Summary
Kinase Leucine Rich Repeat 2 est une kinase multidomaine grandes, les mutations dans lesquelles sont la cause génétique la plus courante de la maladie de Parkinson. Analyse de l'activité kinase de cette protéine s'est révélée être un outil crucial dans la compréhension de la biologie et le dysfonctionnement de cette protéine. Dans ce papier,
Abstract
Kinase Leucine Rich Repeat 2 (LRRK2) est un acide aminé 2527 membres de la famille ROCO de protéines, possédant une structure complexe et multidomaine, y compris un domaine GTPase (appelé ROC pour Ras de protéines complexes) et un domaine kinase 1. La découverte en 2004 de mutations dans LRRK2 qui causent la maladie de Parkinson (MP) a abouti à LRRK2 être l'objet d'un énorme volume de recherche dans leur fonction normale et comment la protéine se passe mal dans l'état 2,3 maladie. L'enquête initiale sur la fonction de LRRK2 concentré sur ses activités enzymatiques 4-6. Même si une image claire n'a encore émerger d'une altération uniforme dans ces dues à des mutations, des données à partir d'un certain nombre de groupes a souligné l'importance de l'activité kinase de LRRK2 dans la mort cellulaire liée à des mutations 7,8. Des publications récentes ont rapporté des inhibiteurs ciblant l'activité kinase de LRRK2, fournissant un outil clé expérimentale 9-11. À la lumière de ces données, ilest probable que les propriétés enzymatiques de LRRK2 nous offrent une fenêtre importante sur la biologie de cette protéine, bien qu'ils soient des cibles potentielles de médicaments pour la maladie de Parkinson est ouvert au débat.
Un certain nombre d'approches différentes ont été utilisées pour doser l'activité kinase de LRRK2. Initialement, les analyses ont été effectuées en utilisant épitope protéine marquée surexprimé dans des lignées cellulaires de mammifères et immunoprécipité, avec les essais réalisés à l'aide de cette protéine immobilisée sur des billes d'agarose 4,5,7. Par la suite, purifié des fragments recombinants de LRRK2 dans la solution ont également été utilisés, par exemple un fragment TPS marqués purifiés à partir de cellules d'insectes contenant des résidus 970 à 2527 de la LRRK2 12. Récemment, Daniels et al. Rapporté l'isolement de la LRRK2 pleine longueur en solution à partir de cellules embryonnaires de rein, mais cette protéine n'est pas largement disponible 13. En revanche, la fusion TPS tronquée forme de LRRK2 est commercialement disponibe (de Invitrogen, voir le tableau 1 pour les détails), et fournit un outil pratique pour démontrer un dosage de l'activité kinase de LRRK2. Plusieurs sorties différentes pour LRRK2 activité de la kinase ont été signalés. Autophosphorylation de LRRK2 lui-même, la phosphorylation de la protéine de myéline de base (MBP) comme substrat kinase générique et phosphorylation d'un substrat artificiel - LRRKtide surnommé, basée sur la phosphorylation de la thréonine 558 en Moesin - ont tous été utilisés, comme l'ont fait une série de substrats physiologiques putatifs y compris les α-synucléine, Moesin et 4-EBP 14-17. Le statut de ces protéines en tant que substrats pour la LRRK2 reste incertaine, et comme tel le protocole décrit ci-dessous porteront sur l'utilisation de MBP comme substrat générique, en notant l'utilité de ce système à l'activité kinase de dosage LRRK2 dirigée contre une gamme de substrats potentiels.
Protocol
Sécurité
Le protocole décrit ci-dessous utilise l'ATP étiquetés avec radioactifs 32 P à la position du phosphate γ de suivre l'activité kinase de LRRK2. Il est basé sur les protocoles standards utilisés dans notre laboratoire, et donc à l'égard de la plupart des étapes dans le processus comme la course, les gels, western blot, et cetera les matériaux et les conditions précises doivent être prises comme un guide que les équipements et les protocoles utilisée pour ces opérations varie d'un laboratoire à l'. Composés contenant des isotopes qui émettent des rayonnements ionisants sont potentiellement nuisibles pour la santé humaine et de licence et des règlements stricts à un contrôle de niveau institutionnel et national leur utilisation. Les expériences dans ce protocole ont été effectués après la formation en cours d'utilisation source de rayonnement ouverte à l'University College de Londres et en suivant le guide des bonnes pratiques de laboratoire fournis par les services de sécurité au collège (directives available au http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf ). L'utilisation de l'open source de rayonnement ne doit pas être tenté avant la formation appropriée et l'approbation réglementaire. L'organisme de réglementation responsable de l'open source de rayonnement dans la recherche en laboratoire varie de pays à pays. En voici quelques exemples: au Royaume-Uni, le Health and Safety Executive ( http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm ), aux États-Unis, la Nuclear Regulatory Commission ( http:// www.nrc.gov / matériaux / miau / regs-guides-comm.html ), au Canada, la Commission canadienne de sûreté nucléaire ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), et en Allemagne Das Bundesamt für Strahlenschutz ( http : / / www.bfs.de / de / BFS ). Les utilisateurs d'autres pays devraient confirmer les règles, les règlements et les autorités de licence avec leur responsable de la radioprotection. Précautions d'emploi pertinentes à ce protocole ont été notées dans le texte, a souligné avec le symbole radioactif corniculé ( 
).
1. Préparer les réactions kinase
Tous les mélanges de réaction préparés dans des tubes d'échantillon 1.5ml avec bouchons à vis contenant un joint torique pour empêcher la propagation de la radioactivité.
- Dégel des protéines sur la glace - LRRK2 de type sauvage, D1994A, G2019S.
- composent de réaction sur glace - 10 nM LRRK2, 0.5μg/μl MBP, 5ul de tampon kinase 10x, 50 pl effectués jusqu'à l'eau.
2. Exécution du test
Toutes les étapes en utilisant 32 P ATP devrait prendre pdentelles dans les zones de rayonnement désigné.
Des équipements de protection individuelle doit être porté - selon la procédure d'exploitation standard dans notre laboratoire, notamment blouse, des gants et des lunettes de protection à double.
Les échantillons contenant 32 P ATP doivent être protégés contre les utilisateurs d'écrans en plexiglas de 6mm à minimiser l'exposition.
Le cas échéant, des dispositifs de surveillance personnelle doit être utilisée - au sein de l'UCL, tout utilisateur d'ouvrir certifié source de rayonnement doit avoir un film badge pour contrôler l'exposition aux radiations lors des expérimentations.
Toutes les surfaces d'expérimentation doivent être évalués pour la contamination radioactive avant et après utilisation en utilisant une Geiger comptoir.
Tous les consommables potentiellement contaminés doivent être éliminés dans le strict respect des directives institutionnelles pour l'élimination des déchets radioactifs.
- Avant de commencer essai, mis en blocs de chauffage à 30 ° C et 100 ° C respectivement
- Retirer 32 P ATP à partir congélateur à -20 (à noter que les conditions de stockage vient 32p ATP peuvent varier selon le fournisseur ou le type de radionucléides utilisés).
scan en dehors du flacon avant utilisation, décongeler derrière l'écran en plexiglas. - Avec des réactions sur la glace, ajouter 1 microlitre de 32 P ATP à chaque avec 10 uM d'ATP froid.
- Mélangez bien avec une pipette. Centrifugeuse impulsion d'apporter liquides au fond du tube, en minimisant les risques de contamination.
- Retirer aliquot 15μl pour zéro point dans le temps uneD fin de réaction dans aliquote par addition de tampon d'échantillon 5uL de 4x SDS et dénaturation à 100 ° C pendant 10 minutes. Centrifugeuse impulsion d'apporter liquides au fond du tube, en minimisant les risques de contamination.
- Échantillon restant placé dans le bloc de chauffage et incubées à 30 ° C pendant 60 minutes.
- 15μl enlevé à 60 points de temps de réaction minute et terminée par l'addition d'un tampon d'échantillon 5uL de 4x SDS et dénaturation à 100 ° C pendant 10 minutes. Centrifugeuse impulsion d'apporter liquides au fond du tube, en minimisant les risques de contamination.
3. Immunoblot les échantillons et l'analyse des résultats
- Échantillons analysés sur SDS-PAGE
- 10 ainsi gel de polyacrylamide 4-12% Bis-tris préparés pour l'électrophorèse en utilisant du tampon MOPS cours d'exécution.
- 20 pi de chaque échantillon chargé sur un gel avec 7μl de dièseséchelle de Tain protéine standard.
- Gel fonctionner à 160V pendant 90 minutes, ou jusqu'à l'avant de teinture a atteint la fin du gel. Tous les liquides en contact avec des radio-isotopes doivent être traités comme des déchets radioactifs et éliminés conformément aux directives institutionnelles. Réglementations UCL Etat que le liquide des déchets radioactifs doivent être jetés en versant le bas désignés lavabos avec eau radioactive évacuation copieuse.
- Protéines transférées à membrane de PVDF par western blot.
- Tampon de transfert préparé, 1x Tris Glycine, plus 20% de méthanol. Membrane PVDF et le papier filtre coupe pour corriger la taille de gel et activé avec du méthanol glaciaire dans le cas de la membrane ou de pré-mouillé avec du tampon de transfert dans le cas du papier filtre. La membrane doit être pré-étiquetées à l'encre de stylo à bille pour permettre l'identification de l'orientation. Gel retiré de plastIC boîtier et d'acrylamide plus retirés et éliminés comme des déchets radioactifs.
- Le gel doit être formé dans un sandwich avec la membrane et du papier filtre, assurant qu'aucune bulle existent entre la membrane et le gel, puis disposées dans l'appareil western blot avec la membrane entre le gel et l'anode.
- Transfert effectué à 25V pendant 16 heures.
- Tampon de transfert préparé, 1x Tris Glycine, plus 20% de méthanol. Membrane PVDF et le papier filtre coupe pour corriger la taille de gel et activé avec du méthanol glaciaire dans le cas de la membrane ou de pré-mouillé avec du tampon de transfert dans le cas du papier filtre. La membrane doit être pré-étiquetées à l'encre de stylo à bille pour permettre l'identification de l'orientation.
- Après le transfert de protéines pour le PVDF, la membrane doit être séché à température ambiante. Enfin, la membrane sèche doit être isolé entre deux feuilles d'acétate de cellulose et exposés soit à un écran phosphore ou un film radiographique pour permettre la détection de protéines radiomarquées. Le temps d'exposition peut fonctionner de plusieurs heures à plus d'une semaine en fonction de l'activité spécifique du radio-isotope utilisé et la cinétique enzymatique de la réaction.
- Phosphoscreen numérisés / film traité. Si vous utilisez un écran fluorescent, l'image doit être sauvegardé comme un fichier TIFF haute résolution ou un fichier bitmap, si vous utilisez du film, puis la résultante TRANsparency doivent être numérisés à l'aide d'un scanner de bureau et enregistrées au format TIFF haute résolution ou un fichier bitmap. L'image peut ensuite être analysé dans ImageJ, un programme freeware disponible sur le site Web de National Institutes of Health ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).
4. Les résultats représentatifs
La figure 1 montre des résultats représentatifs pour une analyse effectuée à l'aide de type sauvage, et G2019S LRRK2 D1994A avec la protéine de myéline de base comme substrat accepteur de phosphate génériques. Autophosphorylation de LRRK2 est visible à ≈ 200kDa, avec plusieurs bandes représentant MBP phosphorylées visibles à partir de 20-40kDa. Notez l'absence de l'autophosphorylation dans le D1994A (kinase morts) lane, et augmenté la phosphorylation due à la mutation G2019S. Notez aussi la phosphorylation de MBP résiduelle dans la voie de la kinase morts. Cela peut être dû à l'ablation incomplète de l'activité kinase de LRRK2 par le mutant D1994A ou refléter la présence of traces contaminer kinases dans la réaction.
Figure 1.
Discussion
Ce document décrit un protocole de base pour le dosage de l'activité kinase de LRRK2 en utilisant un système in vitro. Dans le souci de brièveté, ce qui a été limité à un modèle d'une heure le point final en utilisant un substrat générique, mais le protocole général est applicable à une gamme de substrats potentiels et se prêtent à des analyses plus sophistiquées examiner la cinétique de l'activité kinase de LRRK2 . Cela souligne l'un des principaux avantages d'utiliser un système in vitro pour examiner le comportement d'une protéine kinase comme celui-ci: parce qu'il ya un contrôle complet sur les concentrations de l'enzyme et le substrat, il est possible de générer des données cinétiques et de calculer K m et V les valeurs max de la réaction. Pour de plus amples évaluations détaillées cinétique ou d'évaluer l'impact des inhibiteurs putatifs, un système de débit plus élevé (tel que celui fourni en utilisant le substrat LRRKtide, disponible chez Invitrogen) est un supérieur alternative à l'approche décrite ici.
Il est important, cependant, de reconnaître que le système modèle réductionniste fournies par des essais de kinase in vitro n'est qu'un outil permettant d'examiner la biologie de la kinase et de ses relations avec les substrats potentiels. Les données provenant de tests comme celui-ci devrait être utilisé en conjonction avec d'autres approches pour obtenir une image complète de la façon dont se comporte une kinase in vitro et dans un contexte cellulaire. Par exemple, un substrat putatif phosphorylée in vitro peuvent être analysés par spectrométrie de masse pour identifier phosphosites possibles qui peuvent ensuite être manipulées par mutagenèse ciblée (par ex. Sérine ou thréonine convertissant des résidus accepteur de phosphate à aucun phosphorylable résidus tels que l'alanine) pour examiner le fonctionnement conséquences de la phosphorylation ex vivo.
Une considération clé dans l'interprétation des données d'un système de test in vitro, comme cela est probable d'eitheR type I ou II (faux positif ou faux négatif) des erreurs. Le caractère réductionniste de ce système dispose malheureusement il à la fois - dans le cas de l'ancien, ayant un substrat purifiés putative kinase et purifié à proximité artificiellement étroite et à forte concentration (par rapport au milieu cellulaire) peuvent entraîner des événements de phosphorylation artéfactuelle. Inversement, de nombreuses kinases fonctionner comme partie d'un complexe dans le contexte de la cellule, et nécessitent des co-facteurs de la phosphorylation d'un substrat donné de se produire. Comme indiqué précédemment, un résultat positif de la phosphorylation d'un substrat putatif utilisant un système de dosage in vitro doivent ensuite être testés dans un système cellulaire pour valider le résultat, et un résultat négatif doit être interprété avec prudence.
Dans cette optique, il est essentiel, si possible d'avoir des contrôles positifs et négatifs afin de permettre une étude comparative de l'activité kinase de votre intérêt. Une sélection rigoureuse d'un contro positifsL qui a une activité connue vers votre protéine d'intérêt, avec un contrôle négatif qui est peu probable de phosphoryler votre substrat putatif, est extrêmement précieux. Un candidat pour le contrôle LRRK2 est un récepteur kinase interagissant 3, qui a une séquence étroitement liés aux primaires du domaine kinase de LRRK2 mais a une structure très différente de domaine global 18. Ceci est disponible en tant que protéine recombinante chez Invitrogen et est utilisé comme un contrôle standard dans notre laboratoire.
Il convient également de noter que le formulaire disponible dans le commerce de la LRRK2 manque la N-terminale de la protéine et est étiqueté avec la glutathion-S-transférase et cela devrait être pris en considération comme un facteur potentiel de confusion lors de la réalisation des essais avec cette protéine kinase, comme on ne sait pas quel rôle la N-terminale de LRRK2 pourraient jouer dans la fonction normale de cette protéine. Si, par exemple, la partie N-terminale de LRRK2 qui est absente dans la protéine utilisée dans le présent protocoleIl est essentiel pour le recrutement d'un substrat spécifique au domaine kinase de LRRK2 alors cela aura un impact majeur sur la phosphorylation observée de ce substrat dans le système in vitro décrit ci-dessus.
Même avec ces réserves, cependant, l'importance attachée à la biologie de LRRK2 dans la recherche de Parkinson souligne l'utilité de ce protocole comme un outil précieux pour étudier le comportement de cette protéine dans une dans la mise en vitro.
Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
L'auteur est un de Parkinson britannique Research Fellow (bourse F1002). Ce travail a été soutenu en partie par le Wellcome Trust / MRC Appel conjoint dans l'attribution neurodégénérescence (WT089698) au Consortium la maladie de Parkinson du Royaume-Uni (UKPDC) dont les membres proviennent de l'Institut UCL de la neurologie, de l'Université de Sheffield et l'unité MRC Protein Phosphorylation au l'Université de Dundee.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LRRK2 wild type | Invitrogen | PV4873 | |
| LRRK2 G2019S | Invitrogen | PV4881 | |
| LRRK2 D1994A | Invitrogen | PV6051 | |
| Kinase buffer | Cell Signaling Technology | 9802S | |
| MBP | Sigma-Aldrich | M1891 | |
| 32P g ATP | PerkinElmer, Inc. | BLU002X500UC | 500μCi, 30Ci /mMole |
| 4x LDS sample buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| 2-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Protein standards | Invitrogen | LC5800 | |
| MOPS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| Bis-tris acrylamide gel | Invitrogen | NP0321 | 4-12% 1mm 10well |
| PVDF membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | |
| Transfer buffer | Invitrogen | NP0006 | |
| Table 1. Reagents | |||
| Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps | |||
| Geiger counter | Mini Instruments | ||
| SDS PAGE tank | Invitrogen | ||
| Transfer tank | Invitrogen | ||
| Heat blocks (2) | Eppendorf | ||
| Phosphor screen | GE Healthcare | X-ray film can be substituted | |
| Phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Exposure cassette | GE Healthcare | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Perspex shielding | |||
| 1.5ml tubes | VWR international | Screw top with O ring | |
| Table 2. Equipment | |||
References
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