 0,1 mol / L Tris-Puffer, 10 mmol / L Magnesiumchlorid, 5 mmol / L ADP und 2 mmol / L Acetylphosphat. Ein 10 ml Reaktionsgemisch erfordert 8,2 ml ddH 2 O, 1,0 ml Tris-Lösung, 0,1 ml Magnesiumchlorid-Lösung, 0,5 ml ADP-Lösung und 0,2 ml Acetyl-Phosphat-Lösung. Verteilen Sie die Reaktionsmischung in 300 ul Aliquots zu Mikrozentrifugenröhrchen. Zur Bestimmung der kinetischen Parameter und Optimierung von Substratkonzentrationen, kann man Substratvariiert und die anderen bei einer konstanten Konzentration in den Reaktionen statt.
- Pre-Inkubation die Reaktionen für 1 Minute bei 37 ° C in einem Heizblock.
- Fügen Sie eine gewünschte Menge an Enzym, die Reaktion und sofort wieder die Leitung auf die 37 ° C Hitze zu blockieren. Auch eine Kontrolle Reaktion auf die kein Enzym zugesetzt wird. Wenn mehrere Reaktionen durchgeführt werden, fügen Enzym, die Rohre in bestimmten Zeitabständen. Achten Sie darauf, die Spuren der Zeit zu halten. (HINWEIS: Die Menge an Enzym eingesetzt werden müssen optimiert werden, um sicherzustellen, dass alle der Acetyl-Phosphat oder ADP Substrat nicht aufgebraucht sein werden - siehe Diskussion Abschnitt)
- Nach 5 Minuten, fügen Sie 50 ul der Hydroxylaminhydrochlorid-Lösung zu jeder Reaktion und die Steuerung, mischen, und legen Sie die Röhrchen in einem 60 ° C Hitze zu blockieren. Wenn mehrere Reaktionen durchgeführt wird, sollte dies auf dem gleichen Zeitintervall durchgeführt werden, da das Enzym wurde hinzugefügt.
- Inkubieren Sie die Reaktionen und die Steuerung für 5 Minuten bei 60 ° C.
- Add 100 μ L der Entwicklung Lösung zu jeder Reaktion und die Steuerung, zu mischen und in ein Rohr Rack auf dem Labortisch. Lassen Sie Farbe, um für mindestens 1 Minute zu entwickeln.
- Alle Röhrchen in einer Mikrozentrifuge bei 18.000 xg für 1 Minute.
- Messen Sie Proben spektrophotometrisch bei 540 nm mit 1 ml Kunststoff-Küvetten und die Höhe der Acetylphosphat präsentieren im Vergleich zu den Acetylphosphat Standardkurve.
- Die Höhe der Acetyl-Substrat verbraucht kann durch Subtraktion der Menge an Acetyl-Phosphat, die nach der enzymatischen Reaktion von der Menge an Acetyl-Phosphat in der Steuerung fehlt Enzyms bestimmt werden. Führen Sie die Datenanalyse mit entsprechenden Daten und grafische Software (zB Kaleidagraph, Synergy Software). R 2-Werte von größer als 0,97 sind erwünscht.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Der Zweck dieses Tests ist es, Acetat-Kinase-Aktivität in der direkten Messungion von Acetat-Bildung. Dies wird durch die Messung Verbrauch von Acetyl-Phosphat-Substrat getan, denn es gibt keine einfache, direkte Messung für Acetat Produktion. Acetyl-Phosphat, das nach einer bestimmten Zeit während der enzymatischen Reaktion wird zu Acetyl Hydroxamat und anschließend zu Eisen-III-Hydroxamat Komplex, der eine rötliche Farbe (Abbildung 2), die bei 540 nm gemessen werden kann, umgewandelt wurde. Die Standardkurve Plotten Absorption gegen umol Acetylphosphat in den Standards wird verwendet, um die Menge der Acetylphosphat übrigen in jeder Reaktion zu bestimmen. Die Standardkurve sollte linear durch den Nullpunkt. Eine repräsentative Standardkurve in Abbildung 3 dargestellt hat eine Steigung von 1,2332 Extinktionseinheiten pro umol Acetylphosphat Gegenwart und einer R 2-Wert von 0,99, wobei die Daten passt der linearen Gleichung gut. Die Gleichung für die lineare Anpassung der Standardkurve Daten für die Berechnung der Menge von Acetyl-Phosphat-noch in der Reaktion verwendet. Die umolvon Acetyl-Phosphat verbraucht wird als die Differenz zwischen dem umol Acetylphosphat in der Kontroll-Reaktion fehlt Enzym und die umol Acetylphosphat, die nach der enzymatischen Reaktion bestimmt.
Gereinigtes, rekombinantes M. thermophila Acetat-Kinase wurde unter Verwendung der beschriebenen Protokoll. Für das Experiment in Abbildung 4 dargestellt, wurde die Konzentration von ADP konstant gehalten und bei 5 mmol / L die Konzentration von Acetyl-Phosphat in der Reaktion wurde variiert, um die K m für Acetylphosphat bestimmen. Wie erwartet, zeigt dieses Experiment, dass das Enzym Standard Michaelis-Menten-Kinetik wie folgt für jedes Substrat und produziert eine hyperbolische Sättigungskurve beim Plotten Aktivität gegenüber Acetyl-Konzentration. Die scheinbare K m-Wert für Acetyl-Phosphat betrug 0,27 ± 0,01 mmol / L, was im Vergleich zu den veröffentlichten K m-Wert von 0,47 ± 0,01 mmol / L mit dem verbunden ist, wiesagen 13.
Der direkte Test kann auch verwendet werden, um die Aktivität von Acetat-Kinasen, die andere Substrate als ATP, was nicht möglich ist mit dem Standard-gekoppelten Assay nutzen zu messen. Gereinigtes rekombinantes E. histolytica Acetat-Kinase 16, die PP i anstatt ATP produziert in der Acetat-bildenden Richtung, wurde dieser Test unter Verwendung von Natriumphosphat anstelle von ADP unterzogen. Die Konzentration von Natrium-Phosphat in der Reaktion wurde konstant gehalten und mit 0,2 mol / L die Acetyl-Phosphat-Konzentration variiert wurde. Wie für die M. thermophila Acetat-Kinase, die E. histolytica Acetat-Kinase gefolgt Michaelis-Menten-Kinetik wie für Acetyl-Phosphat und einem hyperbolischen Sättigungskurve beobachtet wurde (Abbildung 5). Die scheinbare K m-Wert für Acetyl-Phosphat betrug 0,50 ± 0,006 mmol / L. Reeves und Guthrie 15 bestimmt ein K m-Wert von 0,06 mmol / L für Acetylphosphat für das native Enzym, wie immer war ihr Enzym nur teilweise gereinigt und ihre Test umfasste vier Kupplung Enzyme, die auch nur teilweise gereinigt. So ist es schwierig, einen direkten Vergleich dieser Werte.
Protokoll Scheme
- Generieren Sie eine Acetyl-Phosphat-Standard-Kurve
- Verdünnen Enzym gewünschte Konzentration
- Bereiten Sie die Reaktionsmischung und aliquoten 300 pl auf Mikrozentrifugenröhrchen
- Vorinkubieren Reaktionen bei 37 ° C für 1 Minute
- Starten Reaktionen, die durch Zugabe des Enzyms in bestimmten Zeitintervallen
- Add Hydroxylamin in den gleichen Abständen, um die Reaktionen zu stoppen und Inkubieren bei 60 ° C für 5 Minuten
- Add Eisenchlorid / Trichloressigsäure-Lösung für Farb-Entwicklung
- Zentrifugenröhrchen bei 18.000 xg für 1 Minute
- Messen Sie die Absorption bei 540 nm
- Bestimmen Sie Betrag von Acetyl-Phosphat verbraucht im Vergleich zu den Standard-Kurve
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Abbildung 1. Protocol Scheme
Abbildung 2. Acetyl-Phosphat-Standards. Steigende Konzentrationen von Acetyl-Phosphat wurden mit Hydroxylamin und Farbe entwickelt wurde, wie beschrieben umgesetzt wird. Die Kontrolle fehlt Acetylphosphat ist leuchtend gelb, und die Reaktionen mit steigenden Mengen von Acetyl-Phosphat werden nacheinander in der Farbe dunkler. Diese Farbänderung wird bei 540 nm gemessen.
Abbildung 3. Probe Acetylphosphat Standardkurve. Verschiedene Mengen von Acetyl-Phosphat wurden mit Hydroxylamin und die Farbe Lösung für die Entwicklung und die Absorption bei 540 nm gemessen. Die Absorption bei 540 nm im Vergleich zu umol Acetylphosphat wurde aufgetragen und eine lineare Anpassung an die Daten angewendet wurde. </ P>
Abbildung 4. Verwertung von Acetyl-Phosphat durch die ATP-Produktion M. thermophila Acetat-Kinase. Die enzymatische Aktivität wurde in Richtung der Acetat-Bildung in Gegenwart von 5 mmol / L ADP mit unterschiedlichen Konzentrationen von Acetyl-Phosphat bestimmt. Der Betrag von Acetyl-Phosphat verbraucht wurde als die Differenz zwischen dem Grundbetrag von Acetyl-Phosphat in die Reaktion und die Höhe der Acetyl-Phosphat, die nach der enzymatischen Reaktion bestimmt. Die Tests wurden in dreifacher Ausfertigung mit Fehlerbalken dargestellt ist.
Abbildung 5. Verwertung von Acetyl-Phosphat durch die PP i-produzierende E. histolytica Acetat-Kinase. Enzymatische Aktivität in Richtung der Acetat-Bildung wurde in Gegenwart von 0 bestimmt.2 mol / L Natriumphosphat mit unterschiedlichen Konzentrationen von Acetyl-Phosphat. Der Betrag von Acetyl-Phosphat verbraucht wurde als die Differenz zwischen dem Grundbetrag von Acetyl-Phosphat in die Reaktion und die Höhe der Acetyl-Phosphat, die nach der enzymatischen Reaktion bestimmt. Die Tests wurden in dreifacher Ausfertigung mit Fehlerbalken dargestellt ist.
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Discussion
Der Nachweis von Acetyl-Phosphat in diesem Test ist abhängig von einer ausreichenden Konzentration von Hydroxylaminhydrochlorid und die Konzentration und Säuregehalt der Eisenchlorid-Lösung. Änderung der Assayvolumen erfordert Überprüfung dieser beiden Komponenten. Die enzymatischen Reaktionen hier beschriebenen wurden bei 37 ° C mit dem Hydroxylamin Kündigung bei 60 ° C für 5 Minuten. Diese höhere Temperatur ist entscheidend, um eine rasche Wandlung der restlichen Acetylphosphat zu Acetyl Hydroxamat ermöglichen. Der Zeitpunkt der Farbe Entwicklungsschritt und die Messung der Absorption ist weniger kritisch und kann in weniger als 5 Minuten und bis zu 15 Minuten nach der Zugabe des Hydroxylamin-Lösung durchgeführt werden. Die Proben sollten vor dem Lesen der Absorption zentrifugiert werden, da der Säuregehalt der Probe auf Fällung des Enzyms führen können, und kann ein falsch hoher Lese wegen Trübung anstatt tatsächliche Farbwechsel erzeugen.Breakdown der entwickelten Reaktionen beginnen, nach 10-15 Minuten auftreten.
Der primäre Komplikationen dieses Assays zur Untersuchung Enzymkinetik sind die Bestimmung der Menge an Enzym zu verwenden und die Länge der Zeit, den ersten Schritt der Reaktion führen. Diese muss empirisch für jedes Enzym, so dass der Grad der Aktivität ist nicht so hoch, dass alle Acetylphosphat Substrat verbraucht wird bestimmt werden. Besondere Aufmerksamkeit sollte dem Prozent Acetylphosphat Verbrauch für jede Reaktion Punkt in einem kinetischen Kurve gegeben werden. Generell sollten niedrigere Konzentrationen der verschiedensten Komponenten auf eine kinetische Kurve in Acetylphosphat Verbrauch bis zu 90 Prozent oder leicht darüber führen, während der Verbrauch von Acetyl-Phosphat bei sättigenden Substratkonzentrationen 10 Prozent oder etwas weniger Ansatz sollte. Sobald die Enzymkonzentration optimiert ist, kann das Substrat Bereich zur Bestimmung der kinetischen Konstanten dann bestimmt werden.
Prherige Methoden zur Messung der Acetat-Kinase-Aktivität in der Acetat-bildenden Richtung betrifft die Verwendung von gekoppelten Assays. Diese Methoden sind problematisch im Hinblick auf kinetische Berechnungen aufgrund der Abhängigkeit von der Aktivität des Enzyms Kopplung (s), dessen Testbedingungen (pH, Ionenstärke, Temperatur, etc.) unter Umständen nicht kompatibel mit der optimalen Testbedingungen für das Enzym von Interesse . Darüber hinaus können auf ein direkter Assay für Studien mit Inhibitoren Vermeidung von Problemen, die aus der Hemmung der Kupplung Enzyme entstehen könnten. Insgesamt sollte dieser Test sinnvoll sein, nicht nur für die Acetat-Kinase, sondern für jedes Enzym, das Acetyl-Phosphat oder andere aktivierte kurzkettige Acyl-Substrate wie Acetyl-oder Propionyl-CoA, Propionyl Phosphat und Acetyl-AMP, die alle reaktiv sind nutzt mit Hydroxylamin. In diesen Fällen würde die Standardkurve mit den entsprechenden Acyl Substrat statt mit Acetyl-Phosphat erzeugt werden.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der NSF award # 0920274 und South Carolina Experiment Station Project (SC-1700340), um KSS unterstützt. Dieses Papier ist technischen Beitrag Nr. 5929 von der Clemson University Experiment Station.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetyl phosphate | Sigma-Aldrich | 01409 | Lithium Salt (97% ) |
| Sodium phosphate monobasic (dehydrate) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S381 | |
| Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S374 | |
| Magnesium chloride (hexahydrate) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | M33 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific, Inc. | B152 | |
| Ferric chloride (hexahydrate) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | I88 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A324 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Thermo Fisher Scientific, Inc. | H330 | |
Adenosine 5’-diphosphate sodium salt |
Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Biomate III Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 142982082 | Standard UV/Vis spectrophotometer |
References
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