Summary
Este protocolo ilustra uma técnica de colheita, para coccígea bovina discos intervertebrais para a cultura de órgãos para
Abstract
O disco intervertebral (IVD) é a articulação da coluna vertebral conectando vértebra em vértebra. Ele funciona para transmitir carga de coluna vertebral e dar flexibilidade à coluna vertebral. Compõe de três compartimentos: o núcleo pulposo interior (NP) que abrange pelo anel fibroso (AF) e duas placas terminais cartilaginosas que liga o NP e AF do corpo vertebral em ambos os lados. Dor discogênica possivelmente causada por uma doença degenerativa do disco intervertebral (DDD) e hérnia discal tem sido identificada como um problema grave em nossa sociedade moderna. Para estudar possíveis mecanismos de degeneração IVD, em sistemas de órgãos de cultura in vitro com células de discos ao vivo são altamente atraente. O cultivo in vitro de bovinos intactos IVDs coccígea tem avançado a um sistema-modelo relevante, que permite o estudo de mecano-biológico aspectos em um ambiente bem controlado fisiológicas e mecânicas. IVDs cauda de bovinos podem ser obtidos relativamente fácil em maior número umd são muito semelhantes ao humano IVDs lombar em relação à densidade celular, a população de células e dimensões. No entanto, anterior caudal bovina técnicas de colheita IVD retenção placas terminais cartilaginosas e ósseas placas terminais falhou após 1-2 dias de cultura desde as vias de nutrição foram, obviamente, bloqueada por sangue coagulado. IVDs são os maiores órgãos avascular, assim, os nutrientes para as células do NP são exclusivamente dependentes de difusão através da brotos capilares do corpo vertebral adjacente. Presença de resíduos de osso e sangue coagulado nas superfícies placa motora pode dificultar a difusão de nutrientes para o centro do disco e viabilidade celular compromisso. O nosso grupo estabeleceu um protocolo relativamente rápida de "crack"-out do IVDs da cauda com um baixo risco de contaminação. Somos capazes de permeabilizar o recém-cortadas superfícies ósseas placa terminal usando um sistema de lavagem a jato cirúrgica, que remove os coágulos de sangue e restos de corte e de forma muito eficiente reabre o caminho de difusão de nutriçãopara o centro do IVD. A presença de placas de crescimento em ambos os lados do osso vertebral tem que ser evitado e ser removidos antes da cultura. Neste vídeo, que descrevem as etapas cruciais durante a preparação e demonstrar a chave para uma cultura de órgão bem-sucedido manter a viabilidade celular de alta por 14 dias, sob inchaço cultura livre. O tempo de cultura poderia ser estendido quando o ambiente mecânico adequado pode ser mantida usando biorreator carga mecânica. A técnica demonstrada aqui pode ser estendido a outras espécies animais, como suínos, ovinos e isolamento caudal e lombar leporinos IVD.
Protocol
1. A colheita do disco intervertebral
- Cauda bovina toda comprimento é obtido a partir de um matadouro local, se possível sem pele, pois a presença de pele aumenta a chance de contaminação (Fig. 2).
- Prepare tábua de cortar e preparar grandes estação de trabalho estéril e instrumentos em cima de uma tábua de corte (Fig. 2).
- Prepare sob a gaze estéril capa de fluxo laminar estéril umedecido com cloreto de sódio 0,9% contendo citrato de sódio 55mm e colocado em cada poço da placa de 6 poços.
- Prepare uma bacia e diluir 1:100 de solução Betadine com água da torneira.
- Mergulhe a cauda inteira bovina em uma bacia contendo solução de Betadine 1% por 5 min.
- Brevemente cauda seca com gaze estéril e colocá-lo na estação de trabalho estéril.
- Remova cuidadosamente muscular ao redor da cauda com lâmina de bisturi # 22.
- Corta fora as partes da cauda, que não são necessários, normalmente ambas as extremidades da cauda, que contêm relativamente grandes e muito pequenosIVDs (Fig. 3).
- Guarnição ainda mais o músculo e tendões ao redor do IVD utilizando lâmina de bisturi n º 10. Cuidado para não cortar o anel externo dos discos.
- Marca anterior da IVD com um marcador de pele cirúrgica (este passo é opcional, ele ajuda a determinar o centro de rotação axial em nosso biorreator).
- Localize o IVD e vértebra ponto de conexão, movendo a cauda suavemente. Sinta-se a fronteira entre IVD e osso com o lado chato de uma lâmina de bisturi. O site clivagem deve ser de 1-2 mm de distância do IVD para a vértebra. Personalizado lugar feito lâmina industrial no site clivagem (Fig. 4).
- Cleave e IVD vértebra martelando em cima do suporte de lâmina custom-made industrial (Fig. 3).
- Repita do outro lado da conexão IVD-vértebra.
- Enrole isolado IVD com gaze esterilizada umedecida com cloreto de sódio 0,9% contendo citrato de sódio 55mm.
- Continue o isolamento de IVDs para o número da amostra desejada (geralmente em torno de 6 podeser colhida com diâmetro entre 10-20 mm).
- Conectar o sistema de lavagem a jato (Zimmer, inc.) Com solução de Ringer Lactato estéril é, 5L sacos são um tamanho útil (PBS estéril ou, alternativamente solução salina 0,9%).
- Segure o IVD com uma pinça e jato de lavagem ambos os lados da superfície de placa terminal usando Zimmer Pulsavac sistema de jato de lavagem (Fig. 1C). A arma do jato deveria ser fuzilada na superfície da placa terminal em um ângulo entre 30 - 60 ° por cerca de 30s de cada lado. (Figs. 1 e 7)
- Coloque o IVDs volta para a placa 6-bem e enrole com uma gaze umedecida, enquanto a jato de lavar outra amostra do disco.
- IVDs estão prontos para a cultura de órgãos ea jusante aplicações (por exemplo, a viabilidade celular, carga mecânica, a cultura de órgãos) (Figura 1D).
2. Resultados representante
Avaliação dos resultados de julgar uma preparação do disco intervertebral de sucesso pode ser uma experiência de difusão onde um corante fluorescente de baixo peso molecular (por exemplo, vermelho Procion)é preparado como uma solução a 1% em PBS 2. O IVD é mantida com pelo menos 100 mL de solução corante e do corante é permitido então difusa passivamente no IVD por 24h sob inchaço livre. O IVD é, então, flash-congelados em nitrogênio líquido e trazido de volta à temperatura ambiente e desidratados por uma série de transferências de acetona (primeiro pré-resfriada em -80 ° C, em seguida, -20 ° C, então 4 ° C e, finalmente, à temperatura ambiente ). O disco pode então ser incorporados em poli-metil-acrilato (PMMA) e cortar com uma lâmina afiada para produzir 100 mm de espessura. Essas seções podem ser visualizados por qualquer microscópio de campo claro padrão, mas preferencialmente pelo uso de microscopia de fluorescência desde Procion vermelha emite uma fluorescência vermelha (Figs. 5-6). O trabéculas da superfície óssea aparecem muito limpo após a etapa lavaging jet (Fig. 7).
Parâmetros para uma cultura de órgão bem-sucedidos são, antes de tudo a ausência de contaminação viabilidade celular, mantido (Figs. 8-9), altura do disco e"integridade do disco" em geral, medida com cortes histológicos e safranina O / verde rápido mancha ou Hematoxilina de Meyer 3. Nós desenvolvemos protocolos e macros publicados em outros lugares 4,5 a mancha tecido do disco ao vivo e para verificar a viabilidade das células em 3D usando um microscópio de varredura confocal a laser eo kit de coloração ao vivo / morto (Molecular Probes, Invitrogen, Basel, Suíça). Nós ainda desenvolveu uma macro e de rotina para realizar a contagem de células automatizado para estimar a viabilidade das células no tecido 3D ou portadores 3D usando a plataforma ImageJ NIH 4-6. Protocolos alternativos têm sido propostos para determinar a viabilidade das células disco pela digestão inicial usando a digestão sequencial da matriz extracelular utilizando pronase colagenase e tipo 2 e em seguida, para manchar a suspensão de células 7. Uma versão anterior do protocolo envolveu um passo de incubação no PBS contendo dez vezes mais concentrado concentração de penicilina / estreptomicina por 10 min após a colheita dos discos anteriores órgão cuLTURE. Com o passo a lavagem a jato esta etapa torna-se obsoleta, pois esta etapa parece benéfica para fins de cultura.
Figura 1. Visão geral das etapas metodológicas para preparar bovina coccígea discos intervertebrais com placas terminais intactas e uma fina camada (1-2mm) do osso. A) Visão esquemática do disco intervertebral (IVD) e seus caminhos nutricionais. B) Procedimento para cortar o IVD com um personalizado porta-lâmina e uma lâmina afiada industrial. C) lavagem Jet passo para garantir a viabilidade das células de alta e para permitir a troca de nutrientes mantendo a placas e 1-2 mm de osso anexado em ambos os lados. D) Finalmente, o IVD podem ser cultivadas na câmara de espécime de um biorreator ou ser usado para qualquer aplicação a jusante.
Figura 2 TOP:. Todo o comprimento da cauda de bovino fresca (de preferência obtaINED dentro de 2-3 horas post-mortem para garantir a viabilidade das células de altura. Baixo: imagem de raios-X de uma cauda de bovinos com idade entre cerca de 6 meses, ilustrando a existência de placas de crescimento (GP), centro secundário de ossificação, entre as placas ósseas (EP) e os corpos vertebrais (VB).
Figura 3. A Tools) para dissecar a cauda bovina em condições estéreis. B) Customized porta-lâmina para cortar-out segmentos dinâmicas da cauda de bovinos de corte em ação, enquanto o disco intervertebral. C) Vista lateral do porta-lâmina personalizado com uma lâmina de padrão industrial (Lutz, Alemanha).
Figura 4. Desenho e imagem da cauda bovina após a remoção do ligamento muscular circundante e ilustrando os sites cleaving para cortar os segmentos de dinâmicas. Vértebra parcial deve ser "rachado" wiª o porta-lâmina custom-made idealmente 1-2 mm de distância da placas terminais cartilaginosas para garantir superfície óssea completa.
Figura 5. Demonstração da limpeza eficaz da etapa de lavagem a jato, antes (A) e após (B). Observe as superfícies limpas óssea dos segmentos do disco intervertebral após o procedimento de pulverização.
Figura 6. Free-inchaço experiência difusão de recém-preparados excisadas discos cauda bovina intervertebral (IVDs) saiu por 24 horas em solução Procion 1% vermelho, demonstrando efeito bloqueio pela placa de crescimento. A vista digitais de raios-X sagital de um IVD ainda contendo a placa de crescimento e uma segunda camada de imagem de microscopia fluorescente de osso corte sagital através do explante disco intervertebral coccígea bovina com placa terminal cartilaginosa e óssea após 24h livre difusão. GP: placa de crescimento, 2ndry CO: centro secundário de ossificação.
Figura 7. Free-inchaço experiência de recém-preparados excisadas discos cauda bovina intervertebral (IVDs) saiu por 24 horas em solução Procion 1% vermelho, demonstrando efeito do tratamento de limpeza a jato lavagem. Sagital de espessura (~ 100 mm) de excisadas IVDs bovina com ~ 1,5 mmthick placas final ósseo que sofreu lavagem a jato de tratamento (Esquerda) lado controle sem tratamento (Direito) jet-lavaged tratamento. Entrada mostra o padrão de pulverização, que foi usado a partir do sistema Zimmer desbridamento da ferida 24h experimentos livre difusão de bovinos explantes disco intervertebral em vermelho Procion 1%.
Figura 8. Images Live / Dead of projeções de pilhas confocal Imaging (250μm), proveniente de bovinsegmentos do disco intervertebral e preparado com este método a jato de lavagem mantidos sob livre inchaço para 0 e 14 dias respectivamente para o núcleo pulposo (NP), o interior anel fibroso (IA) eo anel fibroso exterior (OA). Células verde = células vivas manchada pelo calceína AM (acetil metílico), glóbulos vermelhos = núcleo células mortas coradas pelo homodímero de etídio-1.
Figura 9. Viabilidade celular de disco intervertebral usando microscopia confocal a laser de varredura em tecido vivo e digitalização 3D de pilha. A viabilidade das células de núcleo pulposo (NP) e fibrose do anel (AF) ao longo dos 21 dias de cultura em free-inchaço condição. (Média ± EPM, N = 6) As diferenças estatísticas foram testados usando não-paramétrico Kruskal-Wallis assinado Rank Sum Test entre os grupos. Foram encontradas diferenças significativas entre o dia 21 e todos os pontos de outra época da NP. Enquanto na AF diferenças significativas foram encontradas entre os dias 7 adia 0. (* P <0,05, ** p <0,01).
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Discussion
O primeiro passo para a cultura de órgão bem-sucedido é ter certeza de que o explante não deve ser contaminada. A cauda deve ser descascado antes de começar com o procedimento. Qualquer pêlos levados a um laboratório estéril pode ser problemático em termos de contaminação. A cauda bovina deveriam idealmente ser o mais fresco possível (isso afeta a viabilidade celular inicial). Além disso, a etapa de lavagem betadine é recomendada para reduzir o risco de novas contaminações. Em vez de usar uma lâmina custom-made e um martelo para separar o IVD do corpo vértebra, isso pode ser feito usando uma serra de fita histológico (a lâmina de diamante deve ser resfriado com PBS ou solução de Ringer durante o corte). Note que a serra de fita, o titular da amostra e da lâmina de corte deve ser estéril. A técnica demonstrada aqui não se limita ao isolamento cauda bovina IVD, mas pode ser estendido a outras espécies animais, como suínos, ovinos e caudal leporinos ou isolamento IVD mesmo lombar. Para IVD harvest na região onde processos espinhosos estão presentes, é importante remover todos os processos em primeiro lugar.
Os dados de viabilidade celular dada na figura 9 foram coletados sob livre inchaço por até 21 dias e pode ser usado como uma referência. Este método mantém a viabilidade celular por 14 dias, sob livre inchaço. A queda da viabilidade celular em 21 dias poderia ser devido à falta de carga mecânica que tem se mostrado importante para auxiliar na difusão de nutrientes através da placas e para manter a viabilidade das células do disco 3. Vai ser muito provável que a viabilidade celular será ainda maior sob compressão hidrostática e / ou adicionais 10/08 carregamento diurno.
Como um protocolo alternativo, os discos bovina pode ser preparado por remoção de todo o osso adjacente das vértebras usando uma broca dental e apenas deixando a placas terminais cartilaginosas 11. Viabilidade celular IVD foi mantida durante 4 semanas usando este método.No entanto, neste caso de torção não pode ser aplicada de uma maneira direta para os segmentos de dinâmicas, pois não há ossos duros disponíveis para "agarrar" o disco. O côncavo placas terminais em vez de uma superfícies paralelas de ambos os lados também precisa de um ajuste da câmara de amostras em todo o projeto de biorreatores para explicar as diferenças de perfil de carga 11. Além disso, a avaliação da difusão das moléculas através de placas terminais ósseas também não é possível nestes explantes.
Importância do nosso trabalho
- O uso de um único uso de lâminas industriais para cortar-out intacta segmentos do disco intervertebral para a cultura de órgãos encurta o protocolo de colheita consideravelmente em relação aos protocolos que envolvem um corte passo com uma banda histológicos viu. Também a estrutura do osso trabecular é afetada como é o caso de um movimento de moagem com uma serra de diamante lâmina.
- Jet lavaging da superfície óssea lava-out de sangue coagulado de forma muito eficiente e significantly melhora a viabilidade das células do núcleo pulposo (centro do disco) ao longo do tempo em comparação com não tratada discos intervertebrais.
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Disclosures
Não temos nada a revelar.
Acknowledgments
Este projecto foi apoiado pela National Science Foundation suíço (SNF # 310030-127586/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fresh bovine intervertebral disc tissue from bovine tails, from local slaughter house (ideally within hours post-mortem and without skin). | |||
| Pulsavac Plus AC System | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-486-01 | Best performance with the hip-spray head and with AC power supply (the one with the 8 AA battery pack d–s also work but is less convenient) |
| High Capacity Fan Spray w/Splash Shield, 12.7cm length | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-175-00 | There are several spray heads available, we tested this one successfully |
| Scalpel blades #22 and #10 | Swann-Morton | #10: 0201 #22: 0208 | |
| Scalpel blade holder # 3 and #4 | Hausmann, Germany | #3: 06.103.00 #4: 06.104.00 | |
| Lutz industrial blade | Lutz, Germany | 1022.0884 | |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11960-044 | |
| Lactated Ringer’s solution (without glucose) | Bichsel, Switzerland | 133 0002 | |
| 6-well multi-well plate | Techno Plastic Products | 92006 | |
| Betadine solution | Mundipharma, Switzerland | 10055025 | |
| Surgical skin marker | Porex Surgical, Switzerland | 9560 | |
| Large cutting board | Any brand is possible |
References
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