Summary
En metode for bestemmelse av acetat kinase aktivitet er beskrevet. Denne analysen benytter en direkte reaksjon for å bestemme enzymaktivitet og kinetikk av acetat kinase i acetat-forming retning med forskjellige phosphoryl akseptorer. Videre kan denne metoden benyttes for analysere andre acetyl fosfat eller acetyl-CoA utnytte enzymer.
Abstract
Acetat kinase, et medlem av acetat og sukker kinase-Hsp70-aktin (ASKHA) enzym superfamily 1-5, er ansvarlig for reversibel fosforylering av acetate til acetyl fosfat utnytte ATP som substrat. Acetat kinaser er allestedsnærværende i Bakterier, som finnes i en slekt av Archaea, og er også til stede i mikrober av Eukarya 6. Den mest godt karakterisert acetate kinase er at fra metan-produserende archaeon Methanosarcina thermophila 7-14. En acetate kinase som bare kan benytte PP jeg, men ikke ATP i acetyl fosfat-forming retning har vært isolert fra Entamoeba histolytica, den forårsaker agent for amøbedysenteri, og har så langt bare blitt funnet i denne slekten 15,16.
I retning av acetyl fosfat formasjonen, er acetate kinase aktivitet vanligvis målt ved hjelp av hydroxamate analysen, først beskrevet av Lipmann17-20, en kombinert analyse hvor konvertering av ATP til ADP er koblet til oksidasjon av NADH til NAD + av enzymene pyruvat kinase og laktat dehydrogenase 21,22, eller en analyse som måler utslipp av uorganisk fosfat etter reaksjonen til acetyl fosfat produktet med hydroksylamin 23. Aktiviteten i det motsatte, er acetate-forming retning målt ved kopling ATP dannelse fra ADP til reduksjon av NADP + til NADPH av enzymer hexokinase og glukose 6-fosfat dehydrogenase 24.
Her beskriver vi en metode for påvisning av acetat kinase aktivitet i retning av acetat formasjon som ikke krever kopling enzymer, men er i stedet basert på direkte fastsettelse av acetyl fosfat forbruk. Etter enzymatisk reaksjon, er gjenværende acetyl fosfat omdannes til en Ferric hydroxamate kompleks som kan måles spektrofotometrisk, som for hydroxamate analysen. Derfor, i motsetning til standard kombinert analysen for denne retningen er avhengig av produksjon av ATP fra ADP, kan dette direkte analysen brukes for acetate kinaser som produserer ATP eller PP jeg.
Protocol
Den generelle ordningen med denne protokollen er skissert i figur 1.
1. Løsning Forberedelse for Standard Kurver og Assays
- Forbered 100 mL av en 2 mol / L løsning av hydroksylamin-HCl. Vei opp 13,9 g hydroksylamin hydroklorid (MW 69,49 g / mol) og oppløses i ca 50 mL destillert-avionisert vann (DDH 2 O). Juster pH til 7,0 med kaliumhydroksid pellets eller en konsentrert løsning. Ta det endelige volumet til 100 ml. Løsningen kan oppbevares i romtemperatur i opptil 30 dager eller ved 4 ° C i opp til 90 dager.
- Forbered 100 mL av en Ferric klor / saltsyre løsning. Vei opp 13,5 g Ferric klorid (MW 270,32 g / mol) og oppløses i ca 50 mL DDH 2 O. Legg til 41,3 mL konsentrert saltsyre (12,1 mol / L) og få til en endelig volum på 100 ml. Den endelige konsentrasjonen av Ferric klorid vil være 0,5 mol / L og den endelige konsentrasjonen av saltsyre vil være 5 mol/ L. Løsningen lagres ved romtemperatur.
- Forbered 100 mL av en 1,84 mol / L løsning av trichoroacetic syre. Vei opp 30,0 g trikloreddiksyre (MW 163,39 g / mol), oppløses i DDH 2 O og bringe det endelige volumet til 100 ml. Løsningen lagres ved romtemperatur.
- Forbered 5 mL av en 0,1 mol / L acetyl fosfat løsning. Vei opp 0,092 g acetyl fosfat (MW 184,06 g / mol), oppløses i DDH 2 O og bringe det endelige volumet til 5 ml. Delmengde løsningen på Mikrosentrifugerør (0,25 ml per rør) og fryses ved -20 ° C til bruk. Tinte løsning bør legges på is og kan brukes i ca 1 time. Acetyl fosfat løsning som har vært tint må ikke fryses på nytt, og gjenbrukes.
- Forbered 5 mL av en 0,1 mol / L løsning av ADP. Vei opp 0,24 g av ADP (MW 472,5 g / mol), oppløses i DDH 2 O, og bringe det endelige volumet til 5 ml. Delmengde løsningen i Mikrosentrifugerør (0,5 ml per rør) og fryses ved -20 ° C inntilbruk. Ha tinte løsning på is inntil de skal brukes.
- Forbered 50 mL av en 1 mol / L løsning av Tris. Vei opp 6,06 g Tris (MW 121,14 g / mol), og oppløses i 40 ml DDH 2 O. Juster pH av løsningen til 7,0 med saltsyre og bringe endelig volum til 50 ml. Oppbevares løsning ved romtemperatur.
- Forbered 10 mL av en 1 mol / L magnesiumklorid løsning. Vei opp 2,03 g magnesiumklorid (MW 203,31 g / mol), oppløses i DDH 2 O, og bringe endelig volum til 10 ml. Oppbevar løsningen ved romtemperatur.
- Forbered 25 mL utbyggingsløsning ved å blande like mengder av Ferric klor / saltsyre løsningen og trikloreddiksyre løsningen. Utbyggingsløsningen bør være forberedt på frisk hver dag og lagres ved romtemperatur.
2. Utarbeidelse av en Acetyl Phosphate standardkurve
- En acetyl fosfat standard kurve er generert ved hjelp av kjente mengder av acetyl fosfat. En standard kurve seks til eight poeng er egnet. Standardene bør ligge mellom 0,03 μmoles til 0,9 μmoles per 300 mL, som korrelerer til endelig konsentrasjon på 0,1 til 3 mmol / L. Fortynn acetyl fosfat stamløsning til de riktige konsentrasjoner i 100 mM Tris løsning i en endelig volum på 300 mL. En kontroll prøve uten acetyl fosfat bør også være forberedt.
- Inkuber hver standard og kontroll ved 37 ° C i en varme blokk i 1 minutt.
- Tilsett 50 mL av hydroksylamin hydroklorid løsningen til hver standard og kontroll og bland ved å riste tre ganger. Plasser standard i en 60 ° C varme blokk og inkuberes i fem minutter.
- Tilsett 100 mL av utbyggingsløsning til standarder og kontroll, bland ved å riste tre ganger, og la fargen å utvikle for minst ett minutt ved romtemperatur.
- Sentrifuge alle standarder og kontroll i en mikrosentrifuge på 18 000 xg i 1 minutt.
- Mål prøvene spektrofotometrisk ent 540 nm ved hjelp av 1 ml plast kyvetter, bruke kontrollen som den tomme for spektrofotometri.
- Generer en standard kurve ved hjelp av passende data analyse og grafer programvare (f.eks Kaleidagraph, Synergy Software). R 2 verdier av 0,99 eller høyere er ønskelig. Dataene er plottet som absorbans ved 540 nm versus μmoles av acetyl fosfat til stede.
3. Assay for Acetat kinase aktivitet
- Ved hjelp av løsningene som er beskrevet, utarbeide en reaksjon blanding som inneholder en endelig konsentrasjon på 0,1 mol / L Tris-buffer, 10 mmol / L magnesiumklorid, 5 mmol / L ADP, og 2 mmol / L acetyl fosfat. En 10 mL reaksjonsblandingen vil kreve 8,2 mL DDH 2 O, 1,0 ml Tris løsning, 0,1 mL magnesiumklorid løsning, 0,5 mL ADP løsning, og 0,2 ml acetyl fosfat løsning. Fordel reaksjonsblandingen i 300 mL alikvoter til Mikrosentrifugerør. For bestemmelse av kinetiske parametre og optimalisering av substrat konsentrasjoner, kan man substrat værevariert og de andre holdt på en konstant konsentrasjon i reaksjonene.
- Pre-Inkuber reaksjonene i 1 minutt ved 37 ° C i en varme blokk.
- Legg til en ønsket mengde enzym til reaksjonen og umiddelbart returnere slangen til 37 ° C varme blokk. Inkluderer også en kontroll reaksjon som ingen enzymet er lagt til. Dersom flere reaksjoner er utført, legger enzym til rørene på bestemte tidsintervaller. Pass på å holde styr på tiden. (MERK: Mengden av enzym som skal brukes må være optimalisert for å sikre at alle acetyl fosfat eller ADP Underlaget vil ikke bli tømt - se Discussion seksjon)
- Etter 5 minutter, tilsett 50μl av hydroksylamin hydroklorid løsningen til hver reaksjon og kontroll, mikse og plasserer rørene i en 60 ° C varme blokk. Dersom flere reaksjoner blir utført, bør dette gjøres på samme tidsintervall som enzymet ble lagt til.
- Inkuber reaksjonene og kontroll i 5 minutter ved 60 ° C.
- Tilsett 100 &mu, L av utbyggingsløsning til hver reaksjon og kontroll, mix, og plasser i et rør stativ på lab benken. La fargen å utvikle for minst 1 minutt.
- Sentrifuge alle rør i en mikrosentrifuge på 18 000 xg i 1 minutt.
- Mål prøver spektrofotometrisk ved 540 nm ved hjelp av 1 ml plast kyvetter og bestemme mengden av acetyl fosfat til stede i forhold til acetyl fosfat standard kurve.
- Mengden av acetyl fosfat substrat oppbrukt kan bestemmes ved å trekke beløpet av acetyl fosfat som gjenstår etter den enzymatiske reaksjonen fra mengden acetyl fosfat til stede i kontroll mangler enzymet. Utføre data analyse ved hjelp av egnede data og grafer programvare (f.eks Kaleidagraph, Synergy Software). R 2 verdier større enn 0,97 er ønskelig.
Fire. Representant Resultater:
Hensikten med denne analysen er å måle acetate kinase aktivitet i direkteion av acetat formasjon. Dette gjøres ved å måle forbruk av acetyl fosfat underlaget, så det er ingen enkel, direkte måling for acetate produksjon. Acetyl fosfat som gjenstår etter en gitt tid under enzymatiske reaksjonen omdannes til acetyl hydroxamate og senere til Ferric hydroxamate kompleks, som har en rødlig farge (figur 2) som kan måles ved 540 nm. Standardkurven plotte absorbans mot μmoles acetyl fosfat til stede i de standarder som blir brukt til å bestemme mengden av acetyl fosfat igjen i hver reaksjon. Standarden kurven bør være lineær gjennom nullpunktet. En representant standard kurve er vist i Figur 3 har en helling på 1,2332 absorbans enheter per μmole acetyl fosfat til stede og en R 2 verdi på 0,99, indikerer dataene passer den lineære ligningen godt. Ligningen for den lineære passer til standard kurve data brukes for å beregne mengden av acetyl fosfat igjen i reaksjonen. Den μmolesav acetyl fosfat forbrukes bestemmes som differansen mellom μmoles av acetyl fosfat til stede i kontroll reaksjonen mangler enzymet og μmoles av acetyl fosfat som gjenstår etter den enzymatiske reaksjonen.
Renset, rekombinant M. thermophila acetate kinase ble analysert ved hjelp av den beskrevne protokollen. For forsøket er vist i figur 4, var konsentrasjonen av ADP holdt konstant på 5 mmol / L og konsentrasjonen av acetyl fosfat i reaksjonen var variert å bestemme K m for acetyl fosfat. Som forventet viser dette eksperimentet at enzymet følger standard Michaelis-Menten-liknende kinetikk for hver substrat og produsert en hyperbolsk metning kurve når plotting aktivitet versus acetyl fosfat konsentrasjon. Den tilsynelatende K m verdi for acetyl fosfat var 0.27 ± 0,01 mmol / L, som sammenligner gunstig til publiserte K m verdien av 0,47 ± 0,01 mmol / L med kombinert somsier 13.
Den direkte analysen kan også brukes til å måle aktiviteten av acetat kinaser som utnytter andre underlag enn ATP, som ikke er mulig å bruke standard kombinert analysen. Renset rekombinant E. histolytica acetate 16 kinase, som produserer PP i stedet for ATP i acetat-forming retning, ble utsatt for denne analysen bruker natrium fosfat i stedet for ADP. Konsentrasjonen av natrium fosfat i reaksjonen ble holdt konstant på 0,2 mol / L og acetyl fosfat konsentrasjonen var variert. Som for M. thermophila acetate kinase, E. histolytica acetate kinase fulgt Michaelis-Menten-liknende kinetikk for acetyl fosfat og en hyperbolsk metning kurve ble observert (Figur 5). Den tilsynelatende K m verdi for acetyl fosfat var 0.50 ± 0,006 mmol / L. Reeves og Guthrie 15 fastsettes en K m verdi på 0,06 mmol / L for acetyl fosfat for den innfødte enzymet, hvordan noensinne, var deres enzymet bare delvis renset og deres assay involverte fire kopling enzymer som også var bare delvis renset. Dermed er det vanskelig å direkte sammenligne disse verdiene.
Protokoll Scheme
- Generere en acetyl fosfat standardkurve
- Fortynn enzym til ønsket konsentrasjon
- Klargjør reaksjonsblandingen og delmengde 300 mL til Mikrosentrifugerør
- Preincubate reaksjoner ved 37 ° C i 1 minutt
- Begynn reaksjoner ved å legge til enzymet på bestemte tidsintervaller
- Legg hydroksylamin på samme intervaller for å stoppe reaksjoner og Inkuber ved 60 ° C i 5 minutter
- Legg Ferric klorid / trikloreddiksyre løsning for farge utvikling
- Sentrifugerør på 18 000 xg i 1 minutt
- Mål absorbansen ved 540 nm
- Bestem mengden av acetyl fosfat forbrukes i sammenligning til standard kurve
tp_upload/3474/3474fig1.jpg "/>
Figur 1. Protokoll Scheme
Figur 2. Acetyl fosfat standarder. Økende konsentrasjoner av acetyl fosfat ble det reagert med hydroksylamin og farge ble utviklet som beskrevet. Kontrollen mangler acetyl fosfat er lys gul, og reaksjoner som inneholder økende mengder av acetyl fosfat er suksessivt mørkere i fargen. Denne fargen endringen måles ved 540 nm.
Figur 3. Sample acetyl fosfat standardkurve. Varierende mengder acetyl fosfat ble det reagert med hydroksylamin og fargen utbyggingsløsning og absorbansen ble målt ved 540 nm. Absorbansen ved 540 nm versus μmoles acetyl fosfat var plottet og en lineær tilpasning til data som ble brukt. </ P>
Figur 4. Utnyttelse av acetyl fosfat fra ATP-produserende M. thermophila acetate kinase. Enzymatisk aktivitet ble bestemt i retning av acetat-formasjonen i nærvær av 5 mmol / L ADP med varierende konsentrasjoner av acetyl fosfat. Mengden av acetyl fosfat forbrukes ble fastsatt som differansen mellom start mengden av acetyl fosfat i reaksjonen og mengden acetyl fosfat som gjenstår etter den enzymatiske reaksjonen. Analysene ble utført i tre eksemplarer med feilfelt vist.
Figur 5. Utnyttelse av acetyl fosfat ved PP i-produserende E. histolytica acetate kinase. Enzymatisk aktivitet i retning av acetat formasjonen var bestemt i nærvær av 0.2 mol / l natrium fosfat med varierende konsentrasjoner av acetyl fosfat. Mengden av acetyl fosfat forbrukes ble fastsatt som differansen mellom start mengden av acetyl fosfat i reaksjonen og mengden acetyl fosfat som gjenstår etter den enzymatiske reaksjonen. Analysene ble utført i tre eksemplarer med feilfelt vist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Påvisning av acetyl fosfat i denne analysen er avhengig av en tilstrekkelig konsentrasjon av hydroksylamin hydroklorid og konsentrasjon og surhet av Ferric klorid løsningen. Endring av analysen volum vil kreve ny vurdering av begge disse komponentene. Den enzymatiske reaksjoner som beskrives her ble utført ved 37 ° C med hydroksylamin oppsigelse utført ved 60 ° C i 5 minutter. Dette høyere temperatur er avgjørende for å tillate rask konvertering av de resterende acetyl fosfat til acetyl hydroxamate. Tidspunktet for farge utvikling trinnet og måling av absorbans er mindre kritisk, og kan utføres på så lite som 5 minutter og opp til 15 minutter etter tilsetting av hydroksylamin løsningen. Prøvene skal sentrifugeres før du leser absorbansen, som surhet av prøven kan føre til utfelling av enzymet og kan produsere falske høye verdien skyldes turbiditet snarere enn faktiske fargeendring.Fordeling av de utviklede reaksjonene vil begynne å skje etter 10-15 minutter.
Den primære komplikasjoner av denne analysen for å undersøke enzymkinetikk er bestemmelse av mengde av enzymet å bruke og hvor lang tid til å kjøre første steg av reaksjonen. Disse må bestemmes empirisk for hvert enzym slik at aktivitetsnivået er ikke så høyt at alle acetyl fosfat underlaget er fortært. Nøye oppmerksomhet bør gis til prosent acetyl fosfat forbruk for hver reaksjon punkt i en kinetisk kurve. Vanligvis bør lavere konsentrasjoner av de ulike komponenten på en kinetisk kurve resultere i acetyl fosfat forbruk opp til 90 prosent eller litt over, mens forbruket av acetyl fosfat ved mette underlaget konsentrasjoner bør nærme seg 10 prosent eller litt mindre. Når enzymet konsentrasjonen er optimalisert, kan underlaget utvalg for bestemmelse av kinetiske konstantene da bestemmes.
Porrige metoder for måling av acetat kinase aktivitet i acetat-forming retning involverte bruk av koblede analyser. Disse metodene er problematisk med hensyn til kinetiske beregninger på grunn av avhengighet av aktiviteten av koblingen enzym (e), hvis analysen forhold (pH, ionisk styrke, temperatur, etc.) kan være uforenlig med optimale analysen betingelsene for enzymet av interesse . I tillegg kan bruk av en direkte analyse for studier med hemmere unngå problemer som kan oppstå fra hemming av koblingen enzymer. Samlet sett bør denne analysen være nyttig ikke bare for acetate kinase, men for eventuelle enzym som bruker acetyl fosfat eller andre aktiveres kort kjede acyl underlag som acetyl-eller propionyl-CoA, propionyl fosfat, og acetyl-AMP, som alle er reaktive med hydroksylamin. I disse tilfeller vil standardkurven bli generert med riktig acyl underlaget i stedet for med acetyl fosfat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NSF award # 0920274 og South Carolina Experiment Station Project (SC-1700340) til KSS. Dette papiret er tekniske bidrag nr. 5929 av Clemson University Experiment Station.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetyl phosphate | Sigma-Aldrich | 01409 | Lithium Salt (97% ) |
| Sodium phosphate monobasic (dehydrate) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S381 | |
| Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S374 | |
| Magnesium chloride (hexahydrate) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | M33 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific, Inc. | B152 | |
| Ferric chloride (hexahydrate) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | I88 | |
| Trichloroacetic acid | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A324 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Thermo Fisher Scientific, Inc. | H330 | |
Adenosine 5’-diphosphate sodium salt |
Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Biomate III Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 142982082 | Standard UV/Vis spectrophotometer |
References
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A. An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A. Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: the hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases. Protein Sci. 2, 31-40 (1993).
- Buss, K. A. Urkinase: structure of acetate kinase, a member of the ASKHA superfamily of phosphotransferases. J. Bacteriol. 183, 680-686 (2001).
- Hurley, J. H. The sugar kinase/heat shock protein 70/actin superfamily: implications of conserved structure for mechanism. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25, 137-162 (1996).
- Holmes, K. C., Sander, C., Valencia, A. A new ATP-binding fold in actin, hexokinase and Hsc70. Trends. Cell. Biol. 3, 53-59 (1993).
- Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. Acetate kinase: not just a bacterial enzyme. Trends. Microbiol. 14, 249-253 (2006).
- Aceti, D. J., Ferry, J. G. Purification and characterization of acetate kinase from acetate-grown Methanosarcina thermophila. Evidence for regulation of synthesis. J. Biol. Chem. 263, 15444-15448 (1988).
- Latimer, M. T., Ferry, J. G. Cloning, sequence analysis, and hyperexpression of the genes encoding phosphotransacetylase and acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Bacteriol. 175, 6822-6829 (1993).
- Ingram-Smith, C., Barber, R. D., Ferry, J. G. The role of histidines in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 275, 33765-33770 (2000).
- Miles, R. D., Iyer, P. P., Ferry, J. G. Site-directed mutational analysis of active site residues in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 276, 45059-45064 (2001).
- Miles, R. D., Gorrell, A., Ferry, J. G. Evidence for a transition state analog, MgADP-aluminum fluoride-acetate, in acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 277, 22547-22552 (2002).
- Ingram-Smith, C. Characterization of the acetate binding pocket in the Methanosarcina thermophila acetate kinase. J. Bacteriol. 187, 2386-2394 (2005).
- Gorrell, A., Lawrence, S. H., Ferry, J. G. Structural and kinetic analyses of arginine residues in the active site of the acetate kinase from Methanosarcina thermophila. J. Biol. Chem. 280, 10731-10742 (2005).
- Gorrell, A., Ferry, J. G. Investigation of the Methanosarcina thermophila acetate kinase mechanism by fluorescence quenching. Biochemistry. 46, 14170-14176 (2007).
- Reeves, R. E., Guthrie, J. D. Acetate kinase (pyrophosphate). A fourth pyrophosphate-dependent kinase from Entamoeba histolytica. Biochem. Biophys. Res. Commun. 66, 1389-1395 (1975).
- Fowler, M. L. Kinetic and structural characterization of the novel PPi-dependent acetate kinase from the parasite Entamoeba histolytica. , Forthcoming (2011).
- Lipmann, F. Enzymatic synthesis of acetyl phosphate. J. Biol. Chem. 155, 55-70 (1944).
- Lipmann, F., Tuttle, L. C. A specific micromethod for determination of acyl phosphates. J. Biol. Chem. 159, 21-28 (1945).
- Lipmann, F., Jones, M. E., Black, S., Flynn, R. M. The mechanism of the ATP-CoA-acetate reaction. J. Cell. Physiol. Suppl. 41, 109-112 (1953).
- Rose, I. A., Grunberg-Manago, M., Korey, S. F., Ochoa, S. Enzymatic phosphorylation of acetate. J. Biol. Chem. 211, 737-756 (1954).
- Allen, S. H., Kellermeyer, R. W., Stjernholm, R. L., Wood, H. G. Purification and properties of enzymes involved in the proponic acid fermentation. Journal of Bacteriology. 87, 171-187 (1964).
- Clarke, P. M., Payton, M. A. An enzymatic assay for acetate in spent bacterial culture supernatants. Anal. Biochem. 130, 402-405 (1983).
- Mukhopadhyay, S., Hasson, M. S., Sanders, D. A. A continuous assay of acetate kinase activity: measurement of inorganic phosphate release generated by hydroxylaminolysis of acetyl phosphate. Bioorg. Chem. 36, 65-69 (2008).
- Nakajima, H., Suzuki, K., Imahori, K. Purification and properties of acetate kinase from Bacillus stearothermophilus. J. Biochem. 84, 193-203 (1978).
