Summary
कक्षों की आबादी की कोशिका चक्र स्थिति निर्धारण, या समझ कैसे संकेतों के प्रसार को प्रभावित, प्रवाह cytometry द्वारा इस प्रोटोकॉल का उपयोग आसानी से मापा जा सकता है है. हम एक साधारण कोशिकाओं को धुंधला हो जाना और कोशिका चक्र में अपनी स्थिति बढ़ाता प्रयोगात्मक दृष्टिकोण रिपोर्ट.
Protocol
1. लेबल और कक्षों की फिक्सिंग
- सेल प्रसार लेबल (BrdU) अभिकर्मक प्रति एमएल सेल संस्कृति माध्यम की कटाई से पहले (1 करने के लिए 1000 मन्दन) 1 घंटे 1 μL जोड़ें. लेबलिंग अवधि के लिए धीमी बढ़ कोशिकाओं के लिए lengthened हो की आवश्यकता हो सकती है.
- फसल कोशिकाओं करने के लिए, महाप्राण (व्यंजन) संस्कृति मध्यम और फॉस्फेट के साथ अच्छी तरह से धो लो buffered खारा (पीबीएस). अच्छी तरह से मध्यम के निशान को दूर करने के लिए दोहराएँ.
- संस्कृतियों जल्दी पीबीएस 3mm EDTA के साथ एक तीसरी बार धो और अच्छी तरह से महाप्राण (व्यंजन).
- पीबीएस की एक छोटी मात्रा प्रत्येक पकवान 3mm EDTA युक्त जोड़ें, एक 6 सेमी डिश के लिए 0.5 एमएल आदर्श है. 22 ° लगभग 5 मिनट के लिए सी कोशिकाओं को अलग सेते हैं. एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब पर स्थानांतरण.
- गोली से 5 मिनट के लिए 500 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं, सतह पर तैरनेवाला निकालने के लिए, और पीबीएस के 100 μL में अच्छी तरह से resuspend.
- 95% EtOH, dropwise 5 एमएल जोड़ने, जबकि vortexing द्वारा कोशिकाओं को ठीक करें. इस चरण में, कोशिकाओं को कम से कम एक के लिए 4 ° C पर संग्रहीत किया जा सकता हैमहीने.
2. Denaturing और BrdU और डीएनए के धुंधला हो जाना
- गोली कोशिकाओं के लिए 5 मिनट के लिए 500 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और 95% EtOH को दूर. 2N एचसीएल के 1 एमएल और 0.5% TX-100 में एक बूंद बुद्धिमान फैशन में जोड़ने जबकि vortexing Resuspend. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- 2.1 खंड में अपकेंद्रित्र के रूप में पहले से और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला महाप्राण (व्यंजन) के बाद से कोशिकाओं को इस कदम पर एक बहुत ढीला गोली फार्म. धीरे 0.1M NAB 4 7 O (8.5 पीएच) के 1 एमएल में resuspend और कम से कम 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर incubated.
- 2.1 खंड में ऊपर और एंटीबॉडी समाधान के 0.5 माउस विरोधी BrdU एंटीबॉडी (पीबीएस 1% BSA और 0.2% बीच - 20 से युक्त) के साथ एमएल में resuspend गोली कोशिकाओं 50 1 पतला. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- गोली कोशिकाओं को फिर से और एंटीबॉडी खरगोश विरोधी माउस माध्यमिक FITC को संयुग्मित एंटीबॉडी युक्त समाधान के 50 एमएल में resuspend 1 से 25 तक पतला. पर 30 मिनट के लिए सेतेbenchtop और प्रकाश से बचाने के लिए.
- अपकेंद्रित्र कोशिकाओं एक अंतिम समय और propidium आयोडाइड RNase और समाधान (समाधान PI-RNase, पीबीएस 1% BSA के साथ, 10 मिलीग्राम / एमएल propidium आयोडाइड, 0.25 मिलीग्राम / एमएल RNase एक) के 0.5 एमएल में resuspend और 37 पर अंधेरे में सेते ° सी 30 मिनट के लिए. वैकल्पिक रूप से शाही सेना 4 में रात भर पचा सकता ° C अंधेरे में.
- एक सेल झरनी के माध्यम से समाधान दर्रा समुच्चय को हटा दें और अपने प्रवाह कोशिकामापी पर नमूना तेज के लिए एक उपयुक्त ट्यूब में एकल कोशिकाओं को इकट्ठा. फिर, नमूने प्रकाश के प्रत्यक्ष जोखिम से संरक्षित किया जाना चाहिए.
3. प्रवाह cytometry से विश्लेषण
- कक्ष एक मानक प्रवाह कोशिकामापी है कि propidium आयोडाइड और FITC के लिए उपयुक्त पता लगाने की क्षमता के साथ दोहरी (दो कोशिकाओं है कि एक के रूप में प्रवाह सेल के माध्यम से पारित) के खिलाफ भेदभाव करने में सक्षम है के द्वारा विश्लेषण किया जाना चाहिए. सिंगल कोशिकाओं gating द्वारा इस प्रवाह cytometry आवेदन में आगे तितर बितर और तितर बितर पॉप पक्ष के आधार पर की घटनाओं के लिए पता लगाया जा सकता हैulations, और propidium आयोडाइड से डीएनए धुंधला के गुणों का उपयोग करके. एक नक़ल भेदभाव डॉट साजिश की उपस्थिति प्रवाह cytometers और propidium आयोडाइड धुंधला गुणों पर निर्भर करता है है के बीच बदलता है, सलाह के लिए अपने विश्लेषण में एक नक़ल discriminator स्थापित करने पर अपने स्थानीय प्रवाह cytometry सुविधा देख. सामान्य में, कक्षों की एक asynchronously proliferating आबादी में, एकल कक्षों आमतौर पर नक़ल भेदभाव की साजिश में दो सबसे प्रचुर मात्रा में चोटियों (2N और 4N डीएनए) और उन्हें चारों ओर एक फाटक तैयार किया जाना चाहिए. यह एकल कक्ष की घटनाओं है कि बाद के सभी विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया नीचे का चयन करेंगे.
- पहले विश्लेषण किया जा नमूना एक asynchronously proliferating संस्कृति है कि धुंधला हो जाना और प्रवाह कोशिकामापी सेट अप के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है होना चाहिए. Photomultiplier ट्यूबों के propidium आयोडाइड जैसे कि स्वेटर कोशिकाओं से 2N और 4N चोटियों 200 और 400 (मनमाना इकाइयों) X-अक्ष पर केंद्रित कर रहे हैं धुंधला के लिए संवेदनशीलता को समायोजित करें. हम अक्सर एक प्रचुर मात्रा में एस दागइन कोशिकाओं के upply करने के लिए सुनिश्चित करें कि प्रवाह cytometer के सभी मापदंडों के इस नमूने का उपयोग कर के बिना ठीक से समायोजित किया गया है. यह सकारात्मक नियंत्रण भी है के लिए नए उपयोगकर्ताओं के प्रवाह cytometer के आपरेशन के साथ अधिक परिचित बनने के लिए उपयोगी है.
- FITC पता लगाने के लिए ऐसी है कि G1 और G2 एम / आबादी पृष्ठभूमि से ऊपर हैं photomultiplier ट्यूब की संवेदनशीलता को समायोजित करें. BrdU सकारात्मक कोशिकाओं लगभग 10 बार चमक और Y-अक्ष को एक लघुगणकीय पैमाने के रूप में प्रदर्शित किया जाना चाहिए किया जाना चाहिए. यह कभी कभी उपयोगी BrdU धुंधला के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण (ऊपर 2.3 कदम में गैर विशिष्ट आईजीजी के साथ विरोधी BrdU एंटीबॉडी की जगह द्वारा) के लिए स्पष्ट रूप से सकारात्मक दाग कोशिकाओं भेद शामिल है.
- Propidium आयोडाइड और FITC जैसे के बीच मुआवजा है कि एक कम में G1 से प्रवाह कोशिकामापी फार्म एक घोड़े की नाल के आकार चाप द्वारा कब्जा कर लिया घटनाओं एस चरण के लिए छोड़ दिया और नीचे G2 / एम. के लिए निचले सही में समायोजित कृपया गहराई जिले में एक और अधिक के लिए निम्न संदर्भ देखेंसिद्धांतों और प्रवाह cytometry और संदर्भ का उपयोग वहाँ विशिष्ट 2 अनुप्रयोगों के लिए में cussion.
4. डेटा विश्लेषण
- 5 10 000 डीएनए सामग्री का वांछित रेंज के साथ एकल कक्ष की घटनाओं के लिए 000 प्रत्येक नमूना के लिए एकत्र होना चाहिए क्रम में विश्वास है कि संस्कृति में कोशिकाओं की आबादी अच्छी तरह से किया गया नमूना है.
- एक बार कोशिकाओं propidium आयोडाइड और BrdU सामग्री वे G1, एस, G2 / या एम चरणों को सौंपा जा आवश्यकता के लिए मापा गया है. दो BrdU नकारात्मक 200 और 400 (G1 और G2 / एम क्रमशः) पर केंद्रित आबादी के आसपास फाटक ड्राइंग द्वारा इस मत करो. इन बक्सों के ऊपर सब कुछ एक एकल फाटक है कि एस चरण (छवि 1A) उपायों में शामिल होना चाहिए. प्रत्येक गेट में कोशिकाओं का प्रतिशत G1, एस, और G2 / एम (छवि 1B) में कोशिकाओं के सापेक्ष संख्या का प्रतिनिधित्व करता है.
5. कक्षों की एक मिश्रित आबादी में कोशिका चक्र के विश्लेषण के लिए वैकल्पिक प्रोटोकॉल
- यह वैकल्पिक प्रोटोकॉल हैसबसे उपयोगी है जब ब्याज की जीन उत्पाद व्यक्त कक्षों की एक कम प्रतिशत में नियमित अभिव्यक्ति वैक्टर के अभिकर्मक परिणाम है, या जब दवा के लिए कक्षों की एक शुद्ध आबादी का चयन उपचार अव्यावहारिक है. ब्याज की कोशिकाओं की एक बड़ी आबादी के साथ दूषित किया जा रहा है की एक अपेक्षाकृत छोटे से अनुपात में यह परिणाम है कोशिकाओं untransduced. इस मामले में सह transfect एक प्लाज्मिड कि जैसे 4 CD19 या 3 GFP लंगर झिल्ली जैसे प्रवाह cytometry, या एक विदेशी कोशिका की सतह मार्कर द्वारा ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एक मार्कर व्यक्त के साथ अपने जीन या ब्याज की shRNA व्यक्त plasmids CD20 5.
- इस प्रोटोकॉल के प्रयोजनों के लिए हम एक उदाहरण के रूप में CD20 धुंधला का प्रयोग करेंगे, तथापि, CD19 के लिए धुंधला हो जाना अनिवार्य रूप से समान है. CD20 के साथ अभिकर्मक के मामले में, वहाँ BrdU लेबल करने के लिए कोई ज़रूरत नहीं है, बस फसल कोशिकाओं के रूप में 1.5 से 1.2 चरणों में वर्णित ऊपर और मैं पर कोशिकाओं के लिए 20 μL FITC संयुग्मित विरोधी CD20 एंटीबॉडी जोड़कर दागअंधेरे में 20 मिनट के लिए CE. कदम 1.6 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं को ठीक करें. कक्ष 4 में कम से कम एक महीने के लिए फिर से कर सकते हैं संग्रहीत किया जा ° सी अंधेरे में. GFP का पता लगाने के लिए, इस कदम और ठीक से एंटीबॉडी धुंधला न आना और कोशिकाओं की दुकान के रूप में वर्णित है.
- पुन हाइड्रेट 500 XG पर अपकेंद्रित्र में 5 मिनट के लिए और 1% BSA युक्त पीबीएस के 5 एमएल में pelleting resuspending द्वारा कोशिकाओं.
- पुनः गोली propidium आयोडाइड और RNase समाधान के रूप में 2.5 अनुभाग में ऊपर वर्णित की 0.5 एमएल में 5 और मिनट resuspend कोशिकाओं के लिए 500 XG में कोशिकाओं.
- 3.1 और 3.2 में 2.6 और विश्लेषण निर्देशों में सेल तैयारी निर्देशों का पालन करें जारी रखें.
- FITC पता लगाने के लिए ऐसी है कि बेदाग कोशिकाओं पृष्ठभूमि से ऊपर हैं photomultiplier ट्यूब की संवेदनशीलता को समायोजित करें. आदर्श रूप में, CD20 FITC सकारात्मक कोशिकाओं 100X अधिक तीव्रता से पृष्ठभूमि की तुलना में दाग 10X हो सकता है और इस साजिश का Y-अक्ष को एक लघुगणकीय पैमाने (2A छवि) के रूप में प्रदर्शित किया जाना चाहिए. CD20 सकारात्मक कोशिकाओं है कि backg की तुलना में 10X उज्जवल हैंदौर (और propidium आयोडाइड धुंधला के साथ 200 और 400 के बीच) एक propidium आयोडाइड बनाम सेल मायने रखता है हिस्टोग्राम में प्रदर्शन के लिए चयनित किया जाना चाहिए के रूप में छवि में दिखाया गया है. 2C. के लिए सेल लाइनों है कि मार्कर है कि आसानी से चमकते दाग रहे हैं (ie. 10X पृष्ठभूमि 100X ऊपर) CD20 सकारात्मक कटौती बंद 10X पृष्ठभूमि पर सेट किया जाना चाहिए व्यक्त. कमजोर धुंधला कोशिकाओं के समावेश इन प्रयोगों में परिवर्तनशीलता बढ़ जाती है, संभव है, क्योंकि ब्याज की जीन भी कमजोर है इन कोशिकाओं में व्यक्त किया. सेल लाइनों है कि केवल कमजोर दाग CD20 (10X पृष्ठभूमि की तुलना में कम ie.) सकारात्मक है, उपज के लिए एक काट का निर्धारण एक नकारात्मक CD20 दाग, untransfected कोशिकाओं से मिलकर नियंत्रण का उपयोग कर बनाया जाना चाहिए.
- कम से कम 1000 CD20 सकारात्मक घटनाओं प्रत्येक नमूना के लिए एकत्र होना चाहिए. कम है कि 1000 की घटनाओं के साथ प्रयोग उच्च परिवर्तनशीलता का उत्पादन होगा. ModFit एलटी (सत्य सॉफ्टवेयर), मल्टी साइकिल ए वी (फीनिक्स फ्लो सिस्टम), और फ्लो जो (ट्री स्टार) के रूप में सॉफ्टवेयर संकुल के गणितीय अनुमानों का प्रयोग करेंG1, एस, और / G2 एम आबादी है कि छवि में दिखाया गया उन जैसे histograms में वक्र के आकार के लिए योगदान. 2B और सी.
6. प्रतिनिधि परिणाम:
हम प्रयोगात्मक कोशिका चक्र विश्लेषण के हमारे दृष्टिकोण का उपयोग कर तीन उदाहरण प्रदान करते हैं. पहले माउस भ्रूणीय fibroblasts में cyclin निर्भर kinase अवरोध करनेवाला p27KIP1 रेट्रोवायरल अभिव्यक्ति का उपयोग करता है. चौबीस घंटे के बाद वायरल संक्रमण के लिए दवा चयन पूरा हो गया है, कोशिकाओं थे नाड़ी BrdU साथ एक घंटे के लिए लेबल. इस प्रयोग में अवरोध करनेवाला के अस्थानिक अभिव्यक्ति (छवि 3 ए और बी) कोशिकाओं के प्रसार को गिरफ्तार करने के लिए प्रयोग किया जाता है. जैसा छवि में दिखाया गया है. 3B थोड़ा BrdU सकारात्मक घटनाओं एस चरण फाटक में p27 के लिए जवाब में स्पष्ट कर रहे हैं. इसी तरह, p27 व्यक्त कोशिकाओं के लिए एस चरण में कोशिकाओं का प्रतिशत काफी कम है के रूप में छवि में diagramed. 3C. विश्लेषण के इस प्रकार के बहुत प्रभावी कोशिकाओं में कोशिका चक्र नियंत्रण दोष जी के विभिन्न प्रकारों से व्युत्पन्न निस्र्पक में किया गया हैचूहों 6, 7, 8 ene लक्षित.
दूसरे प्रयोग में, untransformed स्तन उपकला कोशिकाओं (MCF10A) विकास निरोधात्मक cytokine के साथ इलाज किया गया, 24 घंटे के लिए वृद्धि कारक बीटा (TGF-β1) को बदलने. कक्ष BrdU के साथ चार घंटे के लिए तुरंत कटाई करने के लिए पहले लेबल रहे थे. जैसा छवि में दिखाया गया है. 4 एस चरण की कोशिकाओं में BrdU लेबलिंग बहुत TGF-β1 संकेतन द्वारा कम है, हमारे धुंधला की विशिष्टता भी एक आईजीजी नकारात्मक नियंत्रण (छवि 4C) के साथ मान्य है. कोशिका चक्र के विभिन्न चरणों की मात्रा का ठहराव की पुष्टि करता है कि TGF β1 मुख्य रूप से सेल चक्र के G1 चरण में प्रसार रोकता है, इस चरण में एक संचय के लिए अग्रणी है.
हमारे पिछले उदाहरण में, PRB कमी SaOS-2 कोशिकाओं सीएमवी-CD20 अभिव्यक्ति वेक्टर और या तो सीएमवी - आरबी या एक नियंत्रण के रूप में सीएमवी β - लड़की के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं. अभिकर्मक कोशिकाओं के बाद तीन दिन काटा थे, दाग, और तय है. इन सेल के प्रवाह cytometry विश्लेषणचित्र में दिखाया गया है. 5. यह PRB अभिव्यक्ति के 72 घंटे के बाद वितरण (छवि 5B) के साथ तुलना में नकारात्मक नियंत्रण ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं (छवि 5A) के सेल चक्र वितरण को दर्शाता है. मल्टी साइकिल सॉफ्टवेयर द्वारा वक्र ढाले के बाद, कोशिका चक्र के चरणों के अनुपात के एक प्रत्यक्ष तुलना छवि में दिखाया गया है. 5C. इस G1 निम्नलिखित PRB अभिव्यक्ति और G2 एस / एम चरणों से कोशिकाओं के रिश्तेदार रिक्तीकरण में कोशिकाओं के संचय से पता चलता है. हम इस परख में बदलाव किया है G1 गिरफ्तारी 9 बड़े पैमाने पर तंत्र, 10, 11, 12, 13 की जांच कर सकते हैं.
इन उदाहरणों का प्रदर्शन कैसे कोशिका चक्र नियंत्रण उत्तेजनाओं या सेल जोड़तोड़ की एक किस्म के जवाब में मापा जा सकता है है. इस दृष्टिकोण को इसलिए कई अनुप्रयोगों है कि सेल संस्कृति प्रकार के प्रयोगों में चक्र की स्थिति के माप की आवश्यकता के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
चित्रा 1 quantit.कोशिका चक्र के चरणों के संयुक्त propidium आयोडाइड और BrdU धुंधला हो जाना (PI-BrdU) द्वारा व्यावहारिक. (ए) इस पैनल propidium आयोडाइड और BrdU दाग कोशिकाओं के तीन आयामी प्रवाह cytometry प्रदर्शित करता है. ध्यान दें कि 2N और 4N डीएनए सामग्री के साथ कोशिकाओं propidium आयोडाइड धुंधला तीव्रता के लिए 200 और 400 एक्स अक्ष पैमाने पर अंक पर केंद्रित कर रहे हैं. BrdU धुंधला तीव्रता Y-अक्ष पर लघुगणकीय पैमाने पर मापा जाता है. नोट G1, एस, और / G2 एम सेल चक्र के चरणों में कोशिकाओं quantitate किया फाटकों की स्थिति. (बी) एक से G1, एस, और / G2 एम फाटक के प्रत्येक में कोशिकाओं के रिश्तेदार अनुपात इस ग्राफ पर दिखाए जाते हैं.
चित्रा 2 कक्ष चयनित propidium आयोडाइड और कोशिका की सतह मार्कर CD20 का उपयोग कोशिकाओं में चक्र के चरणों की quantitation . (ए) इस पैनल propidium आयोडाइड और कोशिकाओं का एक मिश्रण के लिए CD20 धुंधला से पता चलता है, जिनमें से कुछ ectopically CD20 और PRB व्यक्त. नोट करें कि के साथ कोशिकाओं2N और 4N डीएनए (सबसे प्रचुर मात्रा में आबादी) एक्स अक्ष पर 200 और 400 अंक से अधिक केंद्रित कर रहे हैं. CD20 + फाटक की स्थिति कोशिकाओं है कि कम से कम 10X अधिक पृष्ठभूमि से ज्यादा चमकीले दाग रहे हैं का चयन करता है. (बी) propidium आयोडाइड धुंधला बनाम सेल की गिनती के एक ग्राफ CD20 नकारात्मक कोशिकाओं पैनल में एक है कि अतुल्यकालित रहे हैं proliferating के लिए दिखाया गया है. (सी) एक समान ग्राफ पैनल से CD20 सकारात्मक कोशिकाओं के लिए दिखाया गया है कि PRB अभिव्यक्ति के साथ गिरफ्तारी और मुख्यतः 2N डीएनए सामग्री के साथ कोशिकाओं के होते हैं करने के लिए प्रेरित किया गया है. यह दर्शाता है कि एक गिरफ्तार उप आबादी इस धुंधला तकनीक का उपयोग कर इस संस्कृति में अन्य कोशिकाओं से प्रतिष्ठित किया जा सकता है.
P27KIP1 द्वारा चित्रा 3 सेल प्रसार का निषेध है . (ए) PI-BrdU विश्लेषण करने के लिए कक्षों की एक asynchronously proliferating आबादी है कि एक खाली pBABE रेट्रोवायरल vecto साथ transduced थे कोशिका चक्र चरणों को मापने के लिए प्रयोग किया जाता हैआर (बी) कक्षों की एक समान विश्लेषण pBABE-p27 साथ transduced. एस चरण और G1 और G2 / एम फाटकों में घटनाओं की अधिक से अधिक तीव्रता में कोशिकाओं के अभाव नोट. (सी) asynchronously नियंत्रण और p27 व्यक्त कोशिकाओं proliferating में सेल चक्र के चरणों में कोशिकाओं के quantitation.
चित्रा 4 सेल प्रसार के TGF-β1 निषेध (ए) asynchronously MCF10A कोशिकाओं proliferating का विश्लेषण PI-BrdU. (बी) 24 घंटे के लिए 100 TGF-β1 PM के साथ इलाज किया कोशिकाओं का विश्लेषण. कोशिकाओं के संचय सेल चक्र के G1 चरण में मुख्य रूप से ध्यान दें. (सी) asynchronously proliferating कोशिकाओं में एक गैर विशिष्ट आईजीजी नियंत्रण के साथ विरोधी BrdU प्राथमिक एंटीबॉडी की जगह द्वारा BrdU धुंधला के मान्यकरण. (डी) से संबंधित कोशिका चक्र के चरणों के आलेखीय quantitation और बी.
5 चित्रा PRB द्वारा सेल प्रसार के निषेध. (ए) CD20 propidium आयोडाइड धुंधला और ß लड़की ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की तुलना में सेल मायने रखता है दिखाया गया है. यह एक महत्वपूर्ण नियंत्रण के रूप में आंशिक रूप से अभिकर्मक कोशिकाओं सिंक्रनाइज़ कर सकते हैं untransfected जनसंख्या (CD20 - कोशिकाओं) प्रतिपादन ट्रांसफ़ेक्ट उप जनसंख्या के लिए एक अनुचित नियंत्रण के रूप में. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को अन्य तुलनात्मक रूप से ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के साथ तुलना करने की आवश्यकता है. (बी) सेल मायने रखता है बनाम CD20 और PRB के propidium आयोडाइड ग्राफ कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट. एक 2N चोटी के लगभग अनन्य उपस्थिति ध्यान दें. (सी) कोशिका चक्र चरण अनुपात के ग्राफ़िकल प्रतिनिधित्व ए और बी मल्टी साइकिल सॉफ्टवेयर में वक्र ढाले तरीकों का उपयोग कर से निर्धारित है.
Discussion
हमारे अनुभव में, इन तकनीकों के साथ सफलता के कुछ महत्वपूर्ण नियंत्रण और प्रयोगात्मक शर्तों पर निर्भर है. एक इन प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए एक asynchronously proliferating नियंत्रण स्थापित कर रहा है. यह नियंत्रण में तीन महत्वपूर्ण उद्देश्यों में कार्य करता है. सबसे पहले, यह सुनिश्चित करता है कि संस्कृति सभी प्रयोगात्मक नमूने के लिए इस्तेमाल किया शर्तों को उपचार के अभाव में नित्य प्रसार का समर्थन करने के लिए पर्याप्त हैं. यह नमूना भी धुंधला हो जाना करने के लिए सुनिश्चित करें कि BrdU या CD20 सकारात्मक कोशिकाओं जब वे मौजूद हैं पता लगाया जा सकता है पद्धति के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के उद्देश्य से कार्य करता है. अन्त में, इस नमूने प्रवाह कोशिकामापी जांचना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यह नियंत्रण का नमूना propidium आयोडाइड धुंधला तीव्रता समायोजित क्रमशः 200 और 400 पर 2N और 4N कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, BrdU या CD20 का पता लगाने संवेदनशीलता इतना है कि नकारात्मक और सकारात्मक संकेतों के रूप में केंद्रित कर रहे हैं आंकड़े 1A और 2A में दिखाया समायोजित किया जा सकता है. जब सभी नमूनों PI - आर में एक कोशिकाओं के समान एकाग्रता हैNase समाधान है, तो कोशिकामापी के लिए कुछ समायोजन के बाद नमूनों के रूप में चलाए जा रहे हैं की जरूरत है. इस चित्र में दिखाया कारणों के लिए महत्वपूर्ण है. 4B और 5B जहां मजबूत G1 संचय अनिवार्य रूप से एक ही G1 के शिखर कि G2 / एम. के रूप में misinterpreted किया जा सकता है है बनाता है
प्रतिनिधि प्रयोगों को भी अन्य महत्वपूर्ण बिंदुओं बनाते हैं. सबसे पहले, वे दिखाना है कि BrdU तेज और लेबलिंग सेल प्रकार के बीच भिन्न हो सकते हैं. इस कारण के लिए यह महत्वपूर्ण है empirically नाड़ी और धुंधला हो जाना करने के लिए पर्याप्त रूप से एस चरण में कोशिकाओं का पता लगाने के लिए आवश्यक शर्तों की लंबाई निर्धारित. सामान्य में, सेल प्रकार है कि 24 घंटे या उससे कम में संस्कृति में डबल BrdU के साथ एक घंटे में लेबल किया जा सकता है. धीमी बढ़ती सेल प्रकार अब दालों एंटीबॉडी धुंधला शर्तों और अवधि के लिए और परिवर्तन की आवश्यकता हो सकती है. MCF10A कोशिकाओं को इस संबंध में एक उत्कृष्ट उदाहरण के रूप में वे BrdU के साथ चार घंटे और दाग के लिए दो बार के रूप में लंबे समय चार बार के लिए एंटीबॉडी के मानक एकाग्रता के साथ लेबल रहे थे. जांचकर्तासावधान रहना चाहिए BrdU के 6 घंटे से अधिक नहीं भी बहुत धीरे धीरे बढ़ कोशिकाओं के साथ लेबलिंग के रूप में इस ग़लती / G2 एम एस चरण जनसंख्या में कोशिकाओं के समावेश करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. दूसरे, TGF-β1 उन लोगों के साथ p27KIP1 अभिव्यक्ति के प्रभाव की तुलना में, यह स्पष्ट है कि p27 या तो G1 या G2 / एम चरणों में एक संचय प्रेरित जबकि TGF-β1 संकेतन एक G1 गिरफ्तारी लाती है. 3 एच thymidine निगमन और जगमगाहट गिनती जैसे प्रसार का पता लगाने के पारंपरिक साधनों इन संभावनाओं भेद करने में असमर्थ हैं.
हमारे वैकल्पिक प्रोटोकॉल में हम एक बड़ा untransfected आबादी में कक्षों की एक उप जनसंख्या का पता लगाने के प्रदर्शित करता है. यह empirically ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का पता लगाने के लिए सबसे उपयुक्त संवाददाता निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है. हमारे अनुभव में कुछ सेल प्रकार के या तो व्यक्त कोशिका की सतह खराब मार्करों, या ठीक से उन्हें प्लाज्मा झिल्ली यातायात, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का पता लगाने में असमर्थता में जिसके परिणामस्वरूप नहीं कर सकते. एलikewise, GFP की झिल्ली बाध्य फार्म बर्दाश्त नहीं सभी कोशिकाओं. का चयन सबसे उपयुक्त रिपोर्टर रिपोर्टर की अभिकर्मक दक्षता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से untransfected नियंत्रण की तुलना में अभिव्यक्ति के रिश्तेदार तीव्रता का आकलन करने के द्वारा किया जाना चाहिए. आदर्श रूप में, इन अणुओं की heterologous अभिव्यक्ति अच्छी तरह सहन और इस विचारोत्तेजक है कि मार्कर कोशिका चक्र वितरण पर कोई प्रभाव नहीं करने के लिए थोड़ा है.
प्रवाह cytometry दृष्टिकोण के इन प्रकार की एक सीमा है कि वे केवल एक दूसरे की तुलना में कोशिका चक्र के चरणों के रिश्तेदार abundances स्थापित करने में सक्षम हैं. इस कारण से यह अस्पष्ट है अगर p27 चित्रा 3 में अभिव्यक्ति वास्तव में G1 और G2 / एम, में एक गिरफ्तारी लाती है या अगर यह सिर्फ इन चरणों एस चरण के लिए रिश्तेदार के माध्यम से प्रगति को धीमा. इन संभावनाओं कक्षों की nocodazole जैसे एक mitotic अवरोध करनेवाला, या aphidicolin तरह अवरोध करनेवाला / G1 एस के साथ एक समानांतर नमूना इलाज के द्वारा आगे की जांच कर सकते हैं. के बाद से इन दवाओं एक Domina बनाने केएम चरण में NT के गिरफ्तारी या एस चरण क्रमश: जल्दी, धीरे धीरे proliferating कोशिकाओं दवा प्रेरित गिरफ्तारी बिंदु पर जमा करेंगे. उदाहरण के लिए PRB अभिव्यक्ति की वजह से G1 में गिरफ्तार कोशिकाओं G1 में nocodazole इलाज के बावजूद रहते हुए नियंत्रण कक्ष 13 एम चरण में जमा होगा.
साथ में ले ली, इन प्रयोगात्मक दृष्टिकोण एक लचीला पद्धति है कि स्तनधारी कोशिका चक्र अनुसंधान सवालों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है प्रदान करते हैं. वे आसानी से कोशिका चक्र प्रगति में परिवर्तन का पता लगाने सकता है और मतभेद जब नियंत्रण के साथ तुलना यों.
Disclosures
लेखकों खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों के लिए स्वास्थ्य (CIHR) अनुसंधान और उनकी प्रयोगशाला में कोशिका चक्र अनुसंधान के वित्तपोषण के लिए कनाडा के कैंसर सोसायटी की कनाडा के संस्थानों धन्यवाद. MJC CIHR से एक एमडी / पीएचडी फैलोशिप के एक प्राप्तकर्ता है. MJC और एमए CaRTT प्रशिक्षण कार्यक्रम के सदस्य हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Proliferation Labeling reagent | GE Healthcare | RPN201 | |
| Anti-BrdU Antibodies | BD Biosciences | 347580 | |
| Anti-Mouse FITC conjugated Antibodies | Vector Laboratories | FI-2000 | |
| Cell Strain Filters | BD Biosciences | 352235 | |
| Anti-CD20 Antibodies | BD Biosciences | 347673 | |
| Multi Cycle Software | Phoenix Flow Systems | N/A |
References
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