Analys av cellcykeln Position i däggdjursceller

Summary

Bestämma position cellcykeln av en befolkning av celler, eller förstå hur signaler påverkar spridning, lätt kan mätas med flödescytometri med hjälp av detta protokoll. Vi rapporterar ett enkelt experimentellt förhållande till färgning celler och kvantifiera deras position i cellcykeln.

Abstract

Regleringen av celldelning är central vävnad morfogenes under utvecklingen av flercelliga organismer. Dessutom ligger bakom förlust av kontroll av celltillväxt patologi av sjukdomar som cancer. Som sådan finns det stort behov av att kunna undersöka celltillväxt och kvantifiera hur stor andel av cellerna i varje fas av cellcykeln. Det är också av avgörande betydelse för åtskillnad identifiera celler som kopierar sitt DNA i en större population. Eftersom en cell beslut att föröka görs i G1-fasen omedelbart före start av DNA-syntes och utvecklas genom resten av cellcykeln, tillåter detektion av DNA-syntes i detta skede en entydig bestämning av status för tillväxtreglering i cellodling experiment.

DNA-innehåll i celler kan lätt kvantifieras genom flödescytometri av celler färgas med propidiumjodid, en fluorescerande DNA intercalating färgämne.Likaså kan aktiva DNA-syntesen kvantifieras genom odling av celler i närvaro av radioaktivt tymidin, skörd cellerna, och mäta införlivandet av radioaktivitet till en syra olöslig fraktion. Vi har stor kompetens med cellcykeln analys och rekommenderar en annan strategi. Vi undersöker celltillväxt med bromodeoxyuridine / fluorodeoxyuridine (förkortat enkelt som BrdU) fläckar som upptäcker införlivandet av dessa tymin analoger till nyligen syntetiserade DNA. Märkning och färgning celler med BrdU, i kombination med total DNA-färgning av propidiumjodid och analys med flödescytometri ¹ erbjuder den mest exakta måttet på celler i olika faser av cellcykeln. Det är vår bästa metoden eftersom den kombinerar upptäckt av aktiva DNA-syntesen genom antikroppar baserade färgning av BrdU, med en total DNA-innehåll från propidiumjodid. Detta möjliggör en klar uppdelning mellan celler i G1 från tidig S-fasen, eller sen S-fasen från G2 / M.Dessutom kan denna metod användas för att undersöka effekterna av många olika celler stimuli och farmakologiska agenter på regleringen av progression genom dessa olika faser cellcykeln.

I denna rapport beskriver vi metoder för märkning och färgning odlade celler, liksom deras analys med flödescytometri. Vi inkluderar även experimentell exempel på hur denna metod kan användas för att mäta effekterna av tillväxten hämmande signaler från cytokiner såsom TGF-β1 och proliferativa hämmare såsom cyklin beroende kinas-hämmare, p27KIP1. Vi inkluderar även en alternativ protokoll som möjliggör analys av cellcykeln position i en delpopulation av celler inom en större kultur ^5. I detta fall visar vi hur man upptäcker en gripande cellcykeln i celler transfererats med retinoblastom genen även då kraftigt underläge med untransfected celler i samma kultur. Dessa exempel illustrerar olika sätt att DNA färgning ochflödescytometri kan användas och anpassas för att utreda grundläggande frågor av däggdjur kontrollen av cellcykeln.

Protocol

1. Märkning och fastställande av celler

1. Tillsätt 1 mikroliter av celltillväxt Labeling Reagent (BrdU) per ml cellkulturmedium (1 till 1000 utspädning) 1 timme före skörd. Märkningen period kan behöva förlängas för långsammare växande celler.
2. Att skörda celler, aspirera odlingsmedium och tvätta noggrant med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Upprepa för att noggrant avlägsna spår av medium.
3. Tvätta kulturer snabbt en tredje gång med PBS innehållande 3mm EDTA och aspirera ordentligt.
4. Lägg en liten volym PBS innehållande 3mm EDTA till varje maträtt, är 0,5 ml för en 6 cm parabolantenn ideal. Inkubera vid 22 ° C i ca 5 minuter att lossa celler. Överför till ett 15 ml koniskt rör.
5. Centrifugera cellerna vid 500 xgi 5 minuter till pellets, avlägsna supernatanten och återsuspendera grundligt i 100 mikroliter PBS.
6. Fixera cellerna genom att tillsätta 5 ml 95% EtOH, droppvis, medan vortexa. I detta steg kan cellerna lagras vid 4 ° C under minst enmånad.

2. Denaturering och färgning av BrdU och DNA

1. Centrifugera cellerna vid 500 xgi 5 minuter till pellets celler och ta bort 95% EtOH. Resuspendera i 1 ml 2N HCl och 0,5% Tx-100 genom att lägga i en droppe klokt sätt när vortexa. Inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter.
2. Centrifug som tidigare i avsnitt 2.1 och försiktigt aspirera supernatanten eftersom cellerna bildar ett väldigt löst pellets i detta steg. Försiktigt återsuspendera i 1 ml 0,1 miljoner NAB ₄ O ₇ (pH 8,5) och inkuberas i minst 30 minuter vid rumstemperatur.
3. Pellets celler som ovan i avsnitt 2,1 och återsuspendera i 0,5 ml antikroppar lösning (PBS innehållande 1% BSA och 0,2% Tween-20) med mus-anti-BrdU antikroppar utspädd 1 till 50. Inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter.
4. Pellets celler igen och återsuspendera i 50 ml antikroppar lösning innehållande kanin anti-mus sekundära antikroppar konjugerade med FITC utspädd 1 till 25. Inkubera i 30 minuter påbänkskiva och skydda mot ljus.
5. Centrifugera cellerna en sista gång och återsuspendera i 0,5 ml propidiumjodid och RNas lösning (PI-RNAse lösning, PBS med 1% BSA, 10 mg / ml propidiumjodid, 0,25 mg / ml RNase A) och inkubera i mörker vid 37 ° C i 30 minuter. Alternativt RNA kan smälta över natten vid 4 ° i mörkret C.
6. Pass lösning genom en cell sil för att ta bort aggregat och samla enskilda celler i en lämplig slang för prov upptag på din flödescytometer. Återigen bör proverna skyddas från direkt ljus.

3. Analys med flödescytometri

1. Celler bör analyseras av en vanlig flödescytometer som klarar av att diskriminera dubletter (två celler som passerar flödet cellen som en) med lämpliga upptäckt kapacitet för propidiumjodid och FITC. Enstaka celler kan upptäckas på detta flödescytometri ansökan genom gating för händelser baserade på Forward Scatter och Side Scatter popdes strax, och genom att använda egenskaper hos DNA färgning av propidiumjodid. Utseendet på en doublet diskriminerande dot plot varierar mellan flödescytometrar och förlitar sig på propidium fastigheter jodid färgning, se din lokala anläggning flödescytometri för råd om att inrätta en dublett diskriminator i din analys. I allmänhet i ett asynkront förökar population av celler, enskilda celler är oftast de två mest förekommande toppar (2N och 4N DNA) i doublet diskriminerande handlingen och en port skulle dras runt dem. Detta kommer att välja en enda cell händelser som används för alla efterföljande analysen nedan.
2. Det första provet som skall analyseras bör vara ett asynkront sprider kultur som fungerar som en positiv kontroll för färgning och flödescytometer set-up. Justera känslighet Fotomultiplikatorrör för propidiumjodid färgning så att 2N och 4N toppar från singlet cellerna är centrerade vid 200 och 400 (godtyckliga enheter) på X-axeln. Vi fläcken ofta en riklig sleverans av dessa celler att säkerställa att alla parametrar flödescytometern har justerats på lämpligt sätt utan att använda upp detta prov. Denna positiva kontrollen är också till hjälp för nya användare att bli mer bekant med driften av flödescytometer.
3. Justera känslighet fotomultiplikatorn rör för FITC upptäckt sådan som G1 och G2 / M populationer är över bakgrundsnivån. BrdU positiva celler bör vara ungefär 10 gånger starkare och Y-axeln ska visas som en logaritmisk skala. Det är ibland bra att inkludera en negativ kontroll för BrdU färgning (genom att ersätta den anti-BrdU antikroppar med icke-specifika IgG i steg 2,3 ovan) att tydligt skilja positivt färgade celler.
4. Justera kompensationen mellan propidiumjodid och FITC så att enstaka händelser fångas av flödescytometern bildar en hästsko formad båge från G1 i det nedre vänstra upp till S-fas och ner i det nedre högra för G2 / M. Se följande referens för en mer djupgående disdiskussionen av de principer och användning av flödescytometri och referenser där i för specifika tillämpningar ^2.

4. Dataanalys

1. 5 000 till 10 000 enskild cell händelser med önskad mängd DNA-innehåll bör samlas in för varje prov för att få förtroende för att befolkningen i celler i kulturen grundligt har provtagits.
2. När celler har mätts för propidiumjodid och BrdU innehåll de måste tilldelas G1, S eller G2 / M faser. Gör detta genom att rita grindar runt två BrdU negativa populationer centrerade vid 200 och 400 (G1 och G2 / M respektive). Allt ovanför dessa rutor bör ingå i en enda grind som mäter S-fas (bild 1A). Andelen celler i varje port representerar den relativa antalet celler i G1, S, och G2 / M (Fig. 1B).

5. Alternativ protokoll för analys av cellcykeln i en blandad population av celler

1. Denna alternativa protokollettill största nytta när transfektion av expressionsvektorer resultat rutinmässigt i en liten andel av celler som uttrycker genen produkt av intresse, eller när läkemedelsbehandling för att välja en ren population av celler är opraktiskt. Detta resulterar i en relativt liten andel av celler av ränta är förorenat med en stor population av untransduced celler. I det här fallet, co-transfektera plasmider uttrycka din gen eller shRNA av intresse tillsammans med en plasmid som uttrycker en markör för att upptäcka transfekterade celler med flödescytometri, t.ex. ett membran förankrad GFP ^3, eller en utländsk cellytan markör som CD19 ⁴ eller CD20 ^5.
2. Vid tillämpningen av detta protokoll kommer vi att använda CD20 färgning som ett exempel, men färgning för CD19 är i huvudsak identiska. Vid transfektion med CD20, det finns ingen anledning att BrdU etikett, helt enkelt skörda celler som beskrivs i steg från 1,2 till 1,5 ovan och fläcken genom att lägga till 20 mikroliter FITC-konjugerat anti-CD20 antikroppar mot de celler om jagce i 20 minuter i mörker. Fix celler som beskrivs i steg 1,6. Celler kan åter lagras i minst en månad vid 4 ° C i mörker. För detektion av GFP, utelämnar antikroppar färgning från detta steg och fixa och lagra celler som beskrivs.
3. Återfukta cellerna genom pelletering i centrifugera vid 500 xg under 5 minuter och resuspending i 5 ml PBS innehållande 1% BSA.
4. Re-pellets cellerna vid 500 xg under 5 minuter och återsuspendera cellerna i 0,5 ml propidiumjodid och RNas lösning som beskrivs ovan i avsnitt 2.5.
5. Fortsätt att följa instruktionerna cellberedningen i 2,6 och analys instruktionerna i 3,1 och 3,2.
6. Justera känslighet fotomultiplikatorn rör för FITC upptäckt så att ofärgade celler ovan bakgrund. Helst ska CD20-FITC positiva celler vara 10X till 100X mer intensivt färgade än bakgrunden och Y-axeln av denna tomt ska visas som en logaritmisk skala (Fig. 2A). CD20 positiva celler som är 10x ljusare än backgrunda (och med propidiumjodid färgning mellan 200 och 400) bör väljas för visning i en propidiumjodid kontra raknas histogram som visas i figur. 2C. För cellinjer som uttrycker markörer som lätt färgas ljust (dvs. 10X till 100X ovanstående bakgrund) CD20 positiva cut-off skulle fastställas till 10X bakgrund. Införande av svagare färgning celler ökar variabiliteten i dessa experiment, förmodligen därför att genen av intresse är också svagt uttryck i dessa celler. För cellinjer som bara ger svagt färgade CD20 positiva (dvs mindre än 10X bakgrund), bestämning av en avskuren bör göras med en negativ kontroll bestående av CD20 färgade, untransfected celler.
7. Minst 1000 CD20 positiva händelser ska samlas in för varje prov. Experiment med färre än 1000 evenemang som kommer att producera hög variabilitet. Programvarupaket som ModFit LT (Verity Software), Multi Cycle AV (Phoenix Flow Systems), och Flow Jo (Träd stjärna) använda matematiska beräkningar avG1, S, och G2 / M populationer som bidrar till formen på kurvan i histogrammen som de visas i bild. 2B och C.

6. Representativa resultat:

Vi ger tre exempel på experimentella analyser cellcykeln använda våra metoder. Den första använder retrovirala uttryck av cyklin beroende kinas-hämmare p27KIP1 i mus embryonala fibroblaster. Tjugofyra timmar efter drogen val för virusinfektion var klar, var cellerna puls märkta med BrdU i en timme. I detta experiment ektopisk uttryck hämmaren används för att stoppa spridning av cellerna (Fig. 3A och B). Som visas i figur. 3B lite BrdU positiva händelser är tydligt i S-fas grind som svar på P27. Likaså är andelen celler i S-fas för P27-innehållande celler ganska lågt som diagramed i bild. 3C. Denna typ av analys har varit mycket effektiv i kännetecknar cellen defekter cykeln kontroll i celler från olika stammar av gene riktade möss ^{6, 7, 8.}

I det andra experimentet var oomvandlad bröst epitelceller (MCF10A) som behandlades med tillväxten hämmande cytokin, omvandla beta tillväxtfaktor en (TGF-β1) i 24 timmar. Celler var märkta med BrdU i fyra timmar omedelbart före skörd. Som visas i figur. 4 BrdU märkning i S-fas celler är kraftigt negativt av TGF-β1 signalering är specifika för vår färgning också valideras med ett IgG-negativ kontroll (Fig. 4C). Kvantifiering av de olika faserna i cellcykeln bekräftar att TGF-β1 främst hämmar proliferation i G1 fasen av cellcykeln, vilket leder till en ackumulering i denna fas.

I vårt sista exempel är PRB bristfällig SAOS-2-celler transfekterade med en CMV-CD20 uttryck vektor och antingen CMV-RB eller CMV-β-Gal som en kontroll. Tre dagar efter transfektion cellerna har skördats, målat, och fasta. Flödescytometri analys av dessa cellers är enl. 5. Detta visar fördelningen cellcykeln negativa transfekterade Control Cells (Fig. 5A) i jämförelse med fördelning efter 72 timmar PRB uttryck (Fig. 5B). Efter kurvanpassning av Multi cykel programvara är en direkt jämförelse av andelen faserna cellcykelns visas i bild. 5C. Detta avslöjar en ansamling av celler i G1 efter PRB uttryck och den relativa utarmning av celler från S och G2 / M faser. Vi har använt varianter av denna analys för att undersöka G1 arrestera mekanismer omfattande ^{9, 10, 11, 12, 13.}

Dessa exempel visar hur kontrollen av cellcykeln kan mätas som svar på en mängd olika stimuli eller manipulationer cell. Detta synsätt kan därför anpassas till många tillämpningar som kräver mätning av cellcykeln ställning i experiment kultur typ.

Figur 1. Quantitring av faserna cellcykeln genom kombinerad propidiumjodid och BrdU färgning (PI-BrdU). (A) Denna panel visar tredimensionell flödescytometri av propidiumjodid och BrdU celler färgade. Observera att celler med 2N och 4N DNA-innehåll är centrerad över 200 och 400 märken på X-axeln skala för propidiumjodid färgningsintensitet. BrdU färgningsintensitet mäts på en logaritmisk skala på Y-axeln. Notera ställning portarna används för att kvantifiera celler i G1, S, och G2 / M faser av cellcykeln. (B) Den relativa andelen av celler i varje G1, S, och G2 / M portar från A visas på denna graf.

Figur 2. Kvantifiering av faser cellcykelns i utvalda celler med propidiumjodid och cellytan markören CD20. (A) den här panelen visas propidiumjodid och CD20 färgning för en blandning av celler, varav en del uttryck ectopically CD20 och PRB. Observera att celler med2N och 4N DNA (den mest förekommande populationer) är centrerad över 200 och 400 märken på X-axeln. Placeringen av CD20 + grind väljer celler som färgats minst 10X starkare än bakgrund. (B) En graf av celler kontra propidiumjodid färgning visas för CD20 negativa celler i panelen A som asynkront breder ut sig. (C) Ett liknande diagram visas för CD20 positiva celler från panel A som har lockats att arrestera med PRB uttryck och innehåller celler med främst 2N DNA-innehåll. Detta visar att en greps delpopulation kan särskiljas från andra celler i denna kultur med denna målningsteknik.

Figur 3. Hämning av cellproliferation av p27KIP1. (A) PI-BrdU analys används för att mäta faserna cellcykeln i ett asynkront förökar population av celler som transduced med en tom pBABE retrovirala VECTOr. (B) En liknande analys av celler transduced med pBABE-P27. Notera avsaknaden av celler i S-fas och större intensitet av händelser i G1 och G2 / M grindar. (C) Kvantifiering av celler i respektive fas av cellcykeln i asynkront sprider kontroll och P27-innehållande celler.

Figur 4. Hämning av cellproliferation av TGF-β1 (A) PI-BrdU analys av asynkront förökar MCF10A celler. (B) Analys av celler som behandlats med 100 pm av TGF-β1 i 24 timmar. Notera ansamlingen av celler främst i G1 fasen av cellcykeln. (C) Validering av BrdU färgning genom att ersätta den anti-BrdU primära antikroppen med en icke-specifik IgG-kontroll i asynkront celler som förökar sig. (D) Grafisk kvantifiering av respektive faserna cellcykeln från A och B.

Figur 5. Hämning av cellproliferation av PRB. (A) celltal kontra propidiumjodid färgning av CD20 och SS-gal transfekterade celler visas. Detta är en viktig kontroll som transfektion kan delvis synkronisera celler, vilket gör att untransfected befolkningen (CD20 - celler) som en olämplig kontroll för transfekterade delpopulation. Transfekterade celler måste jämföras med andra motsvarande sätt transfekterade celler. (B) celltal kontra propidiumjodid graf av CD20 och PRB transfekterade celler. Notera den nästan uteslutande närvaron av en 2N topp. (C) Grafisk representation av fas cellcykelns proportioner bestäms av A och B med hjälp av kurvanpassning metoder i Multi Cycle programvara.

Discussion

Enligt vår erfarenhet är att lyckas med dessa tekniker beroende av ett fåtal viktiga kontroller och experimentella förhållanden. En är om inrättande av ett asynkront förökar kontroll för användning i dessa experiment. Denna kontroll tjänar tre viktiga syften. Först ser den till att kulturen förutsättningar för alla experimentella prov är tillräckliga för att stödja kontinuerlig spridning i frånvaro av behandling. Detta prov tjänar också syftet med en positiv kontroll för färgning metoden för att säkerställa att BrdU eller CD20 positiva celler kan upptäckas när de är närvarande. Slutligen är detta prov används för att kalibrera flödescytometern. Denna kontroll prov kan användas för att justera propidium intensitet jodid färgning att upptäcka 2N och 4N celler vid 200 och 400 respektive. Dessutom kan upptäcka känslighet BrdU eller CD20 justeras så att negativa och positiva signaler är centrerade som visas i figurerna 1a och 2a. När alla prover har en liknande koncentration av celler i PI-RNase lösning, sedan några justeringar av cytometern behövs som efterföljande prover körs. Detta är viktigt av skäl som visas i bild. 4B och 5B där starka G1 ackumulation skapar i huvudsak ett enda G1 topp som skulle kunna misstolkas som G2 / M.

Representanten experiment gör även andra viktiga punkter. Först och främst visar de att BrdU upptag och märkning kan variera mellan celltyper. Av denna anledning är det viktigt att empiriskt bestämma längden på pulsen och villkor färgning som behövs för att tillräckligt upptäcka celler i S-fas. I allmänhet kan celltyper som fördubblas i kultur i 24 timmar eller mindre märkas med BrdU i en timme. Långsammare växande celltyper kan kräva längre pulser och ändringar villkor antikropp färgning och varaktighet. MCF10A celler är ett utmärkt exempel i detta avseende eftersom de var märkta med BrdU i fyra timmar och färgas med dubbelt så vanliga koncentrationen av antikroppar för fyra gånger så lång. Utredarnabör vara noga med att inte överstiga 6 timmar BrdU märkning även med mycket långsamt växande celler eftersom det kan felaktigt leda till införandet av G2 / M celler i S-fas befolkningen. Andra, som jämförde effekterna av p27KIP1 uttryck med de av TGF-β1, är det tydligt att p27 kan inducera en ackumulering i antingen G1 eller G2 / M faser medan TGF-β1 signalering inducerar en G1 gripande. Traditionella instrument för att upptäcka spridning såsom ³ H-tymidin och scintillationsräknare räknar inte kan skilja dessa möjligheter.

I vår alternativa protokoll vi visar upptäckten av en subpopulation av celler i en större untransfected befolkning. Det är viktigt att empiriskt fastställa de mest lämpliga reporter för att upptäcka transfekterade cellerna. Enligt vår erfarenhet vissa celltyper varken uttryckliga cellytan markörer dåligt, eller kan inte riktigt trafik dem till plasmamembranet, vilket resulterar i en oförmåga att upptäcka transfekterade cellerna. Likewise, inte alla celler tolererar membranet bunden form av GFP. Val av lämpligaste reportern bör göras genom att bedöma transfektion effektiviteten i reporter liksom den relativa intensiteten i uttryck jämfört med untransfected kontroller. Helst ska heterologa uttryck av dessa molekyler tolereras väl och det är suggestiva att markörerna har liten eller ingen effekt på cellcykeln distribution.

En begränsning av dessa typer av tillvägagångssätt flödescytometri är att de bara kunna etablera relativa förekomsten av faserna cellcykeln jämfört med varandra. Av denna anledning är det oklart om uttrycket av p27 i figur 3 verkligen framkallar ett gripande i G1 och G2 / M eller om det bara fördröjer progression genom dessa faser i förhållande till S-fas. Dessa möjligheter kan undersökas ytterligare genom att behandla ett parallellt prov av celler med ett mitotiskt hämmare som nocodazole, eller G1 / S hämmare som aphidicolin. Eftersom dessa läkemedel skapar en dominant greps i M-fas eller tidig S-fas respektive kommer långsamt prolifererande celler ansamlas vid inducerade läkemedelsinteraktioner gripandet punkt. Till exempel celler greps i G1 grund av PRB uttryck kommer att finnas kvar i G1 trots nocodazole behandling medan kontroll celler kommer att samlas i M-fas ^13.

Sammantaget utgör dessa experimentella metoder erbjuder en flexibel metod som kan tillämpas på ett brett spektrum av däggdjur forskning cellcykeln frågor. De kan lätt upptäcka förändringar i cellcykelreglering och kvantifiera skillnaderna jämfört med kontroller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Proliferation Labeling reagent	GE Healthcare	RPN201
Anti-BrdU Antibodies	BD Biosciences	347580
Anti-Mouse FITC conjugated Antibodies	Vector Laboratories	FI-2000
Cell Strain Filters	BD Biosciences	352235
Anti-CD20 Antibodies	BD Biosciences	347673
Multi Cycle Software	Phoenix Flow Systems	N/A