Summary
פרוטוקול זה מדגים טכניקה קצירת עבור coccygeal דיסקים חולייתי שור לתרבות עבור איבר
Abstract
הדיסק הבין חולייתי (IVD) הוא המפרק המחבר את עמוד השדרה מחוליה לחוליה. זה תפקידי להעביר טעינה של עמוד השדרה ולתת גמישות עמוד השדרה. הוא מלחין של שלושה מדורים: pulposus הגרעין הפנימי ביותר (NP) המקיף ידי fibrosus annulus (AF), ושני endplates סחוס המחבר בין NP ו - AF לגוף השדרה משני הצדדים. הכאב נגרם ככל הנראה על ידי Discogenic מחלה ניוונית הדיסק הבין חולייתי (DDD) ו herniations הדיסק זוהה כבעיה מרכזית בחברה המודרנית שלנו. כדי לחקור מנגנונים אפשריים של ניוון IVD, בתרבות חוץ גופית מערכות איברים עם תאים חיים הדיסק הם מאוד מושך. בתרבות במבחנה של שלם IVDs coccygeal שור התקדמה למערכת מודל רלוונטי, המאפשר את לימוד mechano ביולוגית היבטים בסביבה מבוקר היטב פיזיולוגיים מכני. IVDs זנב שור ניתן להשיג בקלות יחסית במספרים גבוהים יותרד דומים מאוד IVDs המותני האדם ביחס צפיפות התאים, אוכלוסיית התאים ממדים. עם זאת, טכניקות קודמות שור הזנב קצירת IVD שמירה endplates סחוסי ו endplates גרמי נכשל לאחר 1-2 ימים של התרבות מאז המסלולים תזונה נחסמו על ידי ברור דם קרוש. IVDs הם האיברים avascular הגדול ביותר, ולכן, את החומרים המזינים את התאים NP תלויים אך ורק על דיפוזיה דרך בלוטות נימי מהגוף השדרה הסמוכה. נוכחות של פסולת עצם ודם קרוש על פני השטח endplate יכול לעכב דיפוזיה מזין למרכז הדיסק תא הכדאיות פשרה. הקבוצה שלנו הוקמה פרוטוקול מהיר יחסית "סדק", את IVDs מזנב עם סיכון נמוך לזיהום. אנו מסוגלים permeabilize טרי לחתוך משטחים endplate גרמי באמצעות סילון כירורגית שטיפה המערכת, אשר מסיר את קרישי דם ופסולת חיתוך ביעילות רבה מחדש את מסלול דיפוזיה תזונהלמרכז IVD. הנוכחות של צלחות גידול משני צידי העצם בחוליות יש להימנע להסירו לפני התרבות. בסרטון זה, אנו המתאר את הפעולות מכריע במהלך הכנת ולהפגין המפתח תרבות איבר מוצלח שמירה כדאיות התא גבוהה במשך 14 ימים תחת תרבות נפיחות חינם. השעה התרבות יכול להיות ארוך כאשר הסביבה מכני מתאים יכול להישמר באמצעות bioreactor טעינה מכני. הטכניקה הפגינו כאן ניתן להרחיב בעלי חיים אחרים כגון חזירי, ovine ו leporine בידוד IVD הזנב ואת המותני.
Protocol
1. הדיסק הבין חולייתי קציר
- זנב שור שלם באורך מתקבל שחיטה מקומית, אם אפשר בלי עור מאז הנוכחות של העור מעלה את הסיכוי לזיהום (איור 2).
- הכן קרש חיתוך גדול להכין תחנת עבודה סטרילית המכשירים על גבי קרש חיתוך (איור 2).
- הכן תחת מכסה המנוע גזה סטרילי זרימה למינרית סטרילי טבולה סודיום כלוריד 0.9% המכיל ציטרט הנתרן 55mm והכניסו גם בכל צלחת 6-הבאר.
- הכן אגן לדלל 1:100 פתרון בבטאדין עם מי ברז.
- לטבול את זנב שור שלם באגן המכיל פתרון בבטאדין 1% עבור 5 דקות.
- בקצרה הזנב יבש עם גזה סטרילית ולמקם אותו על תחנת עבודה סטרילית.
- מוציאים בזהירות שרירים סביב הזנב עם להב אזמל # 22.
- קוצצים משם את חלקי הזנב אשר אינם זקוקים, בדרך כלל בשני הקצוות של הזנב, אשר מכילים גדולות יחסית קטן מאודIVDs (איור 3).
- חתוך עוד יותר את השרירים והגידים סביב IVD באמצעות להב סכין המנתחים # 10. היזהרו לא לחתוך את annulus החיצוני של הדיסקים.
- סמן הקדמי של IVD עם סמן עור כירורגית (צעד זה אופציונלי, זה עוזר לקבוע את מרכז הסיבוב צירית ב bioreactor שלנו).
- אתר את IVD ונקודת חיבור חוליה ידי הזזת הזנב בעדינות. הרגישו את הגבול בין IVD ועצמות עם הצד הקהה של להב סכין המנתחים. האתר ביקוע צריך להיות 1-2 מ"מ במרחק של IVD לכיוון החוליה. מנהג המקום עשה בעל להב תעשייתית באתר ביקוע (איור 4).
- קליב IVD ואת החוליה על ידי הפטישים על גבי מחזיק מחוייט את הלהב תעשייתי (איור 3).
- חזרי על הפעולה בצד השני של חיבור IVD-החוליה.
- גלישת מבודד IVD עם גזה סטרילית טבולה סודיום כלוריד 0.9% המכיל ציטרט הנתרן 55mm.
- המשך בידודה של IVDs למספר המדגם הרצוי (בדרך כלל סביב 6 יכולניתן לקצור בקוטר בין 1-20 מ"מ).
- חבר את מערכת שטיפה סילון (צימר, Inc.) עם פתרון Ringer Lactated של סטריליות, שקיות 5L הן בגודל שימושי (PBS סטרילי לחילופין או תמיסת מלח 0.9%).
- החזק את IVD עם מלקחיים סילון שטיפה שני הצדדים של המשטח באמצעות endplate צימר Pulsavac סילון מערכת שטיפה (איור 1C). האקדח סילון צריך לירות על פני השטח endplate בזווית שבין 30-60 מעלות במשך כ -30 בכל צד. (איורים 1 ו -7)
- שים את IVDs חזרה צלחת 6-הבאר לעטוף עם גזה לח בעוד מטוס אחר מדגם כביסה דיסק.
- IVDs מוכנים תרבות איבר ולמטה זרם יישומים (למשל כדאיות התא, העמסה מכנית, תרבות איבר) (1D איור).
2. נציג תוצאות
מדידות תוצאה לשפוט הכנה מוצלח הדיסק הבין חולייתי יכול להיות ניסוי דיפוזיה שבה לצבוע קטן משקל מולקולרי פלואורסצנטי (למשל procion אדום)מוכן כפתרון 1% PBS 2. IVD נשמרת אז עם לפחות 100 מ"ל של תמיסת צבע ואת צבע מותר אז כדי לפזר באופן פאסיבי לתוך IVD במשך 24 שעות תחת נפיחות חינם. IVD היא אז פלאש מוקפאת בחנקן נוזלי והחזיר בטמפרטורת החדר מיובש על ידי שורה של העברות אצטון (הראשון מראש מקורר ב -80 ° C, ואז -20 ° C, אז 4 ° C ולבסוף בטמפרטורת החדר ). דיסק אז יכול להיות מוטבע poly-methyl-Acrylate (PMMA) וחותכים בסכין חדה כדי לייצר 100 מיקרומטר בעובי חלקים. סעיפים אלה אז יכול להיות שנצפו על ידי מיקרוסקופ כל brightfield סטנדרטי אך מועדף על ידי שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי מאז procion אדום פולט הקרינה אדום (איורים 5-6). Trabeculi של פני השטח נראה נקי מאוד גרמי אחרי צעד הסילון lavaging (איור 7).
פרמטרים לתרבות איבר מצליחים הראשונה בהעדר כל, הכדאיות זיהום תא שמר (איורים 8-9), גובה הדיסקהכוללת "דיסק שלמות", נמדד עם סעיפים היסטולוגית ו safranin O / ירוק מהיר כתם או Hematoxilin מאיר 3. פיתחנו פרוטוקולים מאקרו שפורסמו 4,5 במקום אחר להכתים רקמת הדיסק לחיות כדי לסרוק את הכדאיות תא 3D באמצעות מיקרוסקופ לייזר confocal סריקה ערכת מכתים חי / מת (בדיקות מולקולריות, Invitrogen, באזל, שוויץ). בנוסף, אנו פיתחו מאקרו שגרתי לבצע ספירת תאים אוטומטיות להערכת כדאיות התא ברקמות 3D או נשאים 3D באמצעות פלטפורמת ImageJ NIH 4-6. פרוטוקולים חלופיים הוצעו על מנת לקבוע כדאיות התא של תאים דיסק ידי עיכול ראשוני באמצעות עיכול רציפים של מטריקס תאית באמצעות pronase וסוג collagenase 2 ואחר כך להכתים את ההשעיה תא 7. הגירסה הקודמת של פרוטוקול מעורב שלב הדגירה של PBS ובו עשר פעמים מרוכז יותר ריכוז פניצילין / סטרפטומיצין עבור 10min לאחר קציר של הדיסקים לפני איבר מ"קlture. עם הצעד שטיפה סילון שלב זה מתיישן שכן צעד זה נראה מועיל למטרות culturing.
באיור 1. סקירה של צעדים מתודולוגיים להכין שור דיסקים חולייתי coccygeal עם endplates שלם שכבה דקה (1-2mm) של העצם. א) Schematic לצפות של הדיסק הבין חולייתי (IVD) ואת המסלולים התזונתי שלה. ב) נוהל לחתוך את IVD עם מותאם אישית בעל להב ו - להב חד תעשייתי. ג) שלב Jet שטיפה כדי להבטיח כדאיות התא גבוהה כדי לאפשר חילופי מזין שמירה על endplates ו 1-2 מ"מ של העצם המצורפת בשני הצדדים. ד) לבסוף IVD יכול להיות מתורבת בחדר הדגימה של bioreactor או לשמש עבור יישומים למטה זרם כלשהו.
איור 2 TOP:. אורך מלא טרי זנב שור (רצוי obtaעומד לבחינה תוך 2-3 שעות שלאחר המוות, כדי להבטיח כדאיות התא גבוה. תחתונה: תמונת רנטגן של זנב שור בגיל 6 חודשים בערך הממחישות את קיומם של לוחיות הגדילה (GP), מרכז המשני של התאבנות, בין endplates הגרמית (EP) ואת גופות חוליה (VB).
איור 3.) כלים לנתח את זנב שור בתנאים סטריליים. ב) מותאם אישית להב בעל לחתוך החוצה קטעים motional מזנב שור בפעולה תוך צמצום הדיסק הבין חולייתי. ג) Side-נוכח אישית בעל להב עם להב תעשייתי סטנדרטי (לוץ, גרמניה).
איור 4. ציור תמונה של הזנב בקר לאחר הסרת השריר שמסביב רצועה הממחישות את אתרי ביקוע לחתוך את קטעי motional. חלקי חוליה צריך להיות "סדוק" wiה בעל מחוייט את הלהב באופן אידיאלי 1-2 מ"מ הרחק endplates סחוסי כדי להבטיח משטח עצם מלא.
איור 5. הפגנה של ניקוי יעיל של צעד סילון שטיפה לפני (A) ואחרי (B). שימו לב משטחים גרמי נקי של מגזרים הדיסק הבין חולייתי לאחר ההליך ריסוס.
איור 6. חינם, נפיחות ניסוי דיפוזיה של דיסקים נכרת מוכן טרי זנב שור חולייתי (IVDs) שמאל למשך 24 שעות בתמיסה procion 1% אדום, הוכחת החסימה על ידי אפקט הצלחת הצמיחה. מבט רנטגן דיגיטלי sagittal של IVD עדיין המכילים את צלחת צמיחה שכבה שנייה של תמונת העצם במיקרוסקופ פלואורסצנטי של לחתוך sagittal דרך explant את הדיסק שור coccygeal חולייתי עם endplate סחוסי וגרמי אחרי 24H חינם דיפוזיה. GP: צלחת צמיחה, 2ndry CO: במרכז המשני של התאבנות.
איור 7. חינם, נפיחות של הניסוי נכרת דיסקים מוכן טרי זנב שור חולייתי (IVDs) שמאל למשך 24 שעות בתמיסה procion 1% אדום, הוכחת השפעה של טיפול ניקוי שטיפה סילון. חלקים עבים sagittal (~ 100 מ"מ) של IVDs שור נכרת עם לוחיות ~ 1.5-mmthick סוף גרמי שעברו סילון טיפול שטיפה (משמאל) לצד השליטה ללא טיפול (מימין) סילון lavaged הטיפול. כניסה מציג את דפוס ספריי, אשר שימש ממערכת הטריה פצע צימר 24h ניסויים דיפוזיה חופשית של שור explants הדיסק הבין חולייתי באדום procion 1%.
איור 8. תמונות Live / Dead התחזיות של confocal ערימות דימות (250μm) שנלקחו bovinמגזרים דואר הדיסק הבין חולייתי מוכן עם שיטת סילון שטיפה זה הזמן תחת חופשית נפיחות של 0 ו - 14 ימים בהתאמה עבור pulposus גרעין (NP), הפנימי annulus fibrosus (IA) ואת החיצוני annulus fibrosus (OA). תאים תאים חיים ירוק = מוכתם על ידי calcein AM (methylester אצטיל), תאים אדומים = גרעין תאים מתים מוכתם על ידי ethidium homodimer-1.
איור 9. כדאיות התא של הדיסק הבין חולייתי באמצעות לייזר confocal מיקרוסקופיית על רקמת חיים סריקה מחסנית 3D. הכדאיות של גרעין התא Pulposus (NP) ו Annulus פיברוזיס (AF) על פני התרבות של 21 יום בתנאי חופשי נפיחות. (ממוצע ± SEM, N = 6) הבדלים סטטיסטיים נבדקו באמצעות אי - פרמטרית Kruskal-Wallis חתם סכום מבחן דרגה בין הקבוצות. נמצאו הבדלים משמעותיים בין 21 יום וכל נקודות זמן אחרות NP. בעוד AF הבדלים משמעותיים נמצאו בין יום ל 7יום 0. (* P <0.05, ** p <0.01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הצעד הראשון לתרבות איברים מוצלחת היא לוודא כי explant לא צריך להיות מזוהמים. הזנב צריך להיות עור לפני שאתם מתחילים עם ההליך. כל שערה חיה הביא למעבדה סטרילית יכול להיות בעייתי מבחינת זיהום. זנב שור אידיאלי צריך להיות טרי ככל האפשר (זה משפיע על כדאיות התא הראשוני). יתר על כן, צעד הכביסה בבטאדין מומלץ להפחית את הסיכון של זיהום נוסף. במקום להשתמש בעל מחוייט להב פטיש להפריד את IVD מגוף החוליה, זה יכול להתבצע באמצעות bandsaw היסטולוגית (להב היהלום צריך להיות מקורר עם PBS או תמיסת רינגר תוך חיתוך). היזהרו כי bandsaw, בעל מדגם להב חיתוך צריך להיות סטרילי. הטכניקה הפגינו כאן אינו מוגבל בידוד זנב שור IVD אך ניתן להרחיב בעלי חיים אחרים כגון חזירי, ovine ו leporine הזנב או בידוד IVD המותני אפילו. במשך שעות IVDarvest באזור שבו תהליכים השדרה נמצאים, חשוב להסיר את כל התהליכים הראשונים.
הכדאיות התא נתונים נתון באיור 9 נאספו תחת חופשית נפיחות עד 21 ימים והוא יכול לשמש כנקודת התייחסות. שיטה זו שומרת על חיוניות התא במשך 14 ימים תחת חופשית נפיחות. הירידה כדאיות התא על 21 ימים יכול להיות בגלל חוסר טעינה מכני אשר הוכח להיות חשוב בסיוע דיפוזיה מזין ברחבי endplates ולשמור על התא דיסק הכדאיות 3. זה יהיה מאוד סביר להניח כי את הכדאיות התא יהיה אף גבוה יותר תחת דחיסה ההידרוסטטי ו / או נוספים 8-10 טעינת יומי.
כמו פרוטוקול חלופי, הדיסקים שור יכול להיות מוכן על ידי הסרת כל העצמות הסמוכות החוליות באמצעות Burr שיניים פשוט לעזוב את endplates סחוסי 11. כדאיות התא IVD נשמר על 4 שבועות באמצעות שיטה זו.עם זאת, במקרה זה פיתול לא ניתן להחיל באופן ישיר את פלחי motional מאחר ואין עצם נוקשה לרשות "לתפוס" את הדיסק. קעור endplates במקום משטחים מקבילים בשני הצדדים גם צריך התאמה של חדר הדגימה בעיצוב כל bioreactor להסביר את ההבדלים פרופיל העמסה 11. יתר על כן, ההערכה של דיפוזיה של מולקולות על פני endplates גרמי הוא גם לא אולי explants אלה.
המשמעות של העבודה שלנו
- השימוש החד השימוש להבים תעשייתיים לחתוך החוצה קטעים שלמים הדיסק הבין חולייתי לתרבות איבר מקצרת את פרוטוקול קצירת בהשוואה ניכר פרוטוקולים מעורבים חיתוך צעד עם להקה היסטולוגית ראה. כמו כן המבנה trabecular של העצם אינה מושפעת כפי שהוא המקרה מתנועה טחינה עם יהלום ראה להב.
- Jet-lavaging משטח גרמי שוטף החוצה הדם הקרוש מאוד יעיל סיgnificantly משפר את יכולת הקיום של תאים pulposus הגרעין (מרכז של הדיסק) לאורך זמן לעומת דיסקים חולייתי מטופל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו שום דבר לגלות.
Acknowledgments
פרויקט זה מומן על ידי הלאומית השוויצרית למדע (SNF # 310030-127586/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fresh bovine intervertebral disc tissue from bovine tails, from local slaughter house (ideally within hours post-mortem and without skin). | |||
| Pulsavac Plus AC System | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-486-01 | Best performance with the hip-spray head and with AC power supply (the one with the 8 AA battery pack d–s also work but is less convenient) |
| High Capacity Fan Spray w/Splash Shield, 12.7cm length | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-175-00 | There are several spray heads available, we tested this one successfully |
| Scalpel blades #22 and #10 | Swann-Morton | #10: 0201 #22: 0208 | |
| Scalpel blade holder # 3 and #4 | Hausmann, Germany | #3: 06.103.00 #4: 06.104.00 | |
| Lutz industrial blade | Lutz, Germany | 1022.0884 | |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11960-044 | |
| Lactated Ringer’s solution (without glucose) | Bichsel, Switzerland | 133 0002 | |
| 6-well multi-well plate | Techno Plastic Products | 92006 | |
| Betadine solution | Mundipharma, Switzerland | 10055025 | |
| Surgical skin marker | Porex Surgical, Switzerland | 9560 | |
| Large cutting board | Any brand is possible |
References
- Lee, C. R., Iatridis, J. C., Poveda, L., Alini, M. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine (Phila Pa 1976). 31, 515-522 (1976).
- Chan, S. C. W., Gantenbein-Ritter, B., Leung, V. Y., Chan, D. Cryopreserved intervertebral disc with injected bone marrow-derived stromal cells: a feasibility study using organ culture. Spine. J. 10 (6), 486-496 (2010).
- Chan, S. C., Ferguson, S. J., Wuertz, K., Gantenbein-Ritter, B. Biological Response of the Intervertebral Disc to Repetitive Short Term Cyclic Torsion. Spine (Phila Pa 1976). , (2011).
- Gantenbein-Ritter, B., Sprecher, C. M., Chan, S., Illien-Jünger, S., Grad, S. Confocal imaging protocols for live/dead staining in three-dimensional carriers. Methods Mol. Biol. 740, 127-140 (2011).
- Gantenbein-Ritter, B., Potier, E., Zeiter, S., van der Werf, M. Accuracy of three techniques to determine cell viability in 3D tissues or scaffolds. Tissue Engineering Part C Methods. 14, 353-358 (2008).
- Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. (1997).
- Haschtmann, D., Stoyanov, J. V., Ettinger, L., Nolte, L. P., Ferguson, S. J. Establishment of a novel intervertebral disc/endplate culture model: analysis of an ex vivo in vitro whole-organ rabbit culture system. Spine. 31, 2918-2925 (2006).
- Gantenbein, B., Grünhagen, T., Lee, C. R., van Donkelaar, C. C. An in vitro organ culturing system for intervertebral disc explants with vertebral endplates: a feasibility study with ovine caudal discs. Spine. 31, 2665-2673 (2006).
- Korecki, C. L., Kuo, C. K., Tuan, R. S., Iatridis, J. C. Intervertebral disc cell response to dynamic compression is age and frequency dependent. J. Orthop. Res. 27, 800-806 (2009).
- Korecki, C. L., MacLean, J. J., Iatridis, J. C. Dynamic compression effects on intervertebral disc mechanics and biology. Spine (Phila Pa 1976). 33, 1403-1409 (1976).
- Jim, B., Steffen, T., Moir, J., Roughley, P., Haglund, L. Development of an intact intervertebral disc organ culture system in which degeneration can be induced as a prelude to studying repair potential. European Spine Journal. , 1-11 (2011).
