Summary
एसीटेट kinase गतिविधि के निर्धारण के लिए एक विधि का वर्णन है. इस परख एसीटेट के गठन की दिशा में विभिन्न phosphoryl स्वीकारकर्ताओं के साथ एंजाइम और एसीटेट kinase की गतिविधि कैनेटीक्स का निर्धारण करने के लिए एक सीधा प्रतिक्रिया का इस्तेमाल करता. इसके अलावा, इस पद्धति अन्य एसिटाइल फॉस्फेट या एंजाइमों acetyl-CoA उपयोग परख करने की क्रिया के लिए उपयोग किया जा सकता है.
Abstract
एसीटेट kinase, एसीटेट और चीनी kinase HSP70 actin (ASKHA) एंजाइम 1-5 superfamily के एक सदस्य, एसीटेट की प्रतिवर्ती एसिटाइल फॉस्फेट की phosphorylation एक सब्सट्रेट के रूप में एटीपी उपयोग के लिए जिम्मेदार है. एसीटेट kinases बैक्टीरिया में सर्वव्यापक, Archaea का एक जीनस में पाया है, और भी 6 Eukarya के रोगाणुओं में मौजूद हैं . सबसे अच्छी तरह से विशेषता एसीटेट kinase है कि मीथेन उत्पादन archaeon Methanosarcina thermophila 7-14 से. एक एसीटेट kinase जो केवल पीपी मैं का उपयोग कर सकते हैं लेकिन फॉस्फेट के गठन दिशा एसिटाइल में एटीपी नहीं एटामोइबा हिस्टोलिटिका, अमीबी पेचिश की प्रेरणा का एजेंट से पृथक किया गया है, और इस प्रकार अब तक केवल इस जीनस 15,16 में पाया गया है .
एसिटाइल फॉस्फेट के गठन की दिशा में, एसीटेट kinase गतिविधि आमतौर पर hydroxamate परख का उपयोग मापा जाता है, पहले Lipmann द्वारा वर्णित17-20, मिलकर परख जिसमें एटीपी के ADP के लिए रूपांतरण NADH के NAD ऑक्सीकरण के लिए युग्मित है + एंजाइमों पाइरूवेट kinase और लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज 21,22 द्वारा, या एक एसिटाइल फॉस्फेट उत्पाद की प्रतिक्रिया के बाद अकार्बनिक फॉस्फेट की रिहाई को मापने परख 23 hydroxylamine साथ. विपरीत में गतिविधि, एसीटेट बनाने दिशा ADP से NADP की कमी + एंजाइमों hexokinase और ग्लूकोज 6 फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज 24 द्वारा NADPH एटीपी गठन युग्मन द्वारा मापा जाता है.
यहाँ हम एसीटेट कि युग्मन एंजाइमों की आवश्यकता नहीं है एसीटेट गठन की दिशा में kinase गतिविधि का पता लगाने के के लिए एक विधि का वर्णन है, लेकिन बजाय एसिटाइल फॉस्फेट की खपत के प्रत्यक्ष निर्धारण के आधार पर. Enzymatic प्रतिक्रिया के बाद, शेष एसिटाइल फॉस्फेट ferric hydroxamate जटिल है कि spectrophotometrically hydroxamate परख के लिए के रूप में मापा जा सकता है है के लिए बदल जाती है. इस प्रकार, सेंट विपरीतADP से एटीपी के उत्पादन पर निर्भर है कि इस दिशा के लिए andard मिलकर परख, इस सीधे परख एसीटेट kinases है कि एटीपी या पीपी मैं उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
इस प्रोटोकॉल के समग्र योजना चित्रा 1 में उल्लिखित है.
1. मानक घटता और Assays के लिए समाधान तैयार
- 2 hydroxylamine - एचसीएल के समाधान / mol एल के 100 एमएल तैयार. Hydroxylamine हाइड्रोक्लोराइड के 13.9 ग्राम (मेगावाट 69.49 छ / mol) वजन और लगभग 50 एमएल पानी आसुत विआयनीकृत (DDH 2 हे) में भंग. 7.0 पीएच समायोजित पोटेशियम हीड्राकसीड छर्रों या एक केंद्रित समाधान का उपयोग कर. 100 एमएल के लिए अंतिम मात्रा लाओ. समाधान 30 दिन तक के लिए या 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 90 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है.
- एक ferric क्लोराइड / हाइड्रोक्लोरिक एसिड समाधान के 100 एमएल तैयार. 13.5 छ ferric क्लोराइड (मेगावाट 270.32 छ / mol) वजन और लगभग 50 एमएल DDH 2 ओ में भंग 41.3 एमएल केंद्रित हाइड्रोक्लोरिक एसिड (12.1 mol / एल) जोड़ें और 100 एमएल की एक अंतिम मात्रा करने के लिए ले आओ. ferric क्लोराइड की अंतिम एकाग्रता 0.5 mol / एल और हाइड्रोक्लोरिक एसिड के अंतिम एकाग्रता 5 mol जाएगा किया जाएगा/ एल समाधान कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जाता है.
- 1.84 trichoroacetic एसिड समाधान / mol एल के 100 एमएल तैयार. Trichloroacetic एसिड (मेगावाट 163.39 छ / mol) के 30.0 ग्राम वजन, 2 हे DDH में भंग और 100 एमएल के लिए अंतिम मात्रा लाने के. समाधान कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जाता है.
- एक 0.1 mol / एल एसिटाइल फॉस्फेट समाधान के 5 एमएल तैयार. .092 छ एसिटाइल फॉस्फेट (मेगावाट 184.06 छ / mol) वजन, DDH 2 हे में भंग और 5 एमएल अंतिम मात्रा लाने. अशेष भाजक microcentrifuge ट्यूबों (0.25 ट्यूब प्रति एमएल) के लिए समाधान और उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है. Thawed समाधान बर्फ पर रखा जाना चाहिए और लगभग 1 घंटे के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Acetyl फॉस्फेट समाधान है कि thawed किया गया है refrozen नहीं हो सकता है और फिर से इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
- 0.1 ADP के समाधान / mol एल के 5 एमएल तैयार. ADP (मेगावाट 472.5 छ / mol) की 0.24 ग्राम वजन, DDH 2 हे में भंग, और 5 एमएल अंतिम मात्रा लाने. Microcentrifuge ट्यूबों में अशेष भाजक समाधान (ट्यूब प्रति 0.5 एमएल) और फ्रीज -20 ° सी जब तकका उपयोग करें. उपयोग करें जब तक बर्फ पर thawed समाधान रखें.
- 1 Tris के समाधान / mol एल के 50 एमएल तैयार. 6.06 छ Tris (मेगावाट 121.14 छ / mol) वजन और 40 एमएल DDH 2 ओ में भंग 7.0 हाइड्रोक्लोरिक एसिड का उपयोग कर समाधान के पीएच को समायोजित और 50 एमएल के लिए अंतिम मात्रा लाने. कमरे के तापमान पर स्टोर समाधान.
- एक एक मैग्नीशियम / mol एल क्लोराइड समाधान के 10 एमएल तैयार. वजन 2.03 ग्राम मैग्नीशियम क्लोराइड (मेगावाट 203.31 छ / mol), DDH 2 हे में भंग, और 10 एमएल के लिए अंतिम मात्रा लाने के. कमरे के तापमान पर स्टोर समाधान.
- 25 एमएल विकास समाधान ferric एसिड / क्लोराइड हाइड्रोक्लोरिक समाधान और trichloroacetic एसिड समाधान के बराबर मात्रा के मिश्रण से तैयार करें. विकास समाधान प्रत्येक दिन नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए और कमरे के तापमान पर संग्रहीत.
2. एक Acetyl फास्फेट मानक वक्र की तैयारी
- एक एसिटाइल फॉस्फेट मानक वक्र एसिटाइल फॉस्फेट की ज्ञात मात्रा का उपयोग करने के लिए उत्पन्न होता है. छह में से एक मानक वक्र के लिए eighटी अंक उपयुक्त है. मानकों 0.03 μmoles से 0.9 μmoles के लिए 300 प्रति μL, जो 0.1 से 3 mmol / एल के अंतिम सांद्रता के लिए संबद्ध रेंज चाहिए एसिटाइल फॉस्फेट शेयर 300 μL के अंतिम मात्रा में 100 मिमी Tris समाधान में उचित सांद्रता के समाधान पतला. एसिटाइल फॉस्फेट के बिना एक नियंत्रण का नमूना भी तैयार रहना चाहिए.
- 37 पर 1 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक में प्रत्येक मानक और नियंत्रण सेते हैं.
- Hydroxylamine हाइड्रोक्लोराइड प्रत्येक मानक के समाधान और नियंत्रण और तीन बार के झटकों से मिश्रण के 50 μL जोड़ें. एक 60 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक में मानक प्लेस और पांच मिनट के लिए सेते हैं.
- विकास के मानकों करने के लिए समाधान के 100 μL और नियंत्रण, तीन बार के झटकों से मिश्रण जोड़ें, और रंग में कम से कम एक मिनट के लिए कमरे के तापमान पर विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं.
- 1 मिनट के लिए 18,000 XG पर एक microcentrifuge में सभी मानकों और नियंत्रण अपकेंद्रित्र.
- नमूने एक spectrophotometrically उपायटी 540 1ml प्लास्टिक cuvettes का उपयोग spectrophotometry के लिए खाली के रूप में नियंत्रण का उपयोग कर एनएम.
- उपयुक्त डेटा विश्लेषण और रेखांकन सॉफ्टवेयर (जैसे Kaleidagraph, सिनर्जी सॉफ्टवेयर) का उपयोग एक मानक वक्र उत्पन्न करता है. आर 0.99 या अधिक के 2 मूल्यों वांछनीय हैं. डेटा absorbance के रूप एसिटाइल फॉस्फेट वर्तमान की μmoles बनाम 540 एनएम पर प्लॉट किए जाते है.
3. एसीटेट kinase गतिविधि के लिए परख
- वर्णित समाधान का उपयोग करना, एक प्रतिक्रिया मिश्रण युक्त 0.1 mol / एल Tris बफर, 10 mmol / L मैग्नीशियम क्लोराइड, 5 mmol / एल ADP, और 2 mmol / एल एसिटाइल फॉस्फेट के अंतिम एकाग्रता तैयार करते हैं. एक 10 एमएल प्रतिक्रिया मिश्रण 8.2 एमएल DDH 2 हे, 1.0 एमएल Tris समाधान, 0.1 एमएल मैग्नीशियम क्लोराइड समाधान, 0.5 एमएल ADP समाधान, और 0.2 एमएल एसिटाइल फॉस्फेट समाधान की आवश्यकता होगी. 300 microcentrifuge ट्यूबों μl aliquots में प्रतिक्रिया मिश्रण वितरित. गतिज सब्सट्रेट सांद्रता के मापदंडों और अनुकूलन के निर्धारण के लिए किया जा सकता है, एक सब्सट्रेट हैविविध और अन्य प्रतिक्रियाओं में एक निरंतर एकाग्रता में आयोजित.
- 37 पर 1 मिनट के लिए प्रतिक्रियाओं पूर्व सेते ° सी गर्मी ब्लॉक में.
- प्रतिक्रिया करने के लिए एंजाइम की एक वांछित राशि जोड़ें और तुरंत 37 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक ट्यूब वापसी. इसके अलावा नियंत्रण के लिए जो कोई एंजाइम जोड़ा जाता है प्रतिक्रिया शामिल हैं. यदि कई प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन कर रहे हैं, विशिष्ट समय अंतराल पर ट्यूब एंजाइम जोड़ने. समय का ट्रैक रखने के लिए सुनिश्चित करें. (नोट: एंजाइम की राशि के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए सुनिश्चित करें कि एसिटाइल फॉस्फेट या ADP सब्सट्रेट के सभी समाप्त नहीं किया जाएगा अनुकूलित किया जा आवश्यकता होगी - चर्चा अनुभाग देखें)
- 5 मिनट के बाद, प्रत्येक प्रतिक्रिया और नियंत्रण, मिश्रण hydroxylamine हाइड्रोक्लोराइड समाधान के 50μl जोड़ने के लिए, और एक 60 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक में ट्यूबों की जगह. यदि कई प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन किया जा रहा है, यह एक ही समय के अंतराल पर किया जाना चाहिए के रूप में एंजाइम जोड़ा गया है.
- 60 पर 5 मिनट के लिए और नियंत्रण प्रतिक्रियाओं सेते डिग्री सेल्सियस
- 100 & जोड़ेंम्यू, प्रत्येक प्रतिक्रिया और नियंत्रण, मिश्रण, प्रयोगशाला बेंच पर एक ट्यूब रैक में और जगह के लिए विकास के समाधान के एल. रंग कम से कम 1 मिनट के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दें.
- 1 मिनट के लिए 18,000 XG पर एक microcentrifuge में सभी ट्यूबों अपकेंद्रित्र.
- Spectrophotometrically 540 एनएम का उपयोग 1ml प्लास्टिक cuvettes और एसिटाइल फॉस्फेट मानक वक्र की तुलना द्वारा एसिटाइल फॉस्फेट वर्तमान की राशि का निर्धारण उपाय नमूने हैं.
- एसिटाइल फॉस्फेट समाप्त सब्सट्रेट की राशि एसिटाइल फॉस्फेट के एंजाइम की कमी नियंत्रण में मौजूद एसिटाइल फॉस्फेट की राशि से enzymatic प्रतिक्रिया के बाद शेष राशि subtracting द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. डेटा उपयुक्त डेटा रेखांकन और सॉफ्टवेयर (जैसे Kaleidagraph, सिनर्जी सॉफ्टवेयर) का उपयोग कर विश्लेषण प्रदर्शन. 0.97 की तुलना में अधिक से अधिक के अनुसंधान 2 मूल्यों वांछनीय हैं.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
इस परख के उद्देश्य से प्रत्यक्ष में एसीटेट kinase गतिविधि को मापने के लिए हैएसीटेट गठन के आयन. यह एसिटाइल फॉस्फेट सब्सट्रेट की खपत को मापने के द्वारा किया जाता है, के रूप में वहाँ कोई आसान, एसीटेट के उत्पादन के लिए प्रत्यक्ष माप है. Acetyl enzymatic प्रतिक्रिया के दौरान एक निश्चित समय के बाद शेष फॉस्फेट एसिटाइल hydroxamate करने के लिए और बाद में ferric hydroxamate जटिल है, जो कि 540 एनएम पर मापा जा सकता है है एक लाल रंग (चित्रा 2) है बदल जाती है. μmoles मानकों में एसिटाइल फॉस्फेट वर्तमान बनाम मानक वक्र साजिश रचने absorbance एसिटाइल प्रत्येक प्रतिक्रिया में शेष फॉस्फेट की राशि निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. मानक वक्र शून्य बिंदु के माध्यम से रैखिक होना चाहिए. चित्रा 3 में दिखाया गया एक प्रतिनिधि मानक वक्र 1.2332 μmole एसिटाइल फॉस्फेट वर्तमान और 0.99 की एक आर मान 2 प्रति absorbance इकाइयों की एक ढलान है, रेखीय समीकरण में अच्छी तरह से फिट बैठता है डेटा का संकेत है. मानक वक्र डेटा के लिए रेखीय फिट करने के लिए समीकरण प्रतिक्रिया में शेष एसिटाइल फॉस्फेट की मात्रा की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. μmolesएसिटाइल फॉस्फेट की खपत एसिटाइल नियंत्रण प्रतिक्रिया में एंजाइम और एसिटाइल फॉस्फेट के μmoles enzymatic प्रतिक्रिया के बाद शेष कमी मौजूद फॉस्फेट के μmoles के बीच अंतर के रूप में निर्धारित किया जाता है.
शुद्ध, पुनः संयोजक एम. thermophila एसीटेट kinase वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग assayed किया गया था . चित्रा 4 में दिखाया गया है प्रयोग के लिए, ADP की एकाग्रता 5 mmol / एल में लगातार आयोजित किया गया था और प्रतिक्रिया में एसिटाइल फॉस्फेट की एकाग्रता एसिटाइल फॉस्फेट के लिए कश्मीर मीटर निर्धारित करने के लिए विविध किया गया था. जैसी उम्मीद थी, इस प्रयोग को दर्शाता है कि एंजाइम प्रत्येक सब्सट्रेट के लिए मानक Michaelis - Menten की तरह कैनेटीक्स इस प्रकार है और एक अतिपरवलयिक संतृप्ति वक्र का उत्पादन जब एसिटाइल फॉस्फेट एकाग्रता बनाम गतिविधि की साजिश रचने. एसिटाइल फॉस्फेट के लिए स्पष्ट कश्मीर मीटर मूल्य 0.27 ± 0.01 mmol / एल, जो 0.47 के प्रकाशित कश्मीर मीटर मूल्य लिए कृपापूर्वक तुलना ± 0.01 mmol / L युग्मित के रूप में उपयोग13 कहना.
सीधे परख भी एसीटेट kinases है कि एटीपी, जो संभव मानक मिलकर परख का उपयोग नहीं है के अलावा अन्य substrates उपयोग की गतिविधि को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पुनः संयोजक ई. शुद्ध हिस्टोलिटिका एसीटेट 16 kinase, जो एसीटेट के गठन की दिशा में मैं बजाय पीपी एटीपी का उत्पादन इस ADP की जगह में सोडियम फॉस्फेट का उपयोग परख के अधीन था . प्रतिक्रिया में सोडियम फास्फेट की एकाग्रता 0.2 mol / एल में लगातार आयोजित की गई थी और एसिटाइल फॉस्फेट एकाग्रता विविध गया. एम. के लिए के रूप में thermophila एसीटेट kinase, ई. हिस्टोलिटिका एसीटेट kinase एसिटाइल फॉस्फेट के लिए Michaelis - Menten की तरह कैनेटीक्स पीछा किया और एक अतिपरवलयिक संतृप्ति वक्र (चित्रा 5) मनाया गया . एसिटाइल फॉस्फेट के लिए स्पष्ट कश्मीर मीटर मूल्य 0.50 ± 0.006 mmol / एल रीव्स और गुथरी 15 .06 देशी एंजाइम के लिए एसिटाइल फॉस्फेट के लिए mmol / एल के एक कश्मीर मीटर मूल्य निर्धारित, कैसे कभी उनके एंजाइम केवल आंशिक रूप से शुद्ध था और उनकी परख चार युग्मन एंजाइमों जो भी केवल आंशिक रूप से शुद्ध शामिल है. इस प्रकार, यह मुश्किल है के लिए सीधे इन मूल्यों की तुलना.
प्रोटोकॉल योजना
- एक एसिटाइल फॉस्फेट मानक वक्र उत्पन्न
- वांछित एकाग्रता के लिए एंजाइम पतला
- Microcentrifuge ट्यूबों प्रतिक्रिया मिश्रण और विभाज्य 300 μl तैयार
- 37 में Preincubate प्रतिक्रियाओं ° 1 मिनट के लिए सी
- विशिष्ट समय अंतराल पर एंजाइम जोड़कर प्रतिक्रियाओं प्रारंभ
- एक ही अंतराल पर hydroxylamine जोड़ें प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए और 60 में सेते ° 5 मिनट के लिए सी
- Ferric क्लोराइड / रंग विकास के लिए trichloroacetic एसिड समाधान जोड़ें
- 1 मिनट के लिए 18,000 XG पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र
- 540 एनएम absorbance के उपाय
- मानक वक्र की तुलना द्वारा एसिटाइल फॉस्फेट की खपत राशि निर्धारित
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चित्रा 1. प्रोटोकॉल योजना
चित्रा 2 Acetyl फॉस्फेट मानकों. एसिटाइल फॉस्फेट की बढ़ती सांद्रता hydroxylamine और रंग के रूप में वर्णित विकसित किया गया था के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की गई. एसिटाइल फॉस्फेट कमी नियंत्रण चमकीले पीले रंग की है, और प्रतिक्रियाओं एसिटाइल फॉस्फेट की बढ़ती मात्रा से युक्त क्रमिक रंग में गहरा रहे हैं. यह रंग बदलने के 540 एनएम पर मापा जाता है.
चित्रा 3 नमूना एसिटाइल फॉस्फेट मानक वक्र. एसिटाइल फॉस्फेट की मात्रा बदलती hydroxylamine के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की गई और रंग विकास के समाधान और absorbance के 540 एनएम पर मापा गया था. μmoles एसिटाइल फॉस्फेट बनाम 540 एनएम पर absorbance के प्लॉट किया गया था और डेटा के लिए एक रेखीय फिट लागू किया गया था./ P>
चित्रा 4 एसिटाइल फॉस्फेट के एटीपी उत्पादन एम. द्वारा उपयोगिता. thermophila एसीटेट kinase. Enzymatic गतिविधि एसिटाइल फॉस्फेट के अलग सांद्रता के साथ 5 mmol / एल ADP की उपस्थिति में एसीटेट गठन की दिशा में निर्धारित किया गया था. एसिटाइल फॉस्फेट भस्म की राशि प्रतिक्रिया में एसिटाइल फॉस्फेट की प्रारंभिक राशि और एसिटाइल फॉस्फेट के enzymatic प्रतिक्रिया के बाद शेष राशि के बीच अंतर के रूप में निर्धारित किया गया था. Assays त्रुटि दिखाया सलाखों के साथ तीन प्रतियों में प्रदर्शन किया गया.
चित्रा 5 एसिटाइल फॉस्फेट के पीपी द्वारा उपयोगिता मैं उत्पादन ई. हिस्टोलिटिका एसीटेट kinase. एसीटेट गठन की दिशा में enzymatic गतिविधि 0 की उपस्थिति में निर्धारित किया गया था.2 mol / एल एसिटाइल फॉस्फेट की सांद्रता के साथ अलग सोडियम फॉस्फेट. एसिटाइल फॉस्फेट भस्म की राशि प्रतिक्रिया में एसिटाइल फॉस्फेट की प्रारंभिक राशि और एसिटाइल फॉस्फेट के enzymatic प्रतिक्रिया के बाद शेष राशि के बीच अंतर के रूप में निर्धारित किया गया था. Assays त्रुटि दिखाया सलाखों के साथ तीन प्रतियों में प्रदर्शन किया गया.
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Discussion
इस परख में एसिटाइल फॉस्फेट का पता लगाने के hydroxylamine हाइड्रोक्लोराइड की एक पर्याप्त एकाग्रता और एकाग्रता और ferric क्लोराइड समाधान के अम्लता पर निर्भर है. परख मात्रा का परिवर्तन इन दोनों घटकों के पुनर्विचार की आवश्यकता होगी. एंजाइमी प्रतिक्रियाओं यहाँ वर्णित 37 में प्रदर्शन किए गए थे ° सी hydroxylamine समाप्ति पर 60 डिग्री सेल्सियस के 5 मिनट के लिए प्रदर्शन के साथ. इस उच्च तापमान एसिटाइल hydroxamate शेष एसिटाइल फॉस्फेट की तेजी से रूपांतरण के लिए अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है. रंग विकास और absorbance के कदम माप के समय कम महत्वपूर्ण है, और hydroxylamine समाधान के अलावा निम्नलिखित के रूप में छोटे रूप में 5 मिनट और 15 मिनट में किया जा सकता है. नमूने absorbance के पढ़ने से पहले centrifuged जाना चाहिए, क्योंकि नमूने की अम्लता एंजाइम की वर्षा करने के लिए नेतृत्व और एक झूठा उच्च turbidity के बजाय वास्तविक रंग बदलने की वजह से पढ़ने का उत्पादन कर सकते हैं हो सकता है.विकसित प्रतिक्रियाओं के टूटने के लिए 10-15 मिनट के बाद हो शुरू हो जाएगा.
एंजाइम कैनेटीक्स की जांच करने के लिए इस परख के प्राथमिक जटिलताओं एंजाइम की राशि का उपयोग करने के लिए और समय की लंबाई करने के लिए प्रतिक्रिया के पहले कदम चलाने का निर्धारण कर रहे हैं. ये प्रत्येक ऐसी है कि गतिविधि का स्तर इतना उच्च कि एसिटाइल फॉस्फेट सब्सट्रेट के सभी भस्म हो जाता है नहीं है एंजाइम के लिए empirically निर्धारित करना चाहिए. एक गतिज वक्र में प्रत्येक प्रतिक्रिया बिंदु के लिए प्रतिशत एसिटाइल फॉस्फेट की खपत के लिए सावधान ध्यान दिया जाना चाहिए. आम तौर पर, एक गतिज वक्र पर विभिन्न घटक के कम सांद्रता एसिटाइल फॉस्फेट 90 प्रतिशत या थोड़ा ऊपर की खपत में परिणाम है, जबकि एसिटाइल फॉस्फेट saturating सब्सट्रेट सांद्रता में खपत 10 प्रतिशत या थोड़ा कम दृष्टिकोण चाहिए चाहिए. एक बार एंजाइम एकाग्रता अनुकूलित है, गतिज स्थिरांकों के निर्धारण के लिए सब्सट्रेट सीमा तो निर्धारित किया जा सकता है.
पीएसीटेट एसीटेट के गठन की दिशा में kinase गतिविधि को मापने के लिए छला तरीकों मिलकर assays के उपयोग को शामिल किया गया. इन विधियों गतिज युग्मन (ओं) एंजाइम, परख जिसका शर्तों (पीएच, ईओण ताकत, तापमान, आदि) के हित एंजाइम के लिए इष्टतम परख शर्तों के साथ असंगत हो सकता है की गतिविधि पर निर्भरता की वजह से गणना करने के लिए सम्मान के साथ समस्याग्रस्त हैं . इसके अलावा, inhibitors के साथ अध्ययन के लिए एक सीधा परख का उपयोग मुद्दों है कि युग्मन एंजाइमों के निषेध से उत्पन्न कर सकता से बचने के सकता है. कुल मिलाकर, इस परख उपयोगी न केवल एसीटेट kinase के लिए हो सकता है, चाहिए, लेकिन किसी भी एंजाइम है कि एसिटाइल फॉस्फेट या अन्य सक्रिय एसिटाइल या propionyl-CoA जैसे छोटे श्रृंखला एसाइल substrates, propionyl फॉस्फेट, और एसिटाइल एएमपी, जो सभी के प्रतिक्रियाशील रहे हैं इस्तेमाल के लिए hydroxylamine साथ. इन मामलों में, मानक वक्र एसिटाइल फॉस्फेट के साथ उचित एसाइल के बजाय सब्सट्रेट के साथ उत्पन्न होगा.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम NSF 0920274 # पुरस्कार और दक्षिण कैरोलिना प्रयोग स्टेशन (एससी 1,700,340) परियोजना KSS के द्वारा समर्थित किया गया था. इस कागज तकनीकी योगदान सं 5929 Clemson विश्वविद्यालय प्रयोग स्टेशन के.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetyl phosphate | Sigma-Aldrich | 01409 | Lithium Salt (97% ) |
| Sodium phosphate monobasic (dehydrate) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S381 | |
| Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S374 | |
| Magnesium chloride (hexahydrate) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | M33 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific, Inc. | B152 | |
| Ferric chloride (hexahydrate) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | I88 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A324 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Thermo Fisher Scientific, Inc. | H330 | |
Adenosine 5’-diphosphate sodium salt |
Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Biomate III Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 142982082 | Standard UV/Vis spectrophotometer |
References
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