Summary
Leucine रिच दोहराएँ kinase 2 बड़े multidomain kinase है, परिवर्तन में जो सबसे आम पार्किंसंस रोग के आनुवंशिक कारण हैं. इस प्रोटीन kinase गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए जीव विज्ञान और इस प्रोटीन की शिथिलता को समझने में एक महत्वपूर्ण उपकरण साबित हो गया है. इस कागज में,
Protocol
सुरक्षा
नीचे वर्णित प्रोटोकॉल का इस्तेमाल एटीपी γ फॉस्फेट LRRK2 के kinase गतिविधि का पालन करने की स्थिति में रेडियोधर्मी पी 32 के साथ लेबल. यह हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता मानक प्रोटोकॉल पर आधारित है, और तो जैल चल रहा है जैसे प्रक्रिया में चरणों के कई संबंध के साथ, पश्चिमी सोख्ता वगैरह सामग्री और सटीक शर्तों उपकरणों और प्रोटोकॉल के रूप में एक गाइड के रूप में लिया होना चाहिए इन प्रक्रियाओं के लिए इस्तेमाल प्रयोगशाला से प्रयोगशाला को बदलता है. आइसोटोप है कि विकिरण ionizing फेंकना युक्त यौगिकों के संभावित मानव स्वास्थ्य और सख्त और एक संस्थागत और राष्ट्रीय स्तर पर नियंत्रण उनके उपयोग में लाइसेंस नियमों के लिए हानिकारक हैं. इस प्रोटोकॉल में प्रयोग खुला स्रोत विकिरण का उपयोग में यूनिवर्सिटी कॉलेज लंदन में प्रशिक्षण के बाद और अच्छी प्रयोगशाला अभ्यास कॉलेज में सुरक्षा सेवाओं द्वारा प्रदान की दिशा निर्देशों का पालन किए गए (दिशानिर्देशों Avaपर ilable http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf ). खुला स्रोत विकिरण का प्रयोग उचित प्रशिक्षण और विनियामक अनुमोदन करने से पहले प्रयास नहीं करना चाहिए. विनियामक अनुसंधान प्रयोगशाला में खुला स्रोत विकिरण के लिए जिम्मेदार शरीर देश देश से भिन्न होता है. इन के उदाहरण हैं: यूनाइटेड किंगडम में, स्वास्थ्य और सुरक्षा (कार्यकारी http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm ) संयुक्त राज्य अमेरिका में, परमाणु नियामक आयोग ( http:// www.nrc.gov / सामग्री / miau / regs गाइड - comm.html ), कनाडा परमाणु सुरक्षा (आयोग http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ कनाडा में ), और जर्मनी दास Bundesamt फर Strahlenschutz में ( http : / www.bfs.de / / डी / वित्तीय पर्यवेक्षण बोर्ड ). अन्य देशों में उपयोगकर्ताओं को उनके विकिरण सुरक्षा अधिकारी के साथ स्थानीय नियमों, विनियमों और लाइसेंस के अधिकारियों की पुष्टि करना चाहिए. इस प्रोटोकॉल के लिए प्रासंगिक सुरक्षा सावधानियों पाठ में उल्लेख किया गया है, रेडियोधर्मी तिपतिया (प्रतीक के साथ प्रकाश डाला 
).
1. Kinase प्रतिक्रियाओं की तैयारी
सभी प्रतिक्रिया मिश्रण 1.5ml नमूना ट्यूबों में पेंच को रोकने के लिए एक हे अंगूठी रेडियोधर्मिता का प्रसार युक्त टोपियां के साथ तैयार हैं.
- पर बर्फ पिघलना प्रोटीन - LRRK2 जंगली प्रकार, D1994A, G2019S.
- 10nm LRRK2, 0.5μg/μl MBP, 10x kinase बफर के 5ul 50μl के लिए पानी के साथ बनाया - बर्फ पर प्रतिक्रिया करना.
2. परख रनिंग
सभी चरणों का उपयोग 32 पी एटीपी पी लेना चाहिएनामित विकिरण क्षेत्रों में फीता.
हमारी प्रयोगशाला में मानक संचालन प्रक्रिया के तहत इन प्रयोगशाला कोट, डबल दस्ताने और सुरक्षात्मक चश्मे में शामिल हैं - उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों पहना होना चाहिए.
32 पी एटीपी युक्त नमूने 6mm Perspex स्क्रीन के द्वारा उपयोगकर्ताओं से परिरक्षित लिए जोखिम को कम किया जाना चाहिए .
जहाँ लागू हो, व्यक्तिगत निगरानी उपकरणों के इस्तेमाल किया जाना चाहिए - UCL के भीतर है, किसी भी प्रमाणित खुला स्रोत विकिरण उपयोगकर्ता एक फिल्म बैज प्रयोगों के दौरान विकिरण जोखिम की निगरानी करना चाहिए.
सभी प्रयोगात्मक सतहों से पहले और बाद में एक GEI का उपयोग उपयोग रेडियोधर्मी संदूषण के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिएप्रासंगिकता काउंटर.
रेडियोधर्मी कचरे के निपटान के लिए संस्थागत दिशा निर्देशों के सख्त पालन में सभी संभावित दूषित उपभोग्य का निपटारा किया जाना चाहिए.
- पहले परख शुरू, 30 डिग्री सेल्सियस 100 और डिग्री सेल्सियस क्रमशः हीटिंग ब्लॉक सेट
- -20 फ्रीजर (कृपया ध्यान दें कि भंडारण की स्थिति fro 32 पी एटीपी आपूर्तिकर्ता या प्रयोग किया जाता radionucleotides के प्रकार पर निर्भर करते हुए भिन्न हो सकते हैं) से 32 पी एटीपी निकालें.
कंटेनर के बाहर पूर्व स्कैन का उपयोग करने के लिए कड़ा परदे के पीछे पिघलना. - बर्फ पर प्रतिक्रियाओं के साथ, ठंड एटीपी के 10μM के साथ प्रत्येक के लिए 32 पी एटीपी के 1μl जोड़ने .
- विंदुक के साथ अच्छी तरह मिक्स. पल्स अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे करने के लिए तरल लाने के लिए, संदूषण का जोखिम कम से कम है.
- शून्य समय बिंदु के लिए एक 15μl विभाज्य निकालेंघ 5μl 4x एसडीएस नमूना बफर और विकृतीकरण के अलावा द्वारा विभाज्य में 100 डिग्री प्रतिक्रिया सी 10 मिनट के लिए समाप्त. पल्स अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे करने के लिए तरल लाने के लिए, संदूषण का जोखिम कम से कम है.
- शेष नमूना हीटिंग ब्लॉक में रखा गया और 60 मिनट के लिए 30 ° C पर incubated.
- 15μl 10 मिनट के लिए 60 मिनट के समय बिंदु और प्रतिक्रिया 5μl 4x एसडीएस नमूना बफर और विकृतीकरण के अलावा द्वारा 100 पर समाप्त ° C पर हटा दिया. पल्स अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे करने के लिए तरल लाने के लिए, संदूषण का जोखिम कम से कम है.
3. नमूने Immunoblotting और परिणामों का विश्लेषण
- नमूने एसडीएस पृष्ठ पर चलाने के
- 10 अच्छी तरह से 4-12% polyacrilamide बीआईएस - tris जेल MOPS चल बफर का उपयोग वैद्युतकणसंचलन के लिए तैयार है.
- प्रत्येक नमूना के 20μl 7μl sharps के साथ जेल पर लादाटाइन प्रोटीन मानक सीढ़ी.
- जेल 160v में 90 मिनट के लिए चलाते हैं, या जब तक डाई सामने जेल के अंत तक पहुँच गया है. Radioisotopes के साथ संपर्क में सभी तरल रेडियोधर्मी कचरे के रूप में व्यवहार किया जाना चाहिए और के रूप में प्रति संस्थागत दिशानिर्देशों का निपटारा है. UCL नियमों राज्य है कि तरल रेडियोधर्मी कचरे के नीचे प्रचुर पानी के साथ नामित रेडियोधर्मी निपटान डूब गिरने से त्याग किया जाना चाहिए.
- प्रोटीन PVDF झिल्ली के माध्यम से पश्चिमी दाग को हस्तांतरित.
- स्थानांतरण बफर तैयार 1x Tris Glycine से अधिक 20% मेथनॉल. PVDF झिल्ली और फिल्टर पेपर के लिए जेल के लिए आकार सही कटौती और झिल्ली या पूर्व फिल्टर पेपर के मामले में स्थानांतरण बफर के साथ गीला के मामले में हिमनदों मेथनॉल के साथ सक्रिय है. झिल्ली ballpoint स्याही के साथ किया जाना चाहिए पूर्व लेबल अभिविन्यास की पहचान की अनुमति है. जेल plast से हटायाआईसी आवरण और अतिरिक्त acrylamide हटा दिया है और निपटारा रेडियोधर्मी कचरे के रूप में.
- जेल झिल्ली और फिल्टर पेपर के साथ एक सैंडविच में गठित किया जाना चाहिए, यह सुनिश्चित करने कि कोई बुलबुले झिल्ली और जेल के बीच मौजूद है, और फिर जेल और anode के बीच झिल्ली के साथ पश्चिमी धब्बा तंत्र व्यवस्था में.
- स्थानांतरण 25V बाहर 16 घंटे के लिए किया जाता है.
- स्थानांतरण बफर तैयार 1x Tris Glycine से अधिक 20% मेथनॉल. PVDF झिल्ली और फिल्टर पेपर के लिए जेल के लिए आकार सही कटौती और झिल्ली या पूर्व फिल्टर पेपर के मामले में स्थानांतरण बफर के साथ गीला के मामले में हिमनदों मेथनॉल के साथ सक्रिय है. झिल्ली ballpoint स्याही के साथ किया जाना चाहिए पूर्व लेबल अभिविन्यास की पहचान की अनुमति है.
- PVDF के लिए प्रोटीन हस्तांतरण के बाद, झिल्ली कमरे के तापमान पर सूख जाना चाहिए. अंत में, सूखी झिल्ली सेलूलोज़ एसीटेट चादरें के बीच अलग किया जाना चाहिए और या तो एक फॉस्फर स्क्रीन या एक्स - रे फिल्म radiolabelled प्रोटीन का पता लगाने की अनुमति को उजागर. एक्सपोज़र समय से कई घंटे एक सप्ताह से अधिक इस्तेमाल किया रेडियो आइसोटोप और प्रतिक्रिया के एंजाइम कैनेटीक्स की विशिष्ट गतिविधि पर निर्भर करता है चला सकते हैं.
- Phosphoscreen स्कैन फिल्म / संसाधित. एक फॉस्फर स्क्रीन का उपयोग कर यदि छवि एक उच्च संकल्प झगड़ा या बिटमैप फ़ाइल के रूप में सहेजा जाना चाहिए, अगर फिल्म का उपयोग तो परिणामी ट्रॅनsparency एक डेस्कटॉप स्कैनर का उपयोग कर स्कैन किया जाना चाहिए और एक उच्च संकल्प झगड़ा या बिटमैप फ़ाइल के रूप में सहेजा है. छवि तो ImageJ, एक फ्रीवेयर स्वास्थ्य वेबसाइट के राष्ट्रीय संस्थानों (पर उपलब्ध प्रोग्राम में विश्लेषण किया जा सकता है http://rsbweb.nih.gov/ij/) .
4. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 में एक परख बाहर किया Myelin एक सामान्य फॉस्फेट स्वीकर्ता सब्सट्रेट के रूप में मूल प्रोटीन के साथ जंगली प्रकार, G2019S और D1994A LRRK2 का उपयोग करने के लिए प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है. LRRK2 के Autophosphorylation 200kDa ≈ पर दिखाई है, कई 20 40kDa से दिखाई phosphorylated MBP का प्रतिनिधित्व बैंड के साथ. D1994A लेन (kinase मृत) में autophosphorylation के अभाव पर ध्यान दें, और G2019S उत्परिवर्तन के कारण phosphorylation वृद्धि हुई है. Kinase मृत लेन में MBP भी अवशिष्ट phosphorylation नोट. यह LRRK2 के D1994A उत्परिवर्ती द्वारा kinase गतिविधि का अधूरा पृथक कारण हो सकता है या उपस्थिति ओ को प्रतिबिंबित कर सकते हैंच प्रतिक्रिया में kinases contaminating ट्रेस.
चित्रा 1.
Discussion
इस कागज LRRK2 kinase गतिविधि परख करने की क्रिया इन विट्रो प्रणाली में एक का उपयोग करने के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. संक्षिप्तता के हितों में, इस एक घंटे के एक अंत बिंदु एक सामान्य सब्सट्रेट का उपयोग कर टेम्पलेट के लिए सीमित किया गया है, लेकिन सामान्य प्रोटोकॉल क्षमता substrates के एक श्रृंखला के लिए लागू है और अधिक परिष्कृत LRRK2 kinase गतिविधि के कैनेटीक्स जांच विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी है . यह इन विट्रो प्रणाली में एक का उपयोग करने के लिए एक इस तरह के रूप प्रोटीन kinase व्यवहार की जांच की कुंजी लाभ पर प्रकाश डाला गया है: क्योंकि वहाँ एंजाइम और सब्सट्रेट की सांद्रता पर पूरा नियंत्रण है, यह संभव है गतिज डेटा उत्पन्न और कश्मीर मीटर की गणना और प्रतिक्रिया के लिए वी अधिकतम मानों. अधिक विस्तृत गतिज मूल्यांकन या ख्यात inhibitors के प्रभाव के मूल्यांकन के लिए, एक उच्च throughput सिस्टम (जैसे कि LRRKtide सब्सट्रेट, Invitrogen से उपलब्ध का उपयोग करके afforded) एक बेहतर alternati हैयहाँ वर्णित दृष्टिकोण करने के लिए कर दिया है.
यह महत्वपूर्ण है, लेकिन पहचान, कि न्यूनकारी मॉडल इन विट्रो kinase assays में द्वारा प्रदान की व्यवस्था है, लेकिन एक kinase और संभावित substrates के साथ अपने संबंधों के जीव विज्ञान की जांच करने के लिए एक उपकरण. इस तरह के रूप में assays से डेटा अन्य दृष्टिकोण के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए कैसे एक kinase इन विट्रो में और एक सेलुलर संदर्भ में व्यवहार करता है की एक व्यापक तस्वीर प्राप्त करने के लिए. उदाहरण के लिए, इन विट्रो में एक ख्यात phosphorylated सब्सट्रेट मास स्पेक्ट्रोमेट्री से विश्लेषण किया जा सकता है संभव phosphosites है कि तब लक्षित mutagenesis (जैसे परिवर्तित. सेरीन या threonine फॉस्फेट alanine जैसे कोई भी phosphorylatable अवशेषों को स्वीकर्ता अवशेषों) से छेड़छाड़ किया जा सकता है कार्यात्मक जांच की पहचान phosphorylation पूर्व vivo के परिणाम.
इस तरह के रूप में एक में इन विट्रो परख प्रणाली से डेटा की व्याख्या में एक प्रमुख विचार eithe की संभावना हैr प्रकार मैं या प्रकार द्वितीय त्रुटियों (झूठी सकारात्मक या नकारात्मक झूठी). इस प्रणाली के न्यूनकारी प्रकृति दुर्भाग्य से यह दोनों के लिए disposes - पूर्व के मामले में, एक शुद्ध ख्यात सब्सट्रेट और कृत्रिम करीब निकटता में और उच्च एकाग्रता में शुद्ध kinase (सेलुलर परिवेश की तुलना) artefactual phosphorylation घटनाओं में परिणाम कर सकते हैं. इसके विपरीत, कई kinases सेल के संदर्भ में एक परिसर के भाग के रूप में कार्य है, और किसी दिए गए होते हैं सब्सट्रेट के phosphorylation के लिए सह कारकों की आवश्यकता है. जैसा कि ऊपर उल्लेख किया, एक ख्यात सब्सट्रेट की phosphorylation से एक सकारात्मक परिणाम के इन विट्रो परख प्रणाली में एक का उपयोग कर तो एक सेलुलर प्रणाली में परीक्षण किया जाना चाहिए करने के लिए परिणाम को मान्य करने के लिए, और एक नकारात्मक परिणाम सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए.
इस के प्रकाश में, यह जहाँ महत्वपूर्ण सकारात्मक और नकारात्मक दोनों नियंत्रण के लिए ब्याज की अपने kinase की गतिविधि का एक तुलनात्मक अध्ययन की अनुमति संभव है. एक सकारात्मक विवाद का चयन सावधानी सेएल है कि कि अपने ख्यात सब्सट्रेट phosphorylate की संभावना नहीं है एक नकारात्मक नियंत्रण के साथ साथ ब्याज की अपने प्रोटीन की दिशा में एक ज्ञात गतिविधि है, अत्यंत मूल्यवान है. LRRK2 के लिए एक उम्मीदवार नियंत्रण रिसेप्टर बातचीत 3 kinase, जो LRRK2 के kinase डोमेन के लिए एक निकट से संबंधित प्राथमिक अनुक्रम है, लेकिन एक बहुत अलग समग्र डोमेन 18 संरचना है. यह Invitrogen से पुनः संयोजक प्रोटीन के रूप में उपलब्ध है और हमारी प्रयोगशाला में एक मानक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है.
यह भी नोट किया जाना चाहिए कि LRRK2 के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फार्म प्रोटीन एन टर्मिनस अभाव है और Glutathione एस transferase और यह एक संभावित confounding कारक के रूप में ध्यान में रखा जाना चाहिए जब इस प्रोटीन के साथ kinase assays ले जाने के साथ टैग, के रूप में यह ज्ञात नहीं है क्या भूमिका LRRK2 के एन टर्मिनल इस प्रोटीन की सामान्य समारोह में निभा सकते हैं. अगर, उदाहरण के लिए, LRRK2 के एन टर्मिनल भाग है कि प्रोटीन में अनुपस्थित है इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाताLRRK2 के kinase डोमेन के लिए एक विशिष्ट सब्सट्रेट की भर्ती के लिए महत्वपूर्ण है तो इस के मनाया phosphorylation पर एक बड़ा असर पड़ेगा ने कहा कि इन विट्रो प्रणाली में सब्सट्रेट ऊपर वर्णित है.
इन निरंतर के साथ भी, तथापि, एक में इन विट्रो सेटिंग में इस प्रोटीन के व्यवहार की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में पार्किंसंस अनुसंधान में LRRK2 के जीव विज्ञान से जुड़ी महत्व इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता पर प्रकाश डाला गया.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखक एक पार्किंसंस ब्रिटेन रिसर्च फैलो (F1002 अनुदान). इस काम के हिस्से में वेलकम ट्रस्ट / MRC neurodegeneration पुरस्कार संयुक्त कॉल (WT089698) ब्रिटेन पार्किंसंस रोग कंसोर्टियम (UKPDC) जिसके सदस्य तंत्रिका विज्ञान के UCL संस्थान, शेफ़ील्ड विश्वविद्यालय और MRC प्रोटीन phosphorylation यूनिट में से हैं द्वारा समर्थित किया गया डंडी विश्वविद्यालय.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LRRK2 wild type | Invitrogen | PV4873 | |
| LRRK2 G2019S | Invitrogen | PV4881 | |
| LRRK2 D1994A | Invitrogen | PV6051 | |
| Kinase buffer | Cell Signaling Technology | 9802S | |
| MBP | Sigma-Aldrich | M1891 | |
| 32P g ATP | PerkinElmer, Inc. | BLU002X500UC | 500μCi, 30Ci /mMole |
| 4x LDS sample buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| 2-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Protein standards | Invitrogen | LC5800 | |
| MOPS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| Bis-tris acrylamide gel | Invitrogen | NP0321 | 4-12% 1mm 10well |
| PVDF membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | |
| Transfer buffer | Invitrogen | NP0006 | |
| Table 1. Reagents | |||
| Distilled and de-ionized water was used for all dilution steps | |||
| Geiger counter | Mini Instruments | ||
| SDS PAGE tank | Invitrogen | ||
| Transfer tank | Invitrogen | ||
| Heat blocks (2) | Eppendorf | ||
| Phosphor screen | GE Healthcare | X-ray film can be substituted | |
| Phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Exposure cassette | GE Healthcare | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Perspex shielding | |||
| 1.5ml tubes | VWR international | Screw top with O ring | |
| Table 2. Equipment | |||
References
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