Summary
Этот протокол иллюстрирует уборки методика копчикового бычьего межпозвоночных дисков для органа культуры
Abstract
Межпозвонкового диска (IVD) является стык соединения позвоночника позвонка к позвонку. Он функционирует передавать загрузку позвоночника и придаст гибкость позвоночника. Она слагается из трех отсеков: внутренний пульпозного ядра (НП), охватывающий от фиброзного кольца (AF) и два хрящевых концевые соединения Н. П. и А. Ф. в тело позвонка с обеих сторон. Дискогенная боль может быть вызвана дегенеративных заболеваний межпозвоночных дисков (DDD) и дисковые грыжи была определена в качестве одной из основных проблем в нашем современном обществе. Для изучения возможных механизмов IVD дегенерации, в пробирке органной культуры систем с живыми клетками диск очень привлекательным. В пробирке культуру нетронутым бычьего копчикового IVDs зашел настолько далеко, соответствующие модели системы, которая позволяет изучение механо-биологические аспекты в хорошо контролируемых физиологических и механических окружающей среды. Говядина IVDs хвост может быть получен сравнительно легко в большем количествеD очень похожи на человеческие поясничного IVDs по отношению к плотности клеток, клеточной популяции и размеров. Тем не менее, предыдущие бычьей хвостовой IVD методы добычи сохраняя хрящевые и костные концевые концевые удалось через 1-2 дней культуры с питанием пути были явно заблокированы сгустками крови. IVDs являются крупнейшими аваскулярный органов, таким образом, питательные вещества для клеток в НП исключительно зависит от диффузии через капиллярные почек от соседних тел позвонков. Наличие мусора костей и запекшейся крови на концевой пластинки поверхности могут мешать питательных диффузии в центр круга и жизнеспособность компромисс клетки. Наша группа, созданная относительно быстрый протокол для «крэк»-из IVDs из хвоста с низким риском заражения. Мы в состоянии permeabilize свежих вырезать костлявые поверхности концевой пластинки с помощью хирургической системы промывания струей, которая удаляет тромбов и резки мусора и очень эффективно вновь открывается путь питания диффузиик центру IVD. Наличие роста пластин по обе стороны от позвоночного кости, которых следует избегать, и должен быть удален до культуры. В этом видео мы опишем важнейшие шаги в процессе подготовки и демонстрации ключ к успешной органной культуры поддержания высокой жизнеспособности клеток в течение 14 дней в условиях свободного отек культуры. Культуры времени может быть продлен в случае необходимости механической среде может быть обеспечена с помощью механических биореактор нагрузки. Техника показала здесь может быть распространен и на другие виды животных, таких как свиньи, овцы и заячий хвостовой и поясничного IVD изоляции.
Protocol
1. Межпозвонковых дисков Уборочная
- Всего хвост бычий длина получается из местной скотобойни, если это возможно без кожи с наличием кожи повышает вероятность заражения (рис. 2).
- Подготовка большой доской и подготовки стерильной рабочей станции и инструментов в верхней части разделочную доску (рис. 2).
- Подготовка под стерильный ламинарный поток капот стерильной марлей смоченной 0,9% натрия хлорида содержащие 55mm цитрат натрия и положить в каждую лунку по 6-луночный планшет.
- Подготовка бассейна и разводят 1:100 Бетадин раствор с водопроводной водой.
- Погрузитесь целом бычий хвост в бассейне, содержащем 1% раствор Бетадин в течение 5 мин.
- Кратко сухой хвост с стерильную марлю и положите его на стерильную рабочую станцию.
- Осторожно снимите мышцы вокруг хвоста с лезвие скальпеля № 22.
- Чоп от части хвоста, которые не нужны, как правило, оба конца хвоста, которые содержат относительно большие и очень маленькиеIVDs (рис. 3).
- Trim дальнейшего мышцы и сухожилия вокруг IVD использованием лезвие скальпеля № 10. Осторожно, чтобы не порезать внешнее кольцо из дисков.
- Марк передние из IVD с хирургической маркер кожи (этот шаг не является обязательным, оно помогает определить центр осевого вращения в нашей биореактор).
- Найдите IVD и позвонком точки подключения, перемещая хвост мягко. Почувствуйте, граница между IVD и кости с тупой стороны лезвие скальпеля. Рассекая сайт должен быть на 1-2 мм друг от IVD к позвонка. Место на заказ промышленных держатель лезвие на сайте расщепления (рис. 4).
- Клив IVD и позвонка ковкой на вершине заказных промышленных держателя лезвия (рис. 3).
- Повторите с другой стороны IVD-позвонка соединения.
- Оберните изолированных IVD стерильной марлей смоченной 0,9% натрия хлорида содержащие 55mm цитрата натрия.
- Продолжить изоляции IVDs на желаемый номер пробы (обычно около 6 можетбыть собраны с диаметром 10-20 мм).
- Подключите систему струи лаважа (Zimmer, Inc.) С стерильного раствора лактата Рингера, 5л мешки полезной размера (или стерильной PBS или на 0,9% солевого раствора).
- Держите IVD пинцетом и реактивных промывание обе стороны концевой пластинки поверхности с помощью Zimmer Pulsavac реактивных промывание системы (рис. 1в). Струя ружье должно быть снят на концевой пластинки поверхности под углом от 30 до - 60 ° в течение приблизительно 30 с каждой стороны. (Рис. 1 и 7)
- Положите IVDs назад к 6-луночного планшета и обертывание с смоченную марлю в то время как струя стиральной другой диск образца.
- IVDs готовы к органной культуры и вниз по течению приложений (например, жизнеспособность клеток, механические нагрузки, органные культуры) (рис. 1D).
2. Представитель Результаты
Результат измерений судить успешной подготовки межпозвонковых дисков может быть диффузия эксперимент, в котором небольшая молекулярная масса флуоресцентного красителя (например, procion красный)готовят 1% раствор в PBS 2. IVD затем хранится по меньшей мере 100 мл раствора красителя и красителя затем дают диффузное пассивно в IVD в течение 24 часов в условиях свободного набухания. IVD затем флэш-замораживали в жидком азоте и возвращены до комнатной температуры и обезвоженной рядом ацетон трансфертов (первая предварительно охлаждается в -80 ° С, то -20 ° С, затем 4 ° C и, наконец, до комнатной температуры ). Диск может быть встроен в поли-метил-акрилата (ПММА) и разрезать острым лезвием, чтобы произвести 100 мкм толщиной разделов. Эти секции могут быть просмотрены любым стандартным микроскоп светлого, но преимущественно на использование флуоресцентной микроскопии с procion красный излучает красной флуоресценции (рис. 5-6). Trabeculi костной поверхности появляются очень чистым после шага струи lavaging (рис. 7).
Параметры для успешного органной культуры, прежде всего, отсутствие загрязнения, поддерживать жизнеспособность клеток (рис. 8-9), дисковые высоты иобщий "диск целостности", измеренная с гистологических срезов и сафранина O / прочным зеленым пятном или гематоксилином Майера 3. Мы разработали протоколы и макросы опубликованы в другом месте 4,5 до пятна живой ткани диска и проверить жизнеспособность клеток в 3D с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и живой / мертвый окрашивания комплект (Molecular Probes, Invitrogen, Базель, Швейцария). Кроме того, мы разработали макро-и рутины для выполнения автоматизированного подсчета клеток для оценки жизнеспособности клеток в ткани 3D или 3D-носителей с использованием платформы NIH ImageJ 4-6. Альтернативные протоколы были предложены для определения жизнеспособности клеток диска клетки начальными пищеварения использованием последовательного усвоения внеклеточной матрицы с помощью проназы и коллагеназы типа 2, а затем окрасить клеточной суспензии 7. Ранняя версия протокола участвует инкубации в PBS содержащего в десять раз более концентрированный пенициллина / стрептомицина концентрации в течение 10 минут после уборки дисков до органов у.е.lture. С шагом промывания струей этот шаг устаревает так как этот шаг кажется выгодным для культивирования целей.
Рисунок 1. Обзор методологические шаги по подготовке бычьего копчикового межпозвонковых дисков с неповрежденными концевые и тонким слоем (1-2мм) кости. А) Схематическое изображение межпозвонкового диска (IVD) и его питательной путей. Б) Порядок вырезать IVD с индивидуальным блейд-держатель и промышленных острое лезвие. C) Jet промывание шаг для обеспечения высокой жизнеспособности клеток и дать возможность обмена питательных соответствии концевые и 1-2 мм костной прилагается с обеих сторон. Г) Наконец IVD может быть культурным в образце палаты биореакторе или быть использована для любых вниз по течению приложения.
Рисунок 2 ТОП:. Полная длина свежий коровий хвост (в идеале obtaINED в течение 2-3 часов после вскрытия, чтобы обеспечить высокую жизнеспособность клеток. Внизу: рентгеновское изображение из бычьего хвоста в возрасте около 6 месяцев, иллюстрирующие существование роста пластин (GP), резервный центр окостенения, между костлявыми концевые (EP) и позвонка органов (VB).
Рисунок 3.) Инструменты препарировать бычий хвост в стерильных условиях. Б) Индивидуальные блейд-держатель для выреза двигательного сегмента с бычьим хвостом в действии во время резки межпозвонкового диска. С) Побочные учетом индивидуальных лезвие-держатель с лезвием стандартные промышленные (Lutz, Германия).
Рисунок 4. Рисунок и картина бычьего хвоста после удаления окружающих мышц и связок иллюстрирующие рассекая сайтов вырезать двигательного сегмента. Частичное позвонка должно быть "трещины" Wiм на заказ лезвия держатель идеально 1-2 мм от хрящевых концевые для обеспечения полной поверхности кости.
Рисунок 5. Демонстрация эффективной очистки реактивных промывание шаг до (А) и после (Б). Обратите внимание на чистой поверхности костлявые межпозвоночных сегментов диска после распыления процедуры.
Рисунок 6. Свободной диффузии отек эксперимент свежеприготовленной вырезали бычьего хвоста межпозвонковых дисков (IVDs) оставил в течение 24 часов в 1% procion красный раствор, демонстрируя блокада эффект роста пластины. Цифрового рентгеновского сагиттальной зрения IVD еще содержащий пластины роста и второй слой кости флуоресцентное изображение микроскопии сагиттальной прорезать копчикового бычьего межпозвонковых дисков с эксплантов хрящевые и костные концевой пластинки после 24h свободной диффузии. GP: рост пластины, 2ndry CO: резервный центр окостенения.
Рисунок 7. Свободной отек эксперимент свежеприготовленной вырезали бычьего хвоста межпозвонковых дисков (IVDs) оставил в течение 24 часов в 1% procion красный раствор, демонстрируя эффект очистки реактивных промывание лечения. Сагиттальный толстым слоем (~ 100 мм) вырезали бычьего IVDs с ~ 1,5-mmthick костных пластинок конца, прошедших промывание струей лечения (слева) контрольной стороне без лечения (справа) реактивных промывали лечения. Вход показывает, распыления, которая была использована из системы Zimmer раны хирургическая обработка раны 24 часа свободных экспериментов распространение бычьего межпозвоночного диска эксплантов в 1% procion красный.
Рисунок 8. Live / Мертвые изображений проекций конфокальной стеки Imaging (250 мкм), взятые из Бовинэлектронной межпозвоночных сегментов диска подготовлена с этим реактивным промывание метод держать под свободной отеки при 0 и 14 дней соответственно, для студенистого ядра (NP), внутренний фиброзного кольца (IA) и внешнего фиброзного кольца (ОА). Зеленые клетки = живые клетки окрашиваются кальцеин AM (ацетил метиловый), эритроциты = мертвых ядра клеток, окрашенных по этидия гомодимера-1.
Рисунок 9. Жизнеспособность клеток межпозвонковых дисков с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии на живые ткани и 3D сканирование стека. Жизнеспособность клеток из студенистого ядра (НП) и фиброзного кольца (AF) по 21-дневной культуры в условиях свободного отек состоянии. (Среднее ± стандартная ошибка среднего, N = 6) Статистические различия были протестированы с использованием непараметрических Крускала-Уоллиса подписал теста суммы рангов между группами. Значительные различия были обнаружены между 21-й день и все другие моменты времени в НП. Находясь в AF значимых различий между днем от 7 додень 0. (* Р <0,05, ** р <0,01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Первым шагом для успешного органной культуры, чтобы убедиться, что эксплантов не должна быть загрязнена. Хвост должен быть кожей, прежде чем начать с процедуры. Любое животное, волосы привести в стерильной лаборатории, может оказаться проблематичным с точки зрения загрязнения. Бычий хвост в идеале должно быть свеж, как это возможно (это влияет на начальном жизнеспособности клеток). Кроме того, шаг бетадин мытье рекомендуется уменьшить риск загрязнения дальше. Вместо того чтобы использовать заказные держатель ножа и молоток, чтобы отдельные IVD из тела позвонка, то это может быть выполнено с помощью гистологического ленточная пила (алмазный диск должен быть охлажден с PBS или раствор Рингера при резке). Помните, что ленточная пила, держатель образца и лезвия должны быть стерильными. Техника показала здесь не ограничивается бычьего хвоста IVD изоляции, но может быть распространен и на другие виды животных, таких как свиньи, овцы и заячий хвостового или даже поясничного IVD изоляции. Для IVD чАрвест в регионе, где спинного процессы присутствуют, важно, чтобы удалить все процессы в первую очередь.
Жизнеспособность клеток данные приведены на рисунке 9 были собраны в свободном отеки на срок до 21 дней и может быть использован в качестве ссылки. Этот метод сохраняет жизнеспособность клеток в течение 14 дней в условиях свободного набухания. Падение жизнеспособности клеток в 21 дней может быть связано с отсутствием механической нагрузки, которые, как было показано играть важную роль в оказании помощи питательных диффузии через концевые и для поддержания жизнеспособности клеток диска 3. Это будет очень вероятно, что жизнеспособность клеток будет еще выше при всестороннем сжатии и / или дополнительные 8-10 суточные нагрузки.
Как альтернативный протокол, бычий диски могут быть получены путем удаления всех смежных костей позвонков с помощью зубной заусенцев и оставив только хрящевой концевые 11. IVD жизнеспособности клеток поддерживалась в течение 4 недель с помощью этого метода.Тем не менее, в этом случае кручения не могут быть применены в простой способ двигательного сегмента, так как нет жестких костей доступными для "захвата" диска. Вогнутой концевые вместо параллельных поверхностей с обеих сторон также необходимо корректировка образца камеры в любой дизайн биореактор для учета загрузки профиля различия 11. Более того, оценка диффузии молекул через концевые костлявая тоже не возможно, в этих эксплантатах.
Значение нашей работы
- Использование одного использования промышленные лезвия для выреза нетронутыми межпозвоночных сегментов диска для органа культуры сокращает уборки протокола значительно по сравнению с протоколами с участием самые ногу с гистологическим ленточной пилой. Также трабекулярной структуры кости не влияет, как это дело от шлифовального движения с бриллиантом пильного диска.
- Jet-lavaging костной поверхности моет-из свернувшейся крови очень эффективно и сиgnificantly повышает жизнеспособность клеток из студенистого ядра (центра диска) с течением времени по сравнению с необработанными межпозвоночных дисков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Этот проект был поддержан Швейцарским национальным научным фондом (ОЯТ # 310030-127586/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fresh bovine intervertebral disc tissue from bovine tails, from local slaughter house (ideally within hours post-mortem and without skin). | |||
| Pulsavac Plus AC System | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-486-01 | Best performance with the hip-spray head and with AC power supply (the one with the 8 AA battery pack d–s also work but is less convenient) |
| High Capacity Fan Spray w/Splash Shield, 12.7cm length | Zimmer inc., Switzerland | 00-5150-175-00 | There are several spray heads available, we tested this one successfully |
| Scalpel blades #22 and #10 | Swann-Morton | #10: 0201 #22: 0208 | |
| Scalpel blade holder # 3 and #4 | Hausmann, Germany | #3: 06.103.00 #4: 06.104.00 | |
| Lutz industrial blade | Lutz, Germany | 1022.0884 | |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11960-044 | |
| Lactated Ringer’s solution (without glucose) | Bichsel, Switzerland | 133 0002 | |
| 6-well multi-well plate | Techno Plastic Products | 92006 | |
| Betadine solution | Mundipharma, Switzerland | 10055025 | |
| Surgical skin marker | Porex Surgical, Switzerland | 9560 | |
| Large cutting board | Any brand is possible |
References
- Lee, C. R., Iatridis, J. C., Poveda, L., Alini, M. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine (Phila Pa 1976). 31, 515-522 (1976).
- Chan, S. C. W., Gantenbein-Ritter, B., Leung, V. Y., Chan, D. Cryopreserved intervertebral disc with injected bone marrow-derived stromal cells: a feasibility study using organ culture. Spine. J. 10 (6), 486-496 (2010).
- Chan, S. C., Ferguson, S. J., Wuertz, K., Gantenbein-Ritter, B. Biological Response of the Intervertebral Disc to Repetitive Short Term Cyclic Torsion. Spine (Phila Pa 1976). , (2011).
- Gantenbein-Ritter, B., Sprecher, C. M., Chan, S., Illien-Jünger, S., Grad, S. Confocal imaging protocols for live/dead staining in three-dimensional carriers. Methods Mol. Biol. 740, 127-140 (2011).
- Gantenbein-Ritter, B., Potier, E., Zeiter, S., van der Werf, M. Accuracy of three techniques to determine cell viability in 3D tissues or scaffolds. Tissue Engineering Part C Methods. 14, 353-358 (2008).
- Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. (1997).
- Haschtmann, D., Stoyanov, J. V., Ettinger, L., Nolte, L. P., Ferguson, S. J. Establishment of a novel intervertebral disc/endplate culture model: analysis of an ex vivo in vitro whole-organ rabbit culture system. Spine. 31, 2918-2925 (2006).
- Gantenbein, B., Grünhagen, T., Lee, C. R., van Donkelaar, C. C. An in vitro organ culturing system for intervertebral disc explants with vertebral endplates: a feasibility study with ovine caudal discs. Spine. 31, 2665-2673 (2006).
- Korecki, C. L., Kuo, C. K., Tuan, R. S., Iatridis, J. C. Intervertebral disc cell response to dynamic compression is age and frequency dependent. J. Orthop. Res. 27, 800-806 (2009).
- Korecki, C. L., MacLean, J. J., Iatridis, J. C. Dynamic compression effects on intervertebral disc mechanics and biology. Spine (Phila Pa 1976). 33, 1403-1409 (1976).
- Jim, B., Steffen, T., Moir, J., Roughley, P., Haglund, L. Development of an intact intervertebral disc organ culture system in which degeneration can be induced as a prelude to studying repair potential. European Spine Journal. , 1-11 (2011).
