Summary
इस प्रोटोकॉल एक अंग संस्कृति के लिए अनुत्रिक गोजातीय intervertebral डिस्क के लिए कटाई के लिए तकनीक दिखाता है
Protocol
1. Intervertebral डिस्क फसल काटने वाले
- पूरे लंबाई गोजातीय पूंछ एक स्थानीय बूचड़खाने से प्राप्त होता है, यदि संभव हो तो त्वचा के बिना त्वचा की उपस्थिति के बाद से संदूषण का मौका (चित्र 2) बढ़ जाती है.
- बड़े काटने बोर्ड तैयार है और एक काटने बोर्ड (छवि 2) के शीर्ष पर बाँझ काम स्टेशन और उपकरणों को तैयार हैं.
- बाँझ लामिना का प्रवाह हुड बाँझ धुंध के तहत तैयार 0.9% सोडियम क्लोराइड 55mm सोडियम साइट्रेट युक्त के साथ सिक्त और 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएँ में डाल दिया.
- एक बेसिन तैयार है और पानी के नल के साथ 1:100 Betadine समाधान जलमिश्रित.
- एक 5 मिनट के लिए 1% Betadine समाधान युक्त बेसिन में पूरे गोजातीय पूंछ विसर्जित कर दिया.
- संक्षेप में बाँझ धुंध के साथ शुष्क पूंछ और यह बाँझ काम स्टेशन पर जगह.
- ध्यान से पूंछ के आसपास स्केलपेल ब्लेड # 22 के साथ मांसपेशियों को हटा दें.
- दूर काट पूंछ के कुछ हिस्सों, जो जरूरत नहीं कर रहे हैं आमतौर पर पूंछ के दोनों समाप्त होता है, जो अपेक्षाकृत बड़े और बहुत छोटे होते हैं(छवि 3) IVDs.
- आगे और स्केलपेल ब्लेड # 10 का उपयोग IVD के आसपास मांसपेशियों, tendons छाँटो. डिस्क के बाहरी वलय में कटौती नहीं की खबरदार.
- एक शल्य चिकित्सा त्वचा मार्कर के साथ IVD के पूर्वकाल मार्क (यह कदम वैकल्पिक है, यह हमारे bioreactor में axial रोटेशन के लिए केंद्र का निर्धारण में मदद करता है).
- पूंछ धीरे आगे बढ़ द्वारा IVD और कशेरुका कनेक्शन बिंदु का पता लगाएँ. IVD और एक स्केलपेल ब्लेड की सुस्त पक्ष के साथ हड्डी के बीच की सीमा को महसूस करो. cleaving साइट कशेरुका की ओर IVD के 1-2 मिमी दूर किया जाना चाहिए. प्लेस कस्टम cleaving साइट (4 छवि) पर औद्योगिक ब्लेड धारक बनाया है.
- फोड़ना IVD और कस्टम निर्मित औद्योगिक ब्लेड धारक (छवि 3) के शीर्ष पर टंकण द्वारा कशेरुका.
- IVD - कशेरुका कनेक्शन के दूसरे पक्ष पर दोहराएँ.
- लपेटें पृथक बाँझ धुंध के साथ IVD 0.9% सोडियम क्लोराइड 55mm सोडियम साइट्रेट युक्त के साथ सिक्त.
- वांछित नमूना संख्या (आमतौर पर लगभग 6 IVDs के अलगाव जारी रखें10-20 मिमी के बीच व्यास के साथ काटा जा सकता है).
- जेट lavage प्रणाली (Zimmer, inc.) बाँझ lactated घंटी के समाधान के साथ कनेक्ट, 5L बैग एक उपयोगी आकार के होते हैं (वैकल्पिक बाँझ पीबीएस या 0.9% नमकीन घोल).
- संदंश और जेट lavage endplate सतह के दोनों पक्षों Zimmer Pulsavac प्रणाली जेट - पानी से धोना (छवि 1C) का उपयोग कर के साथ IVD पकड़ो. 30 के बीच एक कोण पर endplate सतह पर जेट बंदूक गोली मार दी जानी चाहिए - प्रत्येक पक्ष पर 30s के बारे में के लिए 60 °. (Figs. 1 और 7)
- IVDs 6 अच्छी तरह से थाली के साथ रैप पर वापस रखो धुंध सिक्त जबकि जेट अन्य डिस्क नमूना धोने.
- IVDs अंग संस्कृति और डाउन स्ट्रीम आवेदन पत्र (जैसे सेल व्यवहार्यता, यांत्रिक लोड हो रहा है, अंग संस्कृति) (छवि 1D) के लिए तैयार हैं.
2. प्रतिनिधि परिणाम
परिणाम के लिए एक सफल intervertebral डिस्क तैयारी न्यायाधीश माप एक प्रसार प्रयोग किया जा सकता है, जहां एक छोटे से आणविक भार फ्लोरोसेंट रंजक (जैसे procion लाल)पीबीएस 2 में 1% समाधान के रूप में तैयार है. IVD तो डाई समाधान के कम से कम 100 एमएल और डाई तब निष्क्रिय मुक्त सूजन के तहत 24 के लिए IVD में फैलाना की अनुमति दी है के साथ रखा है. IVD तो फ्लैश तरल नाइट्रोजन में जमे हुए और कमरे के तापमान और एसीटोन स्थानान्तरण की एक श्रृंखला (पहली -80 में सी, तो -20 डिग्री सी, तो 4 ° डिग्री सेल्सियस और अंत में कमरे के तापमान के लिए पूर्व ठंडा द्वारा निर्जलित के लिए वापस लाया ). डिस्क तो पाली मिथाइल acrylate (PMMA) में एम्बेडेड जा सकता है और एक तेज ब्लेड के साथ 100 सुक्ष्ममापी मोटी वर्गों का उत्पादन कटौती. इन वर्गों को तो किसी भी मानक brightfield माइक्रोस्कोप के द्वारा, लेकिन preferentially प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के उपयोग के बाद से procion लाल एक लाल प्रतिदीप्ति (5-6 Figs.) का उत्सर्जन करता देखा जा सकता है. बोनी की सतह के trabeculi जेट lavaging कदम (छवि 7) के बाद बहुत साफ दिखाई देते हैं.
एक सफल अंग संस्कृति के लिए पैरामीटर संदूषण, को बनाए रखा सेल व्यवहार्यता के सभी अभाव (8-9 Figs.), डिस्क ऊंचाई के पहले कर रहे हैं औरसमग्र "अखंडता डिस्क", histological वर्गों और सैफरैनीन हे / तेजी से हरे रंग के दाग या मेयेर Hematoxilin 3 के साथ मापा. हम प्रोटोकॉल और मैक्रोज़ कहीं और प्रकाशित करने के लिए जी डिस्क ऊतक दाग और 3 डी में सेल व्यवहार्यता एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग और रहते हैं / मृत धुंधला किट (आण्विक जांच, Invitrogen, बेसल, स्विट्जरलैंड) का उपयोग करते हुए स्कैन 4,5 विकसित की है. हम आगे एक स्थूल और दिनचर्या को स्वचालित सेल गिनती 3D ऊतक या 3 डी वाहक एनआईएच ImageJ 4-6 मंच का उपयोग में सेल व्यवहार्यता का अनुमान प्रदर्शन विकसित की है. वैकल्पिक प्रोटोकॉल प्रारंभिक बाह्य मैट्रिक्स का उपयोग कर pronase और collagenase प्रकार का अनुक्रमिक पाचन का उपयोग पाचन द्वारा डिस्क कोशिकाओं के सेल व्यवहार्यता का निर्धारण 2 और फिर सेल 7 निलंबन दाग प्रस्तावित किया गया है. प्रोटोकॉल की एक पहले संस्करण पीबीएस 10min के लिए डिस्क की पूर्व कटाई अंग घन के बाद दस गुना अधिक ध्यान केंद्रित पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन एकाग्रता में एक ऊष्मायन कदम शामिलएक LTURE. जेट lavage कदम के साथ इस कदम अप्रचलित हो जाता है क्योंकि इस कदम संवर्धन उद्देश्यों के लिए फायदेमंद लगता है.
चित्रा 1 methodological चरणों के अवलोकन बरकरार endplates और हड्डी (1-2mm) की एक पतली परत के साथ गोजातीय अनुत्रिक intervertebral डिस्क तैयार करने के लिए . ) एक intervertebral डिस्क (IVD) और उसके पोषण रास्ते के योजनाबद्ध दृश्य. बी) प्रक्रिया बाहर काटने के लिए एक ब्लेड - धारक अनुकूलित और एक औद्योगिक तेज ब्लेड के साथ IVD. सी) जेट lavage कदम उच्च सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए और पोषक तत्व endplates रखने और दोनों पक्षों पर संलग्न हड्डी के 1-2 मिमी विनिमय सक्षम है. डी) अंत में IVD bioreactor का नमूना कक्ष में संवर्धित किया जा सकता है या नीचे धारा किसी भी आवेदन के लिए इस्तेमाल किया जा.
चित्रा 2 शीर्ष: पूर्ण लंबाई ताजा गोजातीय पूंछ (आदर्श obtaपोस्टमार्टम के लिए उच्च सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के 2-3 घंटे के भीतर ined है. एक गोजातीय विकास (जीपी) प्लेटें, बोनी endplates (EP) और कशेरुका निकायों (VB) के बीच के माध्यमिक केन्द्र हड्डी बन जाना, अस्तित्व illustrating 6 महीने के आसपास वृद्ध पूंछ के नीचे: छवि एक्स - रे.
चित्रा 3.) उपकरण बाँझ शर्तों के तहत गोजातीय पूंछ टुकड़े करना . बी) अनुकूलित ब्लेड धारक कार्रवाई में गोजातीय पूंछ से गतिवान क्षेत्रों बाहर में कटौती जबकि intervertebral डिस्क काटने. सी) अनुकूलित एक मानक औद्योगिक ब्लेड (Lutz, जर्मनी) के साथ ब्लेड धारक के साइड दृश्य.
चित्रा 4 आरेखण और आसपास के मांसपेशियों और बंधन को गतिवान क्षेत्रों में कटौती cleaving साइटों illustrating हटाने के बाद गोजातीय पूंछ की तस्वीर. आंशिक कशेरुका वाई "टूट" चाहिएकस्टम बनाया ब्लेड धारक वें आदर्श 1-2 मिमी कार्टिलेजीनस endplates से दूर पूर्ण हड्डी की सतह सुनिश्चित करने के लिए.
चित्रा 5 जेट lavage कदम के प्रभावी सफाई के पहले प्रदर्शन (ए) और बाद में (बी). सूचना intervertebral डिस्क के क्षेत्रों के छिड़काव की प्रक्रिया के बाद साफ बोनी सतहों.
चित्रा 6 फ्री सूजन हौसले से तैयार excised गोजातीय पूंछ intervertebral (IVDs) डिस्क 1% procion लाल समाधान में 24 घंटे के लिए छोड़ दिया की प्रसार प्रयोग, विकास प्लेट द्वारा रुकावट प्रभाव का प्रदर्शन. एक डिजिटल एक्स - रे एक बाण के समान दृश्य 2 के बाद अभी भी अनुत्रिक गोजातीय intervertebral डिस्क explant के माध्यम से कार्टिलेजीनस और बोनी endplate के साथ विकास की थाली और बाण के समान कटौती की हड्डी फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवि की एक दूसरी परत युक्त IVD4 मुक्त प्रसार. जीपी: ग्रोथ प्लेट, 2ndry सीओ: माध्यमिक केन्द्र हड्डी बन जाना.
7 चित्रा फ्री हौसले से तैयार excised गोजातीय पूंछ intervertebral (IVDs) डिस्क 1% procion लाल समाधान में 24 घंटे के लिए छोड़ दिया के प्रयोग सूजन, जेट lavage उपचार के प्रभाव की सफाई का प्रदर्शन. ~ 1.5 mmthick बोनी अंत प्लेटें कि उपचार (अधिकार) जेट - lavaged उपचार के बिना जेट पानी से धोना (बाएं) उपचार नियंत्रण पक्ष लिया साथ excised गोजातीय IVDs के बाण के समान मोटी वर्गों (~ 100 मिमी). Inlet स्प्रे पैटर्न, 24 घंटों में 1% procion की लाल गोजातीय intervertebral डिस्क explants के मुक्त प्रसार प्रयोगों जो Zimmer घाव debridement प्रणाली से इस्तेमाल किया गया था से पता चलता है
8 चित्रा confocal इमेजिंग के ढेर के अनुमानों के लाइव / मृत छवियाँ (250μm) bovin से लियाई intervertebral डिस्क क्षेत्रों में इस जेट - पानी से धोना 0 और 14 दिनों के नाभिक (एनपी) pulposus, भीतरी तंतु वलय (आइए) और बाहरी तंतु वलय (OA) के लिए क्रमशः के लिए मुक्त सूजन के तहत रखा विधि के साथ तैयार हैं. = रहते calcein AM (एसिटाइल methylester) द्वारा दाग कोशिकाओं, लाल कोशिकाओं = मृत कोशिकाओं ethidium homodimer-1 के द्वारा दाग नाभिक ग्रीन कोशिकाओं.
चित्रा 9 intervertebral डिस्क के जीवित ऊतक और 3D ढेर स्कैनिंग पर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग लेजर का उपयोग सेल व्यवहार्यता . न्यूक्लियस (एनपी) pulposus वलय और फाइब्रोसिस (वायुसेना) के 21 दिन संस्कृति पर मुक्त सूजन हालत के तहत सेल व्यवहार्यता. (मतलब ± SEM, N = 6) सांख्यिकीय मतभेदों का उपयोग गैर पैरामीट्रिक Kruskal वालिस समूहों के बीच रैंक राशि परीक्षण पर हस्ताक्षर किए परीक्षण किया गया. 21 दिन और एनपी में अन्य सभी समय अंक के बीच महत्वपूर्ण अंतर पाया गया. जबकि वायुसेना महत्वपूर्ण मतभेदों में से 7 दिन के बीच पाया गया0 दिन. (* <0.05 पी ** 0.01 <पी).
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Discussion
सफल अंग संस्कृति के लिए पहला कदम को यकीन है कि explant दूषित नहीं होना चाहिए है. पूंछ है इससे पहले कि आप प्रक्रिया के साथ शुरू चमड़ी किया जाना चाहिए. कोई भी जानवर एक बाँझ प्रयोगशाला में लाया बाल संदूषण के मामले में समस्याग्रस्त किया जा सकता है. गोजातीय पूंछ आदर्श के रूप में संभव के रूप में ताजा होना चाहिए (इस प्रारंभिक सेल व्यवहार्यता को प्रभावित करता है). इसके अलावा, betadine धोने कदम आगे संदूषण का जोखिम कम करने के लिए सिफारिश की है. कस्टम बनाया एक ब्लेड धारक और एक हथौड़ा का उपयोग कर के कशेरुका शरीर से IVD अलग करने के बजाय, यह एक histological आरी (हीरा ब्लेड पीबीएस या घंटी समाधान के साथ ठंडा किया जाना चाहिए जबकि काटने) का उपयोग करके किया जा सकता है. खबरदार कि आरी, नमूना धारक और ब्लेड काटने बाँझ होना चाहिए. तकनीक यहाँ प्रदर्शन गोजातीय पूंछ IVD अलगाव तक ही सीमित नहीं है लेकिन सुअर का ovine, और खरगोश की जाति का दुम का या काठ IVD अलगाव जैसे अन्य जानवरों की प्रजातियों के लिए बढ़ाया जा सकता है. IVD घंटे के लिएक्षेत्र जहां रीढ़ की प्रक्रियाओं मौजूद हैं में arvest, यह महत्वपूर्ण है सभी प्रक्रियाओं पहले निकाल.
सेल व्यवहार्यता आंकड़ा 9 में दिए गए डेटा मुक्त सूजन के तहत 21 दिन के लिए एकत्र किए गए थे और एक संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. इस विधि मुक्त सूजन के तहत 14 दिनों के लिए सेल व्यवहार्यता रखता है. 21 दिनों में सेल व्यवहार्यता में ड्रॉप जो endplates भर में पोषक तत्वों प्रसार की सहायता में महत्वपूर्ण हो सकता है और डिस्क सेल व्यवहार्यता 3 बनाए रखने के लिए दिखाया गया है यांत्रिक लोड हो रहा है की कमी के कारण हो सकता है. यह बहुत संभावना है कि सेल व्यवहार्यता भी उच्च हीड्रास्टाटिक संपीड़न और / या अतिरिक्त प्रतिदिन लोडिंग 8-10 के तहत किया जाएगा किया जाएगा .
प्रोटोकॉल के रूप में एक वैकल्पिक, गोजातीय डिस्क कशेरुकाओं के आसन्न हड्डी के एक दंत गड़गड़ाहट का उपयोग और बस कार्टिलेजीनस 11 endplates छोड़ने के द्वारा सभी को हटाने के द्वारा तैयार किया जा सकता है. IVD सेल व्यवहार्यता 4 सप्ताह में इस पद्धति का उपयोग करके बनाए रखा गया था.हालांकि, इस मामले में मरोड़ गतिवान क्षेत्रों के लिए एक सरल तरीका में लागू नहीं कर सकते हैं के बाद से वहाँ कोई कड़ी उपलब्ध हड्डी "पकड़ो" डिस्क है. अवतल दोनों पक्षों पर एक समानांतर सतहों बजाय endplates भी लोड हो रहा है प्रोफ़ाइल 11 मतभेदों के लिए खाते में किसी भी bioreactor डिजाइन में नमूने के चैम्बर के एक समायोजन की जरूरत है. इसके अलावा, इन explants बोनी endplates भर अणुओं के प्रसार का मूल्यांकन में भी शायद नहीं है.
हमारे काम का महत्व
- के उपयोग एकल - उपयोग औद्योगिक काट बाहर ब्लेड बरकरार अंग संस्कृति के लिए intervertebral डिस्क क्षेत्रों कटाई काफी histological बैंड के साथ काटने कदम देखा शामिल प्रोटोकॉल की तुलना में प्रोटोकॉल shortens. इसके अलावा हड्डी के घरनदार संरचना अप्रभावित है के रूप में यह एक हीरे के साथ एक पीस आंदोलन से मामला है ब्लेड देखा.
- बोनी सतह जेट पका हुआ खून lavaging बहुत कुशलता और सी बाहर washesgnificantly समय पर नाभिक (डिस्क के केन्द्र) अनुपचारित intervertebral डिस्क की तुलना में pulposus सेल व्यवहार्यता में सुधार.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस परियोजना स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (# SNF 310030-127586/1) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fresh bovine intervertebral disc tissue from bovine tails, from local slaughter house (ideally within hours post-mortem and without skin). | |||
| Pulsavac Plus AC System | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-486-01 | Best performance with the hip-spray head and with AC power supply (the one with the 8 AA battery pack d–s also work but is less convenient) |
| High Capacity Fan Spray w/Splash Shield, 12.7cm length | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-175-00 | There are several spray heads available, we tested this one successfully |
| Scalpel blades #22 and #10 | Swann-Morton | #10: 0201 #22: 0208 | |
| Scalpel blade holder # 3 and #4 | Hausmann, Germany | #3: 06.103.00 #4: 06.104.00 | |
| Lutz industrial blade | Lutz, Germany | 1022.0884 | |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11960-044 | |
| Lactated Ringer’s solution (without glucose) | Bichsel, Switzerland | 133 0002 | |
| 6-well multi-well plate | Techno Plastic Products | 92006 | |
| Betadine solution | Mundipharma, Switzerland | 10055025 | |
| Surgical skin marker | Porex Surgical, Switzerland | 9560 | |
| Large cutting board | Any brand is possible |
References
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