Summary
Questo protocollo illustra una tecnica di raccolta coccigeo dischi intervertebrali bovina per la cultura d'organo per
Abstract
Il disco intervertebrale (IVD) è il comune della spina dorsale di collegamento vertebra per vertebra. Funziona per trasmettere carico della colonna vertebrale e dare flessibilità alla colonna vertebrale. Si compone di tre comparti: il nucleo polposo più interno (NP) che comprende dal fibroso (AF), e due placche cartilaginee che collega il NP e AF al corpo vertebrale su entrambi i lati. Dolore discogenico forse causata da malattia degenerativa del disco intervertebrale (DDD) e di ernia del disco è stato identificato come uno dei maggiori problemi della nostra società moderna. Per studiare i possibili meccanismi di degenerazione IVD, nei sistemi d'organo coltura in vitro con le cellule disco dal vivo sono di grande appeal. La coltura in vitro di intatta IVD bovina coccigeo è avanzata ad un sistema modello di rilevante, che permette lo studio di meccano-biologico aspetti in un ambiente ben controllato fisiologiche e meccaniche. IVD coda bovina può essere relativamente facile ottenere numeri più alti in unod sono molto simili ai IVD umano lombare rispetto alla densità cellulare, popolazione di cellule e dimensioni. Tuttavia, le tecniche precedenti bovina caudale raccolta IVD mantenendo piastre laterali di placche ossee e cartilaginee fallito dopo 1-2 giorni di coltura in quanto i percorsi nutrizione erano ovviamente bloccato da sangue coagulato. IVD sono i maggiori organi avascolare, quindi, le sostanze nutritive alle cellule del NP dipendono esclusivamente sulla diffusione capillare attraverso le gemme dal corpo vertebrali adiacenti. Presenza di detriti delle ossa e sangue rappreso sulle superfici placca può ostacolare la diffusione di nutrienti verso il centro del disco e sulla vitalità cellulare compromesso. Il nostro gruppo ha stabilito un protocollo relativamente resoconto di "crack", la IVD dalla coda con un basso rischio di contaminazione. Siamo in grado di permeabilize l'appena tagliata superfici ossee placca utilizzando un sistema di lavaggio chirurgico jet, che rimuove i coaguli di sangue e detriti di taglio e in modo molto efficiente riapre il percorso di diffusione nutrizioneal centro del DIV. La presenza di placche di crescita su entrambi i lati l'osso vertebrale deve essere evitata e deve essere rimosso prima della cultura. In questo video, abbiamo delineare le fasi cruciali durante la preparazione e dimostrare la chiave per una cultura organo di successo mantenendo alta la vitalità delle cellule per 14 giorni in libera cultura gonfiore. Il tempo della cultura potrebbe essere estesa quando opportuno ambiente meccanico può essere mantenuta utilizzando bioreattore meccanici di carico. La tecnica ha dimostrato qui può essere esteso ad altre specie animali quali suini, ovini e leporino isolamento caudale e lombare IVD.
Protocol
1. Disco intervertebrale raccolta
- Tutta la lunghezza della coda bovina si ottiene da un mattatoio locale, se possibile senza la pelle in quanto la presenza della pelle aumenta la possibilità di contaminazione (Fig. 2).
- Preparare a bordo di grandi dimensioni di taglio e la preparazione sterile stazione di lavoro e gli strumenti sopra un tagliere (Fig. 2).
- Preparare sotto la garza sterile cappa a flusso laminare sterile imbevuto di cloruro di sodio 0,9% contenente sodio citrato 55mm e mettere in ciascun pozzetto della piastra 6-bene.
- Preparare una bacinella e diluire 1:100 Betadine soluzione con acqua di rubinetto.
- Immergere la coda tutta bovina in una bacinella contenente soluzione di Betadine 1% per 5 min.
- In breve coda a secco con garza sterile e posizionarlo sul posto di lavoro sterile.
- Rimuovere con cautela muscolare intorno alla coda, con lama di bisturi # 22.
- Tritare via le parti della coda che non sono necessari, di solito entrambe le estremità della coda, che contengono relativamente grandi e molto piccoliIVD (Fig. 3).
- Tagliare ulteriormente il muscolo ei tendini di tutto il IVD con lama di bisturi # 10. Attenzione a non tagliare l'anello esterno del disco.
- Marchio anteriore del DIV con un pennarello la pelle chirurgico (questo passaggio è facoltativo, aiuta a determinare il centro di rotazione assiale nel nostro bioreattore).
- Individuare il punto di connessione e IVD vertebra muovendo la coda delicatamente. Sentite il confine tra IVD e ossa con il lato opaco della lama di un bisturi. Il sito di scissione dovrebbe essere 1-2 mm di distanza del DIV verso la vertebra. Luogo fatto su misura titolare industriale lama sul sito di scissione (Fig. 4).
- Cleave IVD e vertebra martellando sulla parte superiore della misura portalama industriali (Fig. 3).
- Ripetere sul lato opposto della IVD-vertebra connessione.
- Avvolgere isolato IVD con garza sterile inumidita con sodio cloruro 0,9% contenente sodio citrato 55mm.
- Continua l'isolamento della IVD al numero del campione desiderato (di solito circa 6 possonoessere raccolta con diametro compreso tra 10-20 mm).
- Collegare il sistema di lavaggio a getto (Zimmer, inc.) Con la soluzione sterile di Ringer lattato, 5L borse sono di dimensioni utili (in alternativa PBS sterile o soluzione salina allo 0,9%).
- Tenere il IVD con una pinza e jet-lavaggio entrambi i lati della superficie di placca mediante Zimmer Pulsavac jet-lavaggio del sistema (Fig. 1C). La pistola a getto dovrebbe essere girato in superficie placca con un angolo tra i 30 - 60 ° per circa 30 anni su ogni lato. (Fig. 1 e 7)
- Mettere il IVD indietro al 6 pozzetti e avvolgere con una garza umida, mentre il lavaggio a getto d'un altro campione del disco.
- IVD sono pronti per la cultura d'organo ea valle applicazioni (ad esempio, la vitalità delle cellule, il carico meccanico, la cultura d'organo) (Fig. 1D).
2. Rappresentante Risultati
Misure di outcome per giudicare la preparazione di successo disco intervertebrale può essere un esperimento di diffusione in cui un colorante fluorescente piccolo peso molecolare (ad esempio Procion rosso)è pronta come una soluzione all'1% in PBS 2. Il IVD è poi mantenuto con almeno 100 ml di soluzione colorante e il colorante viene poi consentito di diffondere passivamente nel IVD per 24 ore sotto gonfiore libero. Il IVD è poi flash-congelato in azoto liquido e riportato a temperatura ambiente e disidratati da una serie di trasferimenti di acetone (primo pre-raffreddata a -80 ° C, -20 ° C, poi a 4 ° C e, infine, a temperatura ambiente ). Il disco può essere incorporato in poli-metil-acrilato (PMMA) e tagliare con una lama affilata per la produzione di 100 micron di spessore sezioni. Queste sezioni possono poi essere visualizzati da qualsiasi microscopio a campo chiaro standard, ma preferibilmente con l'utilizzo del microscopio a fluorescenza dal Procion rosso emette una fluorescenza rossa (fig. 5-6). Il trabeculi della superficie ossea appaiono molto pulita dopo la fase di getto lavaging (Fig. 7).
Parametri per una cultura organo di successo sono prima di tutto l'assenza di contaminazione, la vitalità cellulare mantenuto (fig. 8-9), l'altezza del disco egenerale "integrità disco", misurata con sezioni istologiche e safranina O / verde veloce macchia o Meyer Hematoxilin 3. Abbiamo sviluppato i protocolli e le macro pubblicati altrove 4,5 a macchia tessuto vivo del disco e la vitalità cellulare per la scansione in 3D utilizzando un microscopio confocale a scansione laser e il kit di colorazione Live / Dead (Molecular Probes, Invitrogen, Basilea, Svizzera). Abbiamo inoltre sviluppato una macro e routine per eseguire il conteggio delle cellule automatizzati per valutare la vitalità cellulare dei tessuti 3D o vettori 3D utilizzando la piattaforma NIH ImageJ 4-6. Protocolli alternativi sono stati proposti per determinare la vitalità cellulare delle cellule disco digestione iniziale tramite digestione sequenziale della matrice extracellulare con pronasi e collagenasi di tipo 2 e poi a macchiare la sospensione cellulare 7. Una precedente versione del protocollo coinvolto un passo di incubazione in PBS contenente dieci volte più concentrato concentrazione della penicillina / streptomicina per 10 minuti dopo la raccolta dei dischi precedenti organo culture. Con la fase di lavaggio a getto questo passo diventa obsoleto dal momento che questo passo sembra economici per scopi coltura.
Figura 1. Panoramica delle fasi metodologiche per preparare bovina coccigeo dischi intervertebrali con piastre laterali intatte e un sottile strato (1-2mm) di osso. A) Rappresentazione schematica del disco intervertebrale (IVD) e dei suoi percorsi nutrizionali. B) Procedura per tagliare il IVD con una lama personalizzato dell'assicurazione e un industriale lama affilata. C) passo lavaggio Jet per garantire la vitalità delle cellule e alta per permettere lo scambio di nutrienti mantenendo le placche terminali e 1-2 mm di osso su entrambi i lati. D) Infine l'IVD può essere coltivato nella camera esemplare di un bioreattore o essere utilizzato per qualsiasi applicazione a valle.
Figura 2 TOP:. Completi coda lunghezza bovine fresche (idealmente obtaINED entro 2-3 ore post-mortem per garantire la vitalità delle cellule alte. In basso: X-ray immagine di una coda bovina di età compresa tra circa 6 mesi che illustrano l'esistenza di cartilagini di accrescimento (GP), centro secondario di ossificazione, tra le placche ossee (EP) e gli organismi vertebra (VB).
Figura 3. A) Strumenti per sezionare la coda bovina in condizioni sterili. B) su misura porta lama per tagliare-out segmenti motional dalla coda bovina in azione durante il taglio del disco intervertebrale. C) Vista laterale della lama su misura porta con una lama standard industriali (Lutz, Germania).
Figura 4. Disegno e immagine della coda bovina dopo aver rimosso il muscolo circostante e legamenti che illustrano i siti tenendoti unito a tagliare i segmenti di movimento. Parziale vertebra dovrebbe essere "rotto" wi° la misura portalama idealmente 1-2 mm di distanza dal placche cartilaginee per assicurarsi che la superficie totale delle ossa.
Figura 5. Dimostrazione della pulizia efficace del jet-lavaggio passo prima (A) e dopo (B). Notare la pulizia delle superfici ossee dei segmenti del disco intervertebrale dopo la procedura di spruzzatura.
Figura 6. Free-gonfiore esperimento di diffusione di preparati al momento dischi intervertebrali escisse coda bovina (IVD) ha lasciato per 24 ore in soluzione Procion 1% rosso, a dimostrazione dell'effetto blocco da parte della cartilagine di accrescimento. Una radiografia digitale sagittale di un IVD ancora contenenti la cartilagine di accrescimento e un secondo strato di tessuto osseo immagine di microscopia a fluorescenza di taglio sagittale attraverso l'espianto coccigeo bovina disco intervertebrale con placca cartilaginea ed ossea dopo 24h libera diffusione. GP: cartilagine di accrescimento, 2ndry CO: centro secondario di ossificazione.
Figura 7. Free-gonfiore esperimento di preparati al momento dischi intervertebrali escisse coda bovina (IVD) ha lasciato per 24 ore in soluzione Procion 1% rosso, dimostrando la pulizia effetto del trattamento getto lavaggio. Sagittale sezioni spesse (~ 100 mm) di escisse IVD bovina con piastre laterali ~ 1,5 mmthick ossei sottoposti a trattamento a getto lavaggio (a sinistra) laterali di controllo senza trattamento (Destra) jet-lavaged trattamento. Ingresso mostra il modello di spruzzo, che è stato utilizzato dalla ferita Zimmer sistema debridement esperimenti di diffusione 24 ore gratuitamente bovina espianti disco intervertebrale in rosso Procion 1%.
Figura 8. Immagini Live / Dead di proiezioni di confocale stack Imaging (250μm) prelevati da bovinsegmenti del disco intervertebrale e preparati con tale metodo di lavaggio jet-tenuto sotto free-gonfiore per 0 e 14 giorni rispettivamente per il nucleo polposo (NP), l'interno anello fibroso (IA) e l'anello esterno fibroso (OA). Cellule verde = cellule vive macchiate da calceina AM (acetil metilico), globuli rossi = nucleo morto cellule colorate con etidio omodimero-1.
Figura 9. Vitalità delle cellule del disco intervertebrale utilizzando la microscopia confocale a scansione laser sul tessuto vivo e la scansione dello stack 3D. La vitalità delle cellule del nucleo polposo (NP) e Annulus fibrosi (AF) sul-21 giorno-cultura in free-gonfiore condizione. (Media ± SEM, N = 6) Le differenze statistiche sono state testate utilizzando non parametrico di Kruskal-Wallis firmato somma rank test tra i gruppi. State riscontrate differenze significative tra il giorno 21 e tutti i punti altro momento della NP. Mentre in AF differenze significative sono state trovate tra il giorno 7 agiorno 0. (* P <0,05, ** p <0,01).
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Discussion
Il primo passo per la cultura d'organo di successo è quello di assicurarsi che l'espianto non dovrebbe essere contaminato. La coda deve essere scuoiati prima di iniziare la procedura. Qualsiasi peli portato in un laboratorio sterile potrebbe essere problematico in termini di contaminazione. La coda bovina dovrebbe idealmente essere il più fresco possibile (questo influenza la vitalità iniziale delle cellule). Inoltre, la fase di lavaggio betadine si raccomanda di ridurre il rischio di ulteriori contaminazioni. Invece di usare una misura porta lama e un martello per separare il IVD dal corpo vertebra, questo potrebbe essere eseguita utilizzando una sega a nastro istologico (il disco diamantato deve essere raffreddato con PBS o soluzione di Ringer durante il taglio). Da notare che la sega a nastro, il porta-campione e la lama di taglio devono essere sterili. La tecnica ha dimostrato qui non si limita all'isolamento coda bovina IVD, ma può essere esteso ad altre specie animali quali suini, ovini e leporino caudale o isolamento IVD anche lombare. Per IVD harvest nella regione in cui i processi spinali sono presenti, è importante rimuovere tutti i primi processi.
I dati sulla vitalità cellulare dato in figura 9 sono stati raccolti in free-gonfiore per un massimo di 21 giorni e può essere utilizzato come riferimento. Questo metodo mantiene la vitalità delle cellule per 14 giorni sotto free-gonfiore. Il calo della vitalità cellulare a 21 giorni potrebbe essere dovuto alla mancanza di carico meccanico che ha dimostrato di essere importante per aiutare la diffusione dei nutrienti attraverso le placche terminali e per mantenere la vitalità cellulare disco 3. Sarà molto probabile che la vitalità cellulare sarà ancora più alto sotto compressione idrostatica e / o aggiuntive 8-10 carico diurna.
Come un protocollo alternativo, i dischi dei bovini può essere preparato, eliminando tutti l'osso adiacente delle vertebre mediante una frese e lasciando solo le placche terminali cartilagineo 11. La vitalità delle cellule IVD è stata mantenuta per 4 settimane, utilizzando questo metodo.Tuttavia, in questo caso torsione non può essere applicata in un modo diretto per i segmenti motional poiché non vi è osso duro a disposizione di "afferrare" il disco. La concava placche al posto di un superfici parallele su entrambi i lati ha anche bisogno di un adeguamento della camera campione in qualsiasi disegno bioreattore per spiegare le differenze profilo di carico 11. Inoltre, la valutazione della diffusione di molecole attraverso placche ossee inoltre, non è forse in questi espianti.
Significato del nostro lavoro
- L'utilizzo di lame industriali singolo utilizzo di cut-out intatto segmenti disco intervertebrale per la cultura d'organo abbrevia il protocollo di raccolta notevolmente rispetto a protocolli che comportano un taglio passo con una banda istologica visto. Anche la struttura trabecolare dell'osso è influenzato come è il caso di un movimento di macinazione con un diamante lama.
- Jet-lavaging della superficie ossea lava-out coaguli di sangue in modo molto efficiente e SIgnificantly migliora la vitalità cellulare del nucleo polposo (parte centrale del disco) nel tempo rispetto ai non trattati dischi intervertebrali.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo progetto è stato sostenuto dal Fondo Nazionale Svizzero (FNS # 310030-127586/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fresh bovine intervertebral disc tissue from bovine tails, from local slaughter house (ideally within hours post-mortem and without skin). | |||
| Pulsavac Plus AC System | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-486-01 | Best performance with the hip-spray head and with AC power supply (the one with the 8 AA battery pack d–s also work but is less convenient) |
| High Capacity Fan Spray w/Splash Shield, 12.7cm length | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-175-00 | There are several spray heads available, we tested this one successfully |
| Scalpel blades #22 and #10 | Swann-Morton | #10: 0201 #22: 0208 | |
| Scalpel blade holder # 3 and #4 | Hausmann, Germany | #3: 06.103.00 #4: 06.104.00 | |
| Lutz industrial blade | Lutz, Germany | 1022.0884 | |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11960-044 | |
| Lactated Ringer’s solution (without glucose) | Bichsel, Switzerland | 133 0002 | |
| 6-well multi-well plate | Techno Plastic Products | 92006 | |
| Betadine solution | Mundipharma, Switzerland | 10055025 | |
| Surgical skin marker | Porex Surgical, Switzerland | 9560 | |
| Large cutting board | Any brand is possible |
References
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