Analyse af Cell Cycle Position i pattedyrceller

Summary

Bestemmelse af cellecyklus position af en population af celler, eller forstå, hvordan signaler påvirker spredningen umiddelbart kan måles ved flowcytometri hjælp af denne protokol. Vi rapporterer en enkel eksperimenterende tilgang til farvning af celler og kvantificere deres position i cellecyklus.

Abstract

Reguleringen af ​​celledelingen er centralt for væv morfogenese under udviklingen af ​​flercellede organismer. Endvidere tab af kontrol af celledelingen ligger til grund for patologi af sygdomme som kræft. Som sådan er der stort behov for at kunne undersøge celledeling og kvantificere andelen af ​​celler i hver fase af cellecyklus. Det er også af afgørende betydning for uden nærmere at identificere celler, der er kopiere deres dna i en større population. Da en celle beslutning om at formere sig, er foretaget i G1 fasen umiddelbart inden initiering af DNA-syntese og forløber gennem resten af ​​cellecyklus, påvisning af DNA-syntese på dette tidspunkt giver mulighed for en entydig bestemmelse af status for vækstregulering i cellekultur eksperimenter.

DNA-indhold i celler kan let quantitated ved flowcytometri af celler farvet med propidium iodid, et fluorescerende DNA intercalating farvestof.Tilsvarende kan en aktiv DNA-syntesen blive quantitated ved dyrkning af celler i med forekomst af radioaktivt thymidin, høst cellerne, og måle indarbejdelse af radioaktivitet i en syre uopløselig fraktion. Vi har stor ekspertise med celle-cyklus analyse og anbefaler en anden tilgang. Vi undersøger celleproliferation hjælp bromodeoxyuridine / fluorodeoxyuridine (forkortet simpelthen som BrdU) farvning, der registrerer indarbejdelsen af ​​disse thymin analoger til for nylig syntetiseret DNA. Mærkning og farvning celler med BrdU, kombineret med en samlet DNA-farvning af propidium iodid og analyse ved flowcytometri ¹ tilbyder den mest præcise måling af celler i de forskellige faser af cellecyklus. Det er vores foretrukne metode, fordi den kombinerer påvisning af aktive DNA-syntese gennem antistof baserede farvning af BrdU, med total DNA indhold fra propidium iodid. Dette giver mulighed for en klar adskillelse af celler i G1 fra begyndelsen af ​​S-fasen, eller sene S-fasen fra G2 / M.Desuden kan denne metode bruges til at undersøge virkningerne af mange forskellige celle stimuli og farmakologiske agenter om regulering af progression gennem disse forskellige cellecyklus faser.

I denne rapport beskriver vi metoder til mærkning og farvning dyrkede celler, samt deres analyse af flowcytometri. Vi har også omfatter eksperimentel eksempler på, hvordan denne metode kan bruges til at måle effekten af ​​væksthæmmende signaler fra cytokiner som TGF-β1, og proliferativ hæmmere som f.eks cyklin afhængige kinase-hæmmer, p27KIP1. Vi har også en alternativ protokol, som giver mulighed for analyse af cellecyklus position i en sub-population af celler i en større kultur ^5. I dette tilfælde viser vi, hvordan man registrerer en celle cyklus arrest i celler, som er tilført de retinoblastom genet selv når meget i undertal untransfected celler i samme kultur. Disse eksempler illustrerer de mange måder, at DNA-farvning ogflowcytometri kan udnyttes og tilpasses til at undersøge grundlæggende spørgsmål af mammale cellecyklus kontrol.

Protocol

1. Mærkning og fastsættelse af celler

1. Tilsæt 1 ml af celledelingen Mærkning Reagens (BrdU) pr ml cellekulturmedium (1 til 1000 fortynding) 1 time før høst. Mærkningen periode kan være nødvendigt at forlænget for langsommere voksende celler.
2. At høste celler, aspireres dyrkningsmedium og vaskes grundigt med fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Gentag til grundigt at fjerne spor af medium.
3. Vask kulturer hurtigt en tredje gang med PBS indeholdende 3mm EDTA og aspirér grundigt.
4. Tilføj en lille mængde PBS indeholdende 3mm EDTA til hver ret, 0,5 ml til en 6 cm parabol er ideel. Inkuber ved 22 ° C i cirka 5 minutter til at løsne celler. Overførsel til en 15 ml konisk rør.
5. Centrifugér cellerne ved 500 xgi 5 minutter for at pellet, fjerne supernatanten, og resuspender grundigt i 100 μL af PBS.
6. Fix celler ved at tilsætte 5 ml 95% EtOH, dråbevis, mens hvirvelblanding. På dette trin, kan cellerne opbevares ved 4 ° C i mindst etmåned.

2. Denaturering og farvning af BrdU og DNA

1. Centrifugér cellerne ved 500 xgi 5 minutter til pellet celler og fjerne 95% EtOH. Resuspenderes i 1 ml 2N HCl og 0,5% Tx-100 ved at tilføje et fald klog måde, samtidig med hvirvelblanding. Inkubér ved stuetemperatur i 30 minutter.
2. Centrifuge som før i afsnit 2.1 og omhyggeligt aspirer supernatanten siden celler danner en meget løs pille på dette trin. Forsigtigt resuspender i 1 mL 0,1 M NAB ₄ O ₇ (pH 8,5) og inkuberes i mindst 30 minutter ved stuetemperatur.
3. Pellet celler som ovenfor i afsnit 2.1 og resuspender i 0,5 mL antistof opløsning (PBS indeholdende 1% BSA og 0,2% Tween-20) med musen anti-BrdU antistoffer fortyndet 1 til 50. Inkubér ved stuetemperatur i 30 minutter.
4. Pellet celler igen og resuspender i 50 ml antistof opløsning, der indeholder kanin anti-mus sekundære antistoffer konjugeret til FITC fortyndes 1 til 25 medlemmer. Inkuber i 30 minutter påbordplade og beskytte mod lys.
5. Centrifugér celler en sidste gang og resuspender i 0,5 ml propidium iodid og RNase opløsning (PI-RNAse løsning, PBS med 1% BSA, 10 mg / ml propidium iodid, 0,25 mg / ml RNase A) og inkuber i mørke ved 37 ° C i 30 minutter. Alternativt RNA kan blive fordøjet natten over ved 4 ° C i mørke.
6. Pass løsning gennem en celle si for at fjerne aggregater og indsamle enkelte celler i et passende rør til prøve optagelsen på dit flowcytometer. Igen, bør prøverne beskyttes mod direkte udsættelse for lys.

3. Analyse ved flowcytometri

1. Cellerne skal analyseres af en standard flowcytometer, der er i stand til at diskriminere mod dubletter (to celler, der passerer gennem flowcellen som én) med passende detektionsevne for propidium iodid og FITC. Enkelt celler kan påvises i denne flowcytometri ansøgning fra gating til events baseret på forward scatter og side scatter popgørelser, og ved at bruge de egenskaber af DNA-farvning af propidium iodid. Fremkomsten af ​​et dobbeltslag diskriminerende prikplot varierer mellem flowcytometre og er afhængig af propidium iodid farvning egenskaber, se din lokale flowcytometri facilitet til rådgivning om oprettelse af et dobbeltslag diskriminatoren i din analyse. Generelt, i et asynkront prolifererende population af celler enkelte celler er normalt de to mest udbredte toppe (2N og 4N DNA) i dublet diskriminerende plot og en låge bør udarbejdes omkring dem. Dette vil markere en enkelt celle begivenheder, der bruges til alle efterfølgende analyse nedenfor.
2. Den første prøve, der skal analyseres bør være en asynkront prolifererende kultur, der fungerer som en positiv kontrol for farvning og flowcytometer set-up. Juster følsomheden af ​​fotomultiplikatorrør for propidium iodid farvning sådan, at 2N og 4N toppe fra singlet celler er centreret på 200 og 400 (arbitrære enheder) på X-aksen. Vi har ofte plet en rigelig severing af disse celler til at sikre, at alle parametre for flowcytometeret er blevet justeret korrekt uden brug af denne prøve. Denne positive kontrol er også nyttigt for nye brugere at blive mere fortrolige med driften af ​​flowcytometer.
3. Juster følsomheden af ​​fotomultiplikator rør til FITC afsløring sådan, at G1 og G2 / M befolkningsgrupper ligger over baggrunden. BrdU positive celler skal være cirka 10 gange lysere og Y-aksen skal vises som en logaritmisk skala. Det er nogle gange praktisk at inkludere en negativ kontrol for BrdU farvning (ved at erstatte den anti-BrdU antistoffer med ikke-specifikke IgG i trin 2.3 ovenfor) til klart at skelne positivt farvede celler.
4. Juster kompensation mellem propidium iodid og FITC sådan, at enkeltstående begivenheder fanget af flowcytometeret danner en hestesko formet bue fra G1 i nederste venstre op til S-fase og ned i det nederste højre for G2 / M. Se følgende reference for en mere dybdegående DIScussion af principperne og anvendelsen af flowcytometri og referencer der i til specifikke applikationer ^2.

4. Dataanalyse

1. 5 000 til 10 000 enkelt celle begivenheder med det ønskede område af DNA-indhold, skal indsamles for hver prøve for at have tillid til, at befolkningen af ​​celler i kulturen er blevet grundigt stikprøven.
2. Når cellerne er blevet målt for propidium iodid og BrdU indhold, de har brug for at blive tilknyttet G1, S eller G2 / M faser. Gør dette ved at trække porte omkring de to BrdU negative populationer centreret ved 200 og 400 (G1 og G2 / M henholdsvis). Alt over disse kasser bør indgå i en enkelt port, der måler S-fase (Fig. 1A). Den procentdel af celler i hver port repræsenterer det relative antal af celler i G1, S og G2 / M (Fig. 1B).

5. Alternativ protokol til analyse af cellecyklus i en blandet population af celler

1. Dette alternativ protokol ermest nyttige, når transfektion af Ekspressionsvektorer rutinemæssigt resulterer i en lav procentdel af celler, der udtrykker genet produkt af interesse, eller når narkotikabehandling for at vælge en ren population af celler er upraktisk. Dette resulterer i en relativt lille del af celler af rente er kontamineret med en stor bestand af untransduced celler. I dette tilfælde, co-transfect plasmider udtrykke din genet eller shRNA af interesse sammen med en plasmid, som udtrykker en markør til påvisning transfekterede celler ved flowcytometri, såsom en membran forankret GFP ³ eller en udenlandsk celle overflade markør som CD19 ⁴ eller CD20 ^5.
2. Ved anvendelsen af ​​denne protokol, vil vi bruge CD20-farvning som et eksempel, dog farvning for CD19 det væsentlige er identisk. I tilfælde af transfektion med CD20, er der ingen grund til at BrdU etiketten, skal du blot høste celler som beskrevet i trin fra 1,2 til 1,5 ovenfor, og pletten ved at tilsætte 20 μL FITC-konjugeret anti-CD20 antistoffer mod cellerne ice i 20 minutter i mørke. Fix celler som beskrevet i trin 1.6. Celler kan igen blive opbevaret i mindst en måned ved 4 ° C i mørke. Til påvisning af GFP, udelade antistof pletter fra dette trin og rette og gemme celler som beskrevet.
3. Re-fugter celler ved pelletering i centrifugen ved 500 xg i 5 minutter og opblandes i 5 ml PBS indeholdende 1% BSA.
4. Re-pillen cellerne ved 500 xgi 5 minutter og resuspender cellerne i 0,5 ml propidium iodid og RNase løsning som beskrevet ovenfor i afsnit 2.5.
5. Fortsæt med at følge cellebehandlingsproces instruktionerne i 2,6 og analyse af vejledningen i 3.1 og 3.2.
6. Juster følsomheden af ​​fotomultiplikator rør til FITC afsløring sådan, at uplettet celler ligger over baggrunden. Ideelt set vil CD20-FITC positive celler 10X til 100X mere intenst farvede end baggrunds-og Y-aksen for dette plot skal vises som en logaritmisk skala (Fig. 2A). CD20 positive celler, der er 10X lysere end backgrunde (og med propidium iodid farvning mellem 200 og 400) bør vælges til visning i en propidium iodid versus celletal histogram som vist i Fig. 2C. For cellelinjer, der udtrykker markører, der er let farves smukt (dvs. 10X til 100X ovennævnte baggrund) på CD20 positive cut-off bør fastsættes til 10X baggrund. Inddragelse af svagere farvning celler øger variation i disse forsøg, formentlig fordi genet af interesse også er svagt til udtryk i disse celler. For cellelinjer, at det kun giver svagt farvet CD20 positiver (dvs. mindre end 10X baggrunden), fastlæggelse af en afskåret bør foretages ved hjælp af en negativ kontrol bestående af CD20 farvede, untransfected celler.
7. Mindst 1000 CD20 positive hændelser skal indsamles for hver prøve. Forsøg med færre end 1000 begivenheder vil producere høj variabilitet. Softwarepakker såsom ModFit LT (Verity Software), Multi Cycle AV (Phoenix Flow Systems), og Flow Jo (Tree stjerne) bruge matematiske estimater afG1, S og G2 / M befolkninger, som bidrager til formen af ​​kurven i histogrammerne som dem vist i Fig. 2B og C.

6. Repræsentative resultater:

Vi giver tre eksempler på eksperimentel cellecyklus analyser ved hjælp af vores tilgange. Den første bruger retroviral udtryk for cyklin afhængige kinase inhibitor p27KIP1 i muse embryonale fibroblaster. Fireogtyve timer efter stof valg for virusinfektion var komplet, celler blev puls mærket med BrdU i en time. I dette forsøg uden for livmoderen udtryk for inhibitor anvendes til at anholde spredning af celler (Fig. 3A og B). Som vist i Fig. 3B lidt BrdU positive begivenheder er tydeligt i S-fasen gate som reaktion på P27. Ligeledes er andelen af ​​celler i S-fasen for P27 udtrykke celler er ganske lav som diagramed i Fig. 3C. Denne type analyse har været meget effektive til at karakterisere de cellecykluskontrol fejl i celler, der stammer fra forskellige stammer af gØNØ målrettet mus ^{6, 7, 8.}

I det andet eksperiment blev untransformed mammary epitelceller (MCF10A) behandlet med væksten hæmmende cytokin, omdanne vækst faktor beta én (TGF-β1) i 24 timer. Celler blev mærket med BrdU i fire timer umiddelbart før høst. Som vist i Fig. 4 BrdU mærkning i S-fase celler er stærkt formindsket ved TGF-β1 signalering, er specificiteten af ​​vores farvning også valideres med et IgG negativ kontrol (Fig. 4C). Kvantificering af de forskellige faser i cellecyklus bekræfter, at TGF-β1 primært hæmmer spredning i G1 fasen af ​​cellecyklus, hvilket fører til en ophobning i denne fase.

I vores sidste eksempel, er PRB mangelfulde SAOS-2 celler transficeret med en CMV-CD20 vektor og enten CMV-RB eller CMV-β-Gal som en kontrol. Tre dage efter transfektering celler blev høstet, farves, og faste. Flowcytometri analyse af disse cellers er vist i Fig. 5. Dette viser cellecyklus fordelingen af ​​negativ kontrol transfekterede celler (Fig. 5A) i sammenligning med den fordeling efter 72 timer PRB udtryk (Fig. 5B). Efter kurvetilpasning af Multi Cycle software, er en direkte sammenligning af den andel af cellecyklus faser vist i Fig. 5C. Dette afslører ophobning af cellerne i G1 følgende PRB udtryk og den relative nedbrydning af celler fra S og G2 / M faser. Vi har brugt varianter af denne analyse til at undersøge G1 anholde mekanismer omfattende ^{9, 10, 11, 12, 13.}

Disse eksempler viser, hvordan cellecykluskontrol kan måles som svar på en række forskellige stimuli eller celle manipulationer. Denne fremgangsmåde kan derfor tilpasses til mange applikationer, der kræver måling af cellecyklus position i kultur typer eksperimenter.

Figur 1. Quantitation af cellecyklus faser ved kombineret propidium iodid og BrdU farvning (PI-BrdU). (A) Dette panel viser tredimensionelle flowcytometri af propidium iodid og BrdU farvede celler. Bemærk, at celler med 2N og 4N DNA-indhold er centreret over de 200 og 400 mærker på X-aksen skala for propidium iodid farvning intensitet. BrdU farvning intensiteten måles på en logaritmisk skala på Y-aksen. Bemærk placeringen af ​​portene bruges til at kvantificere celler i G1, S og G2 / M faser af cellecyklus. (B) Den relative andel af celler i hver af de G1, S og G2 / M porte fra A er vist på denne graf.

Figur 2. Kvantificering af cellecyklus faser i udvalgte celler ved hjælp af propidium iodid og den celle overflade markør CD20. (A) Dette panel viser propidium iodid og CD20 farvning for en blanding af celler, hvoraf nogle ectopically udtrykker CD20 og PRB. Bemærk, at cellerne med2N og 4N DNA (den mest rigelige bestande) er centreret over de 200 og 400 mærker på X-aksen. Placeringen af ​​CD20 + porten vælger celler, der farves mindst 10X endnu stærkere end baggrunden. (B) En graf af celletal versus propidium iodid farvning er vist for CD20 negative celler i panel A, der er asynkront breder sig. (C) En tilsvarende graf er vist for CD20 positive celler fra panel A, der har været foranlediget til at arrestere med PRB udtryk og indeholder celler med primært 2N DNA-indhold. Dette viser, at en anholdt delpopulation kan skelnes fra andre celler i denne kultur ved hjælp af denne farvning teknik.

Figur 3. Hæmning af celledelingen ved p27KIP1. (A) PI-BrdU analyse anvendes til at måle cellecyklus faser i et asynkront prolifererende population af celler, der var transduced med en tom pBABE retrovirale vector. (B) En lignende analyse af celler transduced med pBABE-P27. Bemærk mangel af celler i S-fasen og større intensitet af begivenheder i G1 og G2 / M porte. (C) kvantificering af celler i de respektive faser af cellecyklus i asynkront prolifererende kontrol og P27 udtrykke celler.

Figur 4. Hæmning af celledelingen ved TGF-β1 (A) PI-BrdU analyse af asynkront prolifererende MCF10A celler. (B) Analyse af celler behandlet med 100 pM af TGF-β1 i 24 timer. Bemærk, ophobning af celler primært i G1 fasen af ​​cellecyklus. (C) Validering af BrdU farvning ved at erstatte den anti-BrdU primære antistof med en ikke-specifik IgG kontrol i asynkront prolifererende celler. (D) Grafisk kvantificering af de respektive cellecyklus faser fra A og B.

Figur 5. Hæmning af celledelingen ved PRB. (A) Cell tæller versus propidium iodid farvning af CD20 og ß-gal transfekterede celler vises. Dette er en vigtig kontrol som transfektering delvist kan synkronisere celler, hvilket gør untransfected befolkningen (CD20 - celler) som en uhensigtsmæssig kontrol for transficeret delpopulation. Transfekterede celler skal sammenlignes med andre analog transfekterede celler. (B) Cell tæller versus propidium iodid graf over CD20 og PRB transfekterede celler. Bemærk den næsten udelukkende tilstedeværelsen af ​​en 2N højdepunkt. (C) Grafisk fremstilling af cellecyklus fase proportioner bestemmes ud fra A og B ved hjælp af kurvetilpasning metoder i Multi Cycle software.

Discussion

Det er vores erfaring, er succes med disse teknikker, afhængig af nogle få centrale kontroller og eksperimenterende forhold. Den ene er oprettelse af et asynkront prolifererende kontrol til brug i disse forsøg. Denne kontrol tjener tre vigtige formål. For det første sikrer, at dyrkningsbetingelser bruges til alle eksperimentelle prøver er tilstrækkelige til at understøtte løbende spredning i mangel af behandlingen. Denne prøve tjener også det formål af en positiv kontrol for farvning metode til at sikre, at BrdU eller CD20 positive celler kan opdages, når de er til stede. Endelig er dette eksempel bruges til at kalibrere flowcytometer. Denne kontrol prøve kan bruges til at justere propidium iodid farvning intensitet til at opdage 2N og 4N celler på 200 og 400 hhv. Desuden kan detektion følsomhed BrdU eller CD20 justeres, således at negative og positive signaler er centreret som vist i figur 1A og 2A. Når alle prøver har en lignende koncentration af celler i PI-RNase løsning, så enkelte tilpasninger cytometret er nødvendig, da de efterfølgende prøver køres. Dette er vigtigt af hensyn vist i Fig. 4B og 5B, hvor stærke G1 ophobning skaber hovedsageligt et enkelt G1 peak, der kan mistolkes som G2 / M.

Repræsentanten eksperimenter også gøre andre vigtige punkter. Først og fremmest, de dokumenterer, at BrdU optagelse og mærkning, kan variere mellem celletyper. Af denne grund er det vigtigt at empirisk bestemme længden af ​​puls og farvning betingelser er nødvendig for at tilstrækkelig opdage celler i S-fase. Generelt kan celletyper, at dobbelt i kulturlivet i 24 timer eller mindre være mærket med BrdU i en time. Langsommere vækst celletyper kan kræve længere pulser og ændringer til antistoffet farvning betingelser og varighed. MCF10A celler er et glimrende eksempel i denne henseende, som de blev mærket med BrdU i fire timer og farves med dobbelt standard koncentration af antistoffer til fire gange så længe. Efterforskereskal passe på ikke at overskride 6 timers BrdU mærkning selv med meget langsomt voksende celler, da det fejlagtigt kan føre til inddragelse af G2 / M celler i S-fasen befolkning. For det andet, ved at sammenligne effekten af ​​p27KIP1 udtryk med de af TGF-β1, er det klart, at P27 kan fremkalde en ophobning i enten G1 eller G2 / M faser, mens TGF-β1 signalering inducerer en G1 anholdelse. Traditionelle middel til at afsløre spredning såsom ³ H-thymidin og scintillationstælling er ude af stand til at skelne disse muligheder.

I vores alternative protokol vi demonstrere for påvisning af en sub-population af celler i en større untransfected befolkning. Det er vigtigt at empirisk bestemme den mest hensigtsmæssige reporter til afsløring transfekterede celler. Det er vores erfaring nogle celletyper hverken udtrykkelige cellens overflade markører dårligt, eller ikke kan ordentligt trafikken dem til plasma membranen, hvilket resulterer i en manglende evne til at opdage transfekterede celler. Likewise, ikke alle celler tolerere membranen bundne form af GFP. Udvælgelse af den mest hensigtsmæssige journalist bør gøres ved at vurdere transfektion effektiviteten af ​​journalist samt den relative intensitet af udtryk i forhold til untransfected kontrol. Ideelt set vil heterolog ekspression af disse molekyler være veltolereret, og det er tankevækkende, at markørerne har lidt at ingen effekt på cellecyklus distribution.

En begrænsning af disse typer af flowcytometri tilgange er, at de kun er i stand til at etablere relative mængder af cellecyklus faser i forhold til hinanden. Af denne grund er det tvetydigt, hvis udtryk for P27 i figur 3 virkelig inducerer en anholdelse i G1 og G2 / M, eller hvis det bare forsinker progression gennem disse faser i forhold til S-fasen. Disse muligheder kan undersøges yderligere ved at behandle en parallel prøve af celler med en mitotisk-hæmmer såsom nocodazole eller G1 / S inhibitor som aphidicolin. Da disse stoffer skaber en dominant anholdelse i M-fase eller begyndelsen af ​​S-fase henholdsvis vil langsomt prolifererende celler ophobes i lægemiddelinduceret anholdelse punkt. For eksempel celler arresteret i G1 på grund af PRB udtryk vil forblive i G1 trods nocodazole behandling, mens eksportkontrol på celler vil hobe sig op i M-fase ^13.

Samlet set udgør disse eksperimentelle tilgange tilbyder en fleksibel metode, der kan anvendes til en bred vifte af pattedyr cellecyklus forskningsspørgsmål. De kan hurtigt opdage ændringer i celle-cyklus forløb og kvantificere forskelle, når sammenlignet med kontrolgruppen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Proliferation Labeling reagent	GE Healthcare	RPN201
Anti-BrdU Antibodies	BD Biosciences	347580
Anti-Mouse FITC conjugated Antibodies	Vector Laboratories	FI-2000
Cell Strain Filters	BD Biosciences	352235
Anti-CD20 Antibodies	BD Biosciences	347673
Multi Cycle Software	Phoenix Flow Systems	N/A