Préparation d'Intact disques intervertébraux Queue bovine pour la culture d'organe

Summary

Ce protocole illustre une technique de récolte pour les bovins coccygienne disques intervertébraux pour la culture d'organes pour In vitro.

Abstract

Le disque intervertébral (DIV) est l'articulation de la colonne vertébrale reliant vertèbre en vertèbre. Il fonctionne pour transmettre le chargement de la colonne vertébrale et donner de la flexibilité de la colonne vertébrale. Il compose de trois compartiments: le noyau pulpeux intime (NP) englobant l'annulus fibrosus (AF), et deux plateaux cartilagineux reliant les NP et AF pour le corps vertébral, des deux côtés. Douleur d'origine discale éventuellement causé par une maladie dégénérative du disque intervertébral (DDD) et les hernies discales a été identifié comme un problème majeur dans notre société moderne. Pour étudier les mécanismes possibles de la dégénérescence IVD, dans les systèmes de culture in vitro d'organes avec cellules du disque live sont très attrayante. La culture in vitro de bovins intacts les DIV coccygienne a avancé à un système de modèle pertinent, qui permet l'étude de la mécano-biologique des aspects dans un environnement bien contrôlé physiologiques et mécaniques. DIV de la queue bovine peut être obtenue assez facilement en plus grand nombre uneD sont très similaires aux humains les DIV lombaires à l'égard de la densité cellulaire, la population de cellules et de dimensions. Toutefois, avant bovins caudale techniques de récolte DIV conservant plateaux cartilagineux et osseux plateaux échoué après 1-2 jours de culture depuis les voies de la nutrition étaient évidemment bloqué par du sang coagulé. DIV sont les plus grands organes avasculaire, par conséquent, les nutriments aux cellules de la NP dépendent uniquement sur la diffusion via les bourgeons capillaires du corps vertébraux adjacents. Présence de débris d'os et de sang coagulé sur les surfaces des plateaux vertébraux peuvent entraver la diffusion des nutriments dans le centre du disque et la viabilité cellulaire compromis. Notre groupe a établi un protocole relativement rapide à "craquer" les DIV-le de la queue avec un faible risque de contamination. Nous sommes capables de perméabiliser les surfaces fraîchement coupées des plateaux vertébraux osseux en utilisant un système de jet de lavage chirurgical, ce qui élimine les caillots de sang et de débris de coupe et de façon très efficace rouvre la voie de la diffusion de nutritionau centre de la DIV. La présence de plaques de croissance des deux côtés de l'os vertébral doit être évitée et d'être enlevés avant la culture. Dans cette vidéo, nous décrivons les étapes cruciales lors de la préparation et de démontrer la clé d'une culture d'organe réussie maintien de la viabilité cellulaire élevée pendant 14 jours dans la culture gonflement libre. Le temps de la culture pourrait être prolongé le cas échéant environnement mécanique peut être maintenue en utilisant bioréacteur chargement mécanique. La technique démontrée ici peuvent être étendues à d'autres espèces animales comme les porcins, ovins et lépreux isolement caudale ou lombaire DIV.

Protocol

1. La récolte du disque intervertébral

1. Whole queue bovins longueur est obtenue à partir d'un abattoir local, si possible sans la peau car la présence de la peau augmente le risque de contamination (figure 2).
2. Préparer grande planche à découper et préparer la station de travail et des instruments stériles au sommet d'une planche à découper (Fig. 2).
3. Préparer sous le capot de la gaze stérile à flux laminaire stérile humidifié avec du chlorure de sodium à 0,9% contenant du citrate de sodium 55mm et mis dans chaque puits de la plaque de 6 puits.
4. Préparer un bassin et diluer 1:100 solution de Betadine avec de l'eau du robinet.

Discussion

La première étape pour la culture d'organe réussie est de faire en sorte que l'explant ne doivent pas être contaminés. La queue doit être dépecé avant de commencer la procédure. Toute poils amené dans un laboratoire stérile pourrait être problématique en termes de contamination. La queue bovins devraient idéalement être aussi frais que possible (ce qui affecte la viabilité des cellules initiales). Par ailleurs, l'étape de lavage bétadine est recommandée pour réduire le risque de contamination. Au lieu d'.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Frais tissus bovins disque intervertébral de queues de bovins, d'abattoir local (idéalement dans les heures post-mortem et sans peau).
Pulsavac AC Plus Système	Zimmer Inc., Suisse	00-5150-486-01	Meilleure performance à la tête de pulvérisation et de hip-avec alimentation AC (celui avec le pack de 8 piles AA ne fonctionnera aussi mais c'est moins pratique)
Haute capacité de ventilateur pulvérisation W / Splash Bouclier, longueur 12,7 cm	Zimmer Inc., Suisse	00-5150-175-00	Il ya plusieurs têtes de pulvérisation disponibles, nous avons testé celui-ci avec succès
Les lames de bistouri n ° 22 et n ° 10	Swann-Mort, l'Angleterre	# 10: 0201 # 22: 0208
Porte-lame de scalpel # 3 et # 4	Hausmann, Allemagne	# 3: 06.103.00 # 4: 06.104.00
Lutz industriels lames	Lutz, de l'Allemagne	1022.0884
Tampon phosphate salin (PBS)	Invitrogen, Suisse	10010-023
Eagle modifié par Dulbecco (DMEM)	Gibco, Suisse	11960-044
Solution de Ringer lactate (sans glucose)	Bichsel, Suisse	133 0002
6-même plaque multi-puits	TPP, Suisse	92006
Solution de Betadine	Mundipharma, Suisse	10055025
Marqueur de la peau chirurgicale	Porex Surgical, Suisse	9560
Grande planche à découper			Toute marque est possible