Summary
该协议说明了牛尾骨器官培养的椎间盘的收获技术
Abstract
椎间盘（IVD）是连接脊椎椎脊柱关节。它的功能发送加载的脊椎和脊柱的灵活性。这三个车厢组成：最内层的髓核（NP）的纤维环（AF）和两个连接双方的NP和AF椎体软骨终板无所不包。退行性椎间盘疾病（DDD）和椎间盘突出引起的椎间盘源性疼痛，可能已被确定为在现代社会的一个主要问题。为了研究体外诊断试剂变性的可能机制，在机关与现场椎间盘细胞体外培养系统具有高度吸引力。 在完整的牛尾骨体外诊断试剂的体外培养，拥有先进的有关模型的系统，它允许的生物机械方面，在控制良好的生理和机械环境的研究。牛尾巴体外诊断可以比较容易取得较高的数字D是非常相似的细胞密度，细胞人口和尺寸方面与人类的腰椎体外诊断。然而，以前的牛尾椎的IVD收获技术，保留软骨终板和骨性终板失败后1-2天的文化，因为营养途径明显血块阻塞。体外诊断是最大的股骨头缺血性机关，因此，在NP细胞的营养物质是通过从相邻椎体的毛细血管芽完全依赖扩散。终板表面的骨碎片和血块的存在可以阻碍养分扩散到光盘和妥协的细胞活力的中心。我们集团成立了一个相对快速的协议“破解”出从尾部的体外诊断为污染低风险。我们能够通过外科手术的喷气灌洗系统，从而消除血凝块和切割碎片和非常有效地重开的营养扩散途径通透的新鲜切骨性终板表面体外诊断中心。要避免双方椎体骨生长板的存在和文化之前被删除。在这段视频中，我们概述了在制备过程中的关键步骤，并展示了一个成功的器官培养，保持14天免费肿胀文化下的细胞存活率高的关键。时，所使用的机械负荷生物反应器可以保持适当的机械环境的，可以延长培养时间。这里展示的技术可以扩展到其他动物，如猪，羊和leporine尾鳍和腰椎IVD隔离。
Protocol
1。椎间盘的收获
- 全长牛尾巴是从本地屠宰场获得，没有皮肤，因为皮肤的存在增加了受污染的机会（图2）如果可能的话。
- 准备大砧板，砧板的上方（图2）无菌工作站和仪器准备。
- 准备下的无菌层流罩无菌纱布蘸0.9％氯化钠氯化包含55mm的柠檬酸钠和投入以及每6孔板。
- 准备一个盆，并用自来水稀释1:100的优碘的解决方案。
- 沉浸在整个流域包含1％的优碘溶液5分钟的牛尾巴。
- 简要干尾，用无菌纱布放在无菌工作站。
- 小心地取出22＃手术刀刀片肌肉周围的尾巴。
- 印章远离尾巴的部分是没有必要，通常两端的尾巴，其中包含比较大和非常小体外诊断（图3）。
- 修剪进一步的肌肉和肌腱周围的体外诊断用手术刀刀片＃10。小心不要切光盘的外圆。
- 标记前手术皮肤标记的体外诊断试剂（这一步是可选的，它有助于确定我们的生物反应器的轴向旋转中心）。
- 找到移动的尾巴轻轻的体外诊断试剂和脊椎连接点。感觉沉闷的手术刀刀片IVD和骨之间的边界。裂解网站应该对脊椎的体外诊断试剂1-2毫米。广场定制的工业刀片座，切割现场（图4）。
- 顺劈斩，体外诊断试剂和脊椎定制的工业刀片座（图3）上敲敲打打。
- 重复的体外诊断椎体连接的另一端。
- 裹孤立的体外诊断用无菌纱布蘸含55mm的柠檬酸钠0.9％氯化钠氯化。
- 所需的样本数（通常大约6可以继续隔离的体外诊断试剂直径10-20毫米之间，收获）。
- 喷射灌洗系统（吉玛，INC。）连接无菌乳酸林格氏液，5L包装袋是一个有用的的大小（或者无菌PBS或0.9％生理盐水溶液）。
- 保持与镊子和喷射灌洗既终板表面的两侧，使用吉玛Pulsavac喷射灌洗系统（图1C）的体外诊断试剂。喷枪应终板表面30之间的角度拍摄 - 60 °左右，每边30年代。 （图1和7）
- 把体外诊断试剂的6孔培养板，敷以浸湿纱布，而射流清洗另一张光盘样本。
- 体外诊断是器官培养和下游的应用程序（例如，细胞活力，机械负荷，机关文化）（图1d）。
2。代表性的成果
成果测量，以判断一个成功的椎间盘制剂可扩散实验，其中一个小分子量的荧光染料（如procion红）准备为1％溶液在PBS洗涤2。体外诊断试剂是保持至少100毫升染料溶液和染料，然后允许在自由膨胀扩散到24小时的体外诊断试剂的被动。体外诊断试剂是闪存液氮冷冻，并带回至室温的丙酮转移系列（第一预冷在-80 ° C，然后-20 ° C，然后4 ° C和最后到室温脱水）。光盘可以被嵌入在聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）和切用锋利的刀片生产100微米厚的部分。然后，这些部分可以被视为由任何标准来衡量明显微镜，但优先使用荧光显微镜，因为procion红色会发出红色荧光（图5-6）。 trabeculi骨表面看起来很干净后喷射lavaging步骤（图7）。
一个成功的器官培养的参数是所有没有污染，保持细胞活力（图8-9），椎间盘高度的第一和整体的“光盘的完整性”，与组织学切片和番红O /快绿染色或迈耶的Hematoxilin 3测定。我们开发的协议和宏别处发表 4,5染色现场椎间盘组织，并在三维扫描单元使用共聚焦激光扫描显微镜和活/死染色试剂盒（分子探针，Invitrogen公司，巴塞尔，瑞士）的可行性。我们进一步发展的宏和程序执行自动化的细胞计数，估计在三维组织或3D运营商使用美国国立卫生研究院ImageJ平台4-6细胞活力。已提出替代的协议，以确定由最初的使用顺序使用链霉蛋白酶和胶原酶类型的细胞外基质的消化消化细胞椎间盘细胞的可行性2，然后染色的细胞悬液7。一个早期版本的协议涉及孵育10min后用含光盘收获前器官立方米十倍较为集中的青霉素/链霉素浓度一步lture。与Jet灌洗一步一步变得过时，因为这一步，似乎有利于培养目的。
图1。概述的方法步骤，准备完整的终板和骨薄薄的一层（1 - 2MM）牛尾骨椎间盘。一）椎间盘（IVD）和它的营养通路的示意图。二）程序与一个定制的刀片持有者和工业锋利的刀片切出的体外诊断试剂。 C）喷射灌洗步骤，以确保高的细胞活力和保持终板和附骨双方1-2毫米，使养分交换。 d）最后的体外诊断试剂，可以培养生物反应器的样品室或用于任何下游应用。
图2上：全长新鲜牛尾巴（理想obta独立非执行董事内2-3小时验尸报告，以确保高细胞活力。底部：X射线图像，说明存在着生长板（GP），二次骨化中心之间的骨性终板（EP）和脊椎机构（VB），约6个月年龄的牛尾巴。
图3 A）工具，在无菌条件下解剖牛尾巴。二）定制的刀片人切出动感段从牛尾巴在行动的同时，减少椎间盘。 c）边的一个工业标准刀片（Lutz称，德国）的定制刀片人的观点。
图4。绘图和图片的牛尾巴取出后，周围的肌肉和韧带，切出动感的细分说明裂解网站。部分椎骨应“破解”无线网络TH定制的刀片持有人远离软骨终板的理想1-2毫米，以确保充分的骨面。
图5（A）和（二）有效的清洁喷射灌洗步骤示范前。请注意干净椎间盘段骨表面喷涂程序后。
图6。自由膨胀扩散新鲜配制切除牛尾巴椎1％procion红色溶液24小时留在光盘（体外诊断）的实验，证明生长板堵塞的效果。一个数字化X射线的矢状查看体外诊断仍然包含通过尾骨牛椎间盘植体与软骨和骨性终板的生长板和矢状切骨荧光显微镜图像的第二层后24H自由扩散。大奖赛：生长板，2ndry二氧化碳：二次骨化中心。
图7。自由膨胀实验准备新鲜的牛切除尾巴椎为1％procion红色溶液中24小时左光盘（体外诊断），展示清洁灌洗治疗效果的喷气。矢状厚〜1.5 mmthick骨端板，喷气灌洗治疗（左）控制端接受未经处理（右）喷射灌洗治疗切除的牛体外诊断（〜100毫米）。入口显示齐默尔伤口清创系统中使用的喷雾模式，这是24小时的牛在1％procion红色椎间盘植的自由扩散实验。
图8。bovin采取活/死的共焦成像堆栈的预测图像（250微米）发送椎间盘段准备与自由膨胀下保持为0和14天分别为（NP）的髓核，内层纤维环（IA）的和外层纤维环（OA）的喷射灌洗方法。 =钙黄绿素AM（乙酰甲酯）染色的活细胞，红细胞=死细胞的细胞核二聚体- 1乙锭染色绿色细胞。
图9。细胞椎光盘，用活组织和3D堆栈扫描共聚焦激光扫描显微镜的可行性。自由膨胀条件下髓核（NP）和环形纤维化（AF）细胞存活率超过21天的文化。 （平均± SEM，n = 6）统计差异进行了测试，使用非参数克鲁斯卡尔 - 沃利斯秩和检验组间签署。第21天，在NP的所有其他的时间点之间的显著差异。虽然在自动对焦显著差异之间 - 7天被发现0天。 （* P <0.05，** P <0.01）。
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Discussion
器官培养成功的第一步是要确保，不应被污染的外植体。你的程序开始之前，尾巴应该是剥皮。任何动物毛带进无菌实验室污染方面可能会有问题。牛尾巴最好应尽可能新鲜的（这会影响初始细胞活力）。此外，优碘清洗步骤是建议进一步降低污染的风险。而不是使用一个特制的刀座和锤子分开椎体的体外诊断试剂，这可能是通过组织学带锯（金刚石锯片应与PBS或林格氏液冷却切割时）。当心，带锯，样品架和切割刀片应无菌。这里展示的技术不仅限于牛尾巴的IVD隔离，但可以扩展到其他动物，如猪，羊和leporine尾椎甚至腰的体外诊断试剂隔离。对于体外诊断试剂harvest脊髓进程目前在该地区，重要的是先删除所有进程。
细胞活力，在图9给出的数据收集在自由膨胀长达21天，可以用作参考。这种方法保持细胞活力，自由膨胀下的14天。 21天细胞活力下降可能是由于机械负荷的缺乏，这已被证明是重要的协助跨越终板营养扩散和维持椎间盘细胞活力3。这将是非常可能的，细胞的活力会受到更高的静水压缩和/或额外昼夜装载 8-10 。
牛光盘可以作为一个备用协议，准备通过牙齿的毛刺和刚刚离开的11个软骨终板通过消除所有相邻的椎骨骨。使用这种方法，体外诊断试剂的细胞活力，保持了4个星期。然而，在这种情况下扭转不能被应用以来，在一个简单的方法的运动分部有没有僵硬的骨可用“抢”的光盘。凹终板，而不是两边平行面，也需要一个调整的样品室中的任何生物反应器的设计，加载配置文件的差异11。此外，骨性终板之间的分子扩散的评价也没有可能在这些植。
我们的工作的意义
- 使用单使用工业刀片切出完整的器官培养的椎间盘段缩短大大相比，协议涉及与组织学带切割一步看到收获的协议。此外，骨小梁结构不会受到影响，因为它是从一个钻石研磨运动的情况下锯片。
- lavaging骨表面喷洗出非常有效和SI凝结血gnificantly提高髓核随着时间的推移（光盘中心）相比，未经处理的椎间盘细胞的可行性。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
这个项目是由瑞士国家科学基金会（SNF＃310030-127586/1）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fresh bovine intervertebral disc tissue from bovine tails, from local slaughter house (ideally within hours post-mortem and without skin). | |||
| Pulsavac Plus AC System | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-486-01 | Best performance with the hip-spray head and with AC power supply (the one with the 8 AA battery pack d–s also work but is less convenient) |
| High Capacity Fan Spray w/Splash Shield, 12.7cm length | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-175-00 | There are several spray heads available, we tested this one successfully |
| Scalpel blades #22 and #10 | Swann-Morton | #10: 0201 #22: 0208 | |
| Scalpel blade holder # 3 and #4 | Hausmann, Germany | #3: 06.103.00 #4: 06.104.00 | |
| Lutz industrial blade | Lutz, Germany | 1022.0884 | |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11960-044 | |
| Lactated Ringer’s solution (without glucose) | Bichsel, Switzerland | 133 0002 | |
| 6-well multi-well plate | Techno Plastic Products | 92006 | |
| Betadine solution | Mundipharma, Switzerland | 10055025 | |
| Surgical skin marker | Porex Surgical, Switzerland | 9560 | |
| Large cutting board | Any brand is possible |
References
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