Summary
Leucin rich repeat kinase 2 ist ein großes Multidomain-Kinase, Mutationen, bei denen sind die häufigste genetische Ursache der Parkinson-Krankheit. Die Analyse der Kinase-Aktivität dieses Proteins hat sich als wichtiges Instrument für das Verständnis der Biologie und Dysfunktion des Proteins werden. In diesem Papier,
Abstract
Leucin rich repeat kinase 2 (LRRK2) ist ein 2527 Aminosäure Mitglied der ROCO Familie von Proteinen, die über eine komplexe, Multidomain Struktur mit einem GTPase-Domäne (genannt ROC, für Ras komplexer Proteine) und eine Kinase-Domäne 1. Die Entdeckung im Jahr 2004 von Mutationen in LRRK2, dass die Parkinson-Krankheit (PD) führen führte LRRK2 wird im Mittelpunkt einer riesigen Menge von Forschung in seine normale Funktion und wie das Protein schief geht in der Krankheitszustand 2,3. Erste Untersuchungen in der Funktion des LRRK2 Schwerpunkt auf ihre enzymatische Aktivitäten 4-6. Obwohl ein klares Bild ist noch von einer konsistenten Änderung dieser durch Mutationen entstehen, hat Daten aus einer Anzahl von Gruppen die Bedeutung der Kinase-Aktivität von LRRK2 in den Zelltod in Verbindung mit Mutationen 7,8 hervorgehoben. Neuere Veröffentlichungen haben Inhibitoren gezielt die Kinaseaktivität von LRRK2 und bietet eine zentrale experimentelle Tool 9-11 gemeldet. In Anbetracht dieser Daten ist esist wahrscheinlich, dass die enzymatische Eigenschaften LRRK2 uns leisten einen wichtigen Einblick in die Biologie dieses Proteins, obwohl, ob sie mögliche Angriffspunkte für die Parkinson-sind, sei dahingestellt.
Eine Reihe unterschiedlicher Ansätze wurden verwendet, um Tests der Kinase-Aktivität von LRRK2. Zunächst wurden Tests unter Verwendung von Epitop markierte Protein in Säugetier-Zelllinien überexprimiert durchgeführt und immunpräzipitiert, mit dem Tests durchgeführt mit diesem Protein auf Agaroseperlen 4,5,7 immobilisiert. Anschließend haben gereinigten rekombinanten Fragmente LRRK2 in Lösung auch verwendet worden, zum Beispiel ein GST getaggt Fragment aus Insektenzellen, die Rückstände von 970 bis 2527 von LRRK2 12 gereinigt. In jüngster Zeit Daniels et al. Die Isolierung der vollen Länge LRRK2 in Lösung aus menschlichen embryonalen Nierenzellen berichtet, jedoch dieses Proteins ist nicht allgemein zugänglich 13. Im Gegensatz dazu abgeschnitten dem GST-Fusionsprotein Form LRRK2 ist kommerziell verfügbe (von Invitrogen, siehe Tabelle 1 für weitere Details), und bietet ein komfortables Werkzeug für den Nachweis eines Assays für LRRK2 Kinase-Aktivität. Mehrere verschiedene Ausgänge für LRRK2 Kinase-Aktivität berichtet worden. Autophosphorylierung LRRK2 selbst, die Phosphorylierung von Myelin Basic Protein (MBP) als generische Kinase-Substrat und die Phosphorylierung von einem künstlichen Substrat - genannt LRRKtide, auf die Phosphorylierung von Threonin 558 in Moesin Basis - alle wurden verwendet, da eine Reihe von vermeintlichen physiologischen Substrate einschließlich α-Synuclein, Moesin und 4-EBP 14-17. Der Status dieser Proteine als Substrate für LRRK2 bleibt unklar, und als solche den unten beschriebenen Protokoll wird zur Verwendung von MBP als generisches Substrat, in Anbetracht der Nützlichkeit dieses System Assay LRRK2 Kinase-Aktivität gegen eine Reihe von möglichen Substraten gerichtet konzentrieren.
Protocol
Sicherheit
Die unten beschriebenen Protokoll nutzt ATP mit radioaktivem 32 P an der γ-Phosphat Lage, die Kinase-Aktivität von LRRK2 folgen beschriftet. Es basiert auf dem Standard-Protokolle in unserem Labor verwendeten, und so in Bezug auf viele der Schritte in dem Prozess wie Laufen die Gele, Western-Blot et cetera die Materialien und genauen Bedingungen sollten als Richtschnur der Ausrüstung und Protokollen getroffen werden verwendet für diese Prozesse ist von Labor zu Labor. Verbindungen, die Isotope, die ionisierende Strahlung aussenden, sind potenziell schädlich für die menschliche Gesundheit und strengen Genehmigungs-und Vorschriften auf institutioneller und nationaler Ebene Kontrolle ihrer Verwendung. Die Experimente in diesem Protokoll wurden folgende Schulungen in Open-Source-Strahlung verwenden am University College London und nach der guten Laborpraxis Richtlinien der Sicherheit Dienstleistungen an der Hochschule zur Verfügung gestellt durchgeführt (Richtlinien available bei http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf ). Einsatz von Open-Source-Strahlung sollte nicht vor der entsprechenden Ausbildung und Zulassung angestrebt werden. Die Regulierungsbehörde für Open-Source-Strahlung in der Laborforschung variiert von Land zu Land. Beispiele hierfür sind: in Großbritannien, der Health and Safety Executive ( http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm (), in den Vereinigten Staaten der Nuclear Regulatory Commission http:// www.nrc.gov / Materialien / miau / regs-guides-comm.html ), in Kanada die kanadische Kommission für nukleare Sicherheit ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ) und in Deutschland Das Bundesamt für Strahlenschutz ( http : / / www.bfs.de / de / bfs ). Benutzer in anderen Ländern sollten die lokalen Regeln, Vorschriften und Genehmigungsbehörden mit ihren Strahlenschutzbeauftragten zu bestätigen. Sicherheitsvorkehrungen in bezug auf dieses Protokoll wurden in den Text festgestellt worden ist, markiert mit dem radioaktiven Kleeblatt-Symbol ( 
).
1. Vorbereitung der Kinase-Reaktionen
Alle Reaktionsansätze in 1,5 ml Probenröhrchen mit Schraubverschluss mit O-Ring, um zu verhindern Ausbreitung von Radioaktivität vorbereitet.
- Thaw Protein auf Eis - LRRK2 Wildtyp, D1994A, G2019S.
- Make-up Reaktion auf Eis - 10nm LRRK2, 0.5μg/μl MBP, 5UL von 10x Kinase-Puffer, aus bis zu 50 ul mit Wasser.
2. Das Ausführen des Tests
Alle Schritte nutzen 32 P ATP sollte pSpitzen in bestimmten Bereichen Strahlung.
Geeignete persönliche Schutzausrüstung getragen werden - unter standard operating procedure in unserem Labor dazu gehören Kittel, Doppel-Handschuhe und Schutzbrille tragen.
Proben mit 32 P ATP sollten von den Nutzern von 6mm Plexiglas-Bildschirme abgeschirmt werden, um die Exposition zu minimieren.
Gegebenenfalls persönlichen Überwachungsgeräte verwendet werden sollte - innerhalb von UCL, muss jede zertifizierte Open-Source-Strahlung Benutzer eine Filmplakette die Strahlenbelastung während der Experimente zu überwachen.
Alle experimentellen Oberflächen sollten für radioaktive Kontamination vor und nach Gebrauch mit einem Gei beurteilt werdenger Zähler.
Alle potenziell kontaminierte Verbrauchsmaterialien sollte streng nach den Richtlinien des Instituts für Entsorgung radioaktiver Abfälle entsorgt werden.
- Vor Beginn Assay gesetzt Heizblöcke bis 30 ° C und 100 ° C bzw.
- Entfernen 32 P ATP von -20 Gefrierschrank (beachten Sie, dass Lagerbedingungen fro 32 P ATP kann je nach Anbieter oder die Art der Radionukleotide verwendet).
Scan außerhalb der Behälter vor dem Gebrauch auftauen hinter Plexiglas Bildschirm. - Mit Reaktionen auf Eis, fügen 1μl von 32 P ATP zu jedem zusammen mit 10 um der Kälte ATP.
- Gut mischen mit Pipette. Pulszentrifugieren zu bringen Flüssigkeit Boden des Röhrchens, minimiert Risiko der Kontamination.
- Entfernen Sie 15μl Aliquot für den Zeitpunkt Null Punkt eind kündigen Reaktion in aliquoten durch Zugabe von 5μl von 4x SDS-Probenpuffer und Denaturierung bei 100 ° C für 10 Minuten. Pulszentrifugieren zu bringen Flüssigkeit Boden des Röhrchens, minimiert Risiko der Kontamination.
- Verbleibende Probe in Heizblock gestellt und bei 30 ° C für 60 Minuten.
- 15μl bei 60 Minuten-Zeitpunkt und die Reaktion durch Zugabe von 5μl von 4x SDS-Probenpuffer und Denaturierung bei 100 beendet ° C für 10 Minuten entfernt. Pulszentrifugieren zu bringen Flüssigkeit Boden des Röhrchens, minimiert Risiko der Kontamination.
3. Immunoblotting der Proben und die Analyse der Ergebnisse
- Proben auf SDS-PAGE laufen
- 10 gut 4-12% Bis-Tris polyacrilamide Gel für die Elektrophorese mit MOPS Laufpuffer vorbereitet.
- 20 &mgr; l jeder Probe auf das Gel zusammen mit 7μl von Sharps geladenTain-Protein-Standard-Leiter.
- Gel bei 160V für 90 Minuten laufen oder bis Farbstofffront hat das Ende des Gels erreicht. Alle Flüssigkeit in Kontakt mit Radioisotopen sollte als radioaktiver Abfall behandelt und entsorgt werden gemäß den Richtlinien des Instituts. UCL Vorschriften besagen, dass flüssige radioaktive Abfälle durch Strömen bezeichnet radioaktive Entsorgung sinkt mit viel Wasser muss entsorgt werden.
- Protein übertragen PVDF-Membran über Western-Blot.
- Transfer-Puffer, 1x Tris Glycin plus 20% Methanol. PVDF-Membran und Filterpapier auf Maß geschnitten für Gel richtig und aktiviert mit glazialen Methanol im Fall der Membran oder pre-nass mit Transfer-Puffer im Falle des Filterpapiers. Die Membran sollte mit Kugelschreiber pre-gekennzeichnet sein, um die Identifizierung der Orientierung zu ermöglichen. Gel aus plast entferntic Gehäuse und mehr Acrylamid entfernt und entsorgt als radioaktiver Abfall.
- Das Gel sollte in ein Sandwich mit der Membran und Filterpapier gebildet werden, so dass keine Luftblasen zwischen Membran und Gel bestehen, und dann in der Western-Blot-Apparatur mit der Membran zwischen dem Gel und der Anode angeordnet.
- Transfer durchgeführt bei 25V für 16 Stunden.
- Transfer-Puffer, 1x Tris Glycin plus 20% Methanol. PVDF-Membran und Filterpapier auf Maß geschnitten für Gel richtig und aktiviert mit glazialen Methanol im Fall der Membran oder pre-nass mit Transfer-Puffer im Falle des Filterpapiers. Die Membran sollte mit Kugelschreiber pre-gekennzeichnet sein, um die Identifizierung der Orientierung zu ermöglichen.
- Nach Proteintransfer auf PVDF, sollte die Membran bei Raumtemperatur getrocknet werden. Schließlich sollte der trockenen Membran zwischen Celluloseacetat Blatt isoliert und ausgesetzt, um entweder einen Leuchtschirm oder x-ray-Film um den Nachweis von radioaktiv markiertem Protein ermöglichen. Belichtungszeit kann von einigen Stunden zu laufen mehr als einer Woche in Abhängigkeit von der spezifischen Aktivität der Radioisotopen verwendet und das Enzym Kinetik der Reaktion.
- Phosphoscreen gescannt / Film verarbeitet. Wenn Sie einen Leuchtschirm, sollte das Bild als hochauflösende TIFF-oder Bitmap-Datei gespeichert werden, wenn mit Film dann die resultierende transparency sollte gescannt mit einem Desktop-Scanner und gespeichert werden als hochauflösende TIFF oder Bitmap-Datei. Das Bild kann dann in ImageJ, ein Freeware-Programm finden Sie auf der National Institutes of Health Website (analysiert werden http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).
4. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt repräsentative Ergebnisse für einen Assay durchgeführt unter Verwendung von Wildtyp, G2019S und D1994A LRRK2 mit Myelin Basic Protein als generisches Phosphat Acceptorsubstrat. Autophosphorylierung LRRK2 sichtbar ist bei ≈ 200 kDa, mit mehreren Bands vertreten phosphorylierten MBP sichtbar von 20-40kDa. Beachten Sie das Fehlen von Autophosphorylierung in der D1994A (kinase dead) lane, und erhöhte Phosphorylierung durch die G2019S Mutation. Beachten Sie auch Rest-Phosphorylierung von MBP in der Kinase-tote Spur. Dies kann aufgrund von unvollständigen Ablation der Kinase-Aktivität von LRRK2 durch die D1994A-Mutante oder reflektieren die Gegenwart of Spur kontaminierender Kinasen in der Reaktion.
Abbildung 1.
Discussion
Dieses Papier beschreibt eine grundlegende Protokoll zur Bestimmung der Kinase-Aktivität von LRRK2 mit einem in vitro-System. Im Interesse der Kürze hat dies zu einer einstündigen Endpunkt Vorlage mit einem generischen Substrat beschränkt, sondern dem allgemeinen Protokoll gilt für eine Reihe von möglichen Substraten und zugänglich anspruchsvollere Analysen Untersuchung der Kinetik der Kinase-Aktivität von LRRK2 . Dies unterstreicht eine der wichtigsten Vorteile der Verwendung eines in vitro Systems an die Kinase Verhalten eines Proteins, wie diese zu untersuchen: denn es gibt die volle Kontrolle über die Konzentrationen der Enzym und Substrat, ist es möglich, kinetische Daten zu generieren und zu berechnen K m und V max-Werte für die Reaktion. Für weitere detaillierte kinetische Auswertungen oder Bewertung der Auswirkungen der vermeintlichen Hemmer, ist ein höherer Durchsatz-System (wie z. B., dass durch die LRRKtide Substrat, erhältlich von Invitrogen bot) eine überlegene Alternatibereits in dem hier beschriebenen Ansatz.
Es ist jedoch wichtig, zu erkennen, dass die reduktionistische Modell-System zur Verfügung gestellt durch in vitro Kinase-Assays ist nur ein Werkzeug, um die Biologie von einer Kinase und seine Beziehungen zu potenziellen Substraten zu untersuchen. Daten aus Untersuchungen, wie diese sollte in Verbindung mit anderen Ansätzen verwendet werden, um ein umfassendes Bild davon, wie eine Kinase verhält sich in vitro und im zellulären Kontext zu gewinnen. Zum Beispiel kann ein mutmaßliches Substrat in vitro phosphoryliert durch Massenspektrometrie analysiert werden, um mögliche phosphosites, die dann durch gezielte Mutagenese (z. B.. Umwandlung von Serin oder Threonin-Phosphat-Akzeptor Rückstände none-phosphorylierbaren Rückstände wie Alanin) manipuliert werden können, um die funktionale untersuchen zu identifizieren Folgen der Phosphorylierung ex vivo.
Ein entscheidendes Kriterium bei der Interpretation von Daten aus einem in-vitro-Assay-System wie diesem ist die Wahrscheinlichkeit von either Typ I oder Typ II (false positive oder falsch-negativen) Fehler. Die reduktionistische Natur dieses System leider verfügt es sowohl - im Fall des ehemaligen, mit einem gereinigten putative Substrat und gereinigt Kinase in künstlich unmittelbarer Nähe und in hoher Konzentration (im Vergleich zu den zellulären Milieu) können in artifizielle Phosphorylierung Ereignissen führen. Umgekehrt funktionieren viele Kinasen als Teil eines komplexen im Rahmen der Zelle, und benötigen Co-Faktoren für die Phosphorylierung von einem gegebenen Substrat auftreten. Wie oben erwähnt, mit einem positiven Ergebnis von Phosphorylierung eines vermeintlichen Substrat ein in vitro Testsystem sollte dann in einem zellulären System getestet werden, um das Ergebnis zu validieren, und ein negatives Ergebnis sollte mit Vorsicht interpretiert werden.
Vor diesem Hintergrund ist es entscheidend, wo möglich, sowohl positive als auch negative Kontrollen müssen eine vergleichende Studie über die Tätigkeit der Kinase von Interesse erlauben. Sorgfältige Auswahl einer positiven control dass ein bekannter Aktivität gegenüber dem Protein von Interesse ist, zusammen mit einer Negativ-Kontrolle, die unwahrscheinlich, dass vermeintliche Substrat phosphoryliert wird, ist äußerst wertvoll. Ein Kandidat Steuerung für LRRK2 ist Rezeptor interagiert Kinase 3, die eine eng verwandte primäre Sequenz der Kinase-Domäne des LRRK2 hat aber eine ganz andere gesamten Domain-Struktur 18. Dies ist als rekombinantes Protein von Invitrogen und wird als Standard-Steuerung in unserem Labor verwendet.
Es sollte auch darauf hingewiesen, dass die kommerziell erhältliche Form von LRRK2 der N-Terminus des Proteins fehlt und ist mit Glutathion-S-transferase und dies sollte in Betracht als potenzieller Störfaktor gezogen werden, wenn die Durchführung Kinase-Assays mit diesem Protein markiert werden, da nicht bekannt ist, welche Rolle der N-terminal von LRRK2 kann in die normale Funktion dieses Proteins zu spielen. Wenn zum Beispiel der N-terminalen Teil des LRRK2, dass fehlt in dem Protein im Sinne dieses Protokollsist entscheidend für die Einstellung eines bestimmten Substrat der Kinase-Domäne des LRRK2 dann wird dies einen großen Einfluss auf die beobachteten Phosphorylierung haben das Substrat in der in vitro-System beschrieben.
Selbst mit diesen Einschränkungen jedoch unterstreicht die Bedeutung, die Biologie der LRRK2 in der Parkinson-Forschung den Nutzen dieses Protokolls als ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung des Verhaltens dieses Proteins in einem in vitro-Einstellung.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Der Autor ist ein Parkinson-UK Research Fellow (grant F1002). Diese Arbeit wurde zum Teil durch den Wellcome Trust / MRC Joint Call in Neurodegeneration award (WT089698) nach Großbritannien Parkinson Consortium (UKPDC), deren Mitglieder von der UCL Institute of Neurology, der University of Sheffield und der MRC Protein-Phosphorylierung Unit unterstützt der University of Dundee.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LRRK2 wild type | Invitrogen | PV4873 | |
| LRRK2 G2019S | Invitrogen | PV4881 | |
| LRRK2 D1994A | Invitrogen | PV6051 | |
| Kinase buffer | Cell Signaling Technology | 9802S | |
| MBP | Sigma-Aldrich | M1891 | |
| 32P g ATP | PerkinElmer, Inc. | BLU002X500UC | 500μCi, 30Ci /mMole |
| 4x LDS sample buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| 2-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Protein standards | Invitrogen | LC5800 | |
| MOPS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| Bis-tris acrylamide gel | Invitrogen | NP0321 | 4-12% 1mm 10well |
| PVDF membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | |
| Transfer buffer | Invitrogen | NP0006 | |
| Table 1. Reagents | |||
| Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps | |||
| Geiger counter | Mini Instruments | ||
| SDS PAGE tank | Invitrogen | ||
| Transfer tank | Invitrogen | ||
| Heat blocks (2) | Eppendorf | ||
| Phosphor screen | GE Healthcare | X-ray film can be substituted | |
| Phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Exposure cassette | GE Healthcare | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Perspex shielding | |||
| 1.5ml tubes | VWR international | Screw top with O ring | |
| Table 2. Equipment | |||
References
- Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol. Cell. 101, 183-191 (2009).
- Paisan-Ruiz, C. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44, 595-600 (2004).
- Zimprich, A. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44, 601-607 (2004).
- West, A. B. Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 16842-16847 (2005).
- Gloeckner, C. J. The Parkinson disease causing LRRK2 mutation I2020T is associated with increased kinase activity. Hum. Mol. Genet. 15, 223-232 (2006).
- Lewis, P. A. The R1441C mutation of LRRK2 disrupts GTP hydrolysis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 668-671 (2007).
- Greggio, E. Kinase activity is required for the toxic effects of mutant LRRK2/dardarin. Neurobiol. Dis. 23, 329-341 (2006).
- Smith, W. W. Kinase activity of mutant LRRK2 mediates neuronal toxicity. Nat. Neurosci. 9, 1231-1233 (2006).
- Deng, X. Characterization of a selective inhibitor of the Parkinson's disease kinase LRRK2. Nat. Chem. Biol. 7, 203-205 (2011).
- Lee, B. D. Inhibitors of leucine-rich repeat kinase-2 protect against models of Parkinson's disease. Nat. Med. 16, 998-1000 (2010).
- Nichols, R. J. Substrate specificity and inhibitors of LRRK2, a protein kinase mutated in Parkinson's disease. The Biochemical Journal. 424, 47-60 (2009).
- Anand, V. S. Investigation of leucine-rich repeat kinase 2: enzymological properties and novel assays. FEBS. J. 276, 466-478 (2009).
- Daniels, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. Journal of Neurochemistry. 116, 304-315 (2011).
- Jaleel, M. LRRK2 phosphorylates moesin at Thr558; characterisation of how Parkinson's disease mutants affect kinase activity. Biochem. J. , (2007).
- Qing, H., Wong, W., McGeer, E. G., McGeer, P. L. Lrrk2 phosphorylates alpha synuclein at serine 129: Parkinson disease implications. Biochem. Biophys. Res. Commun. 387, 149-152 (2009).
- Imai, Y. Phosphorylation of 4E-BP by LRRK2 affects the maintenance of dopaminergic neurons in Drosophila. Embo. J. 27, 2432-2443 (2008).
- Greggio, E. The Parkinson disease-associated leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) is a dimer that undergoes intramolecular autophosphorylation. J. Biol. Chem. 283, 16906-16914 (2008).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science. 298, 1912-1934 (2002).
